椎间盘中结缔组织生长因子：对细胞基质数量的合成代谢作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前对于结缔组织生长因子同骨科相关疾病的研究并不多，自然对间盘范围内的研究就少之又少。
目的：通过研究结缔组织生长因子在退变间盘及其相关组织中的作用和机制，为间盘退行性变的生物治疗提供新的更有价值的借鉴。
方法：由第一作者应用计算机检索 PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)1997年1月至2014 年10月相关文献。在标题、摘要、关键词中以“intervertebral disc；CTGF；TGF-β；hypoxia；disc degeneration”或“椎间盘；结缔组织生长因子；转化生长因子β；低氧；间盘退变”为检索词进行检索。选择文章内容与结缔组织生长因子在退变间盘及其相关组织中的作用和机制有关者，同一领域文献则选择近期发表在权威杂志文章，最终选择 34 篇文献进行综述。
结果与结论：有关间盘的研究，许多体内和体外实验已经表明结缔组织生长因子具有刺激髓核细胞基质产量的合成代谢作用，其凭借对类似转化生长因子β和缺氧的调节及刺激，表明了转化生长因子β和结缔组织生长因子这一作用轴对细胞基质数量的重要性；而缺氧是对结缔组织生长因子作用的另一种调节，其主要凭借对细胞类型的控制以及依赖方式的表达来发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 结缔组织生长因子, 椎间盘, 转化生长因子β, 缺氧, 间盘退变

Abstract:

BACKGROUND: Because of the deficiency of researches on connective tissue growth factor associated with orthopedic diseases, very little attention has been paid to the studies on connective tissue growth factor in the intervertebral disc.
OBJECTIVE: Through exploring the role and mechanism of connective tissue growth factor in disc degeneration, to provide new evidence for biotherapy of disc degeneration.
METHODS: A computer-based search of PubMed and CNKI was performed by the first author to retrieve articles relevant to the effect and mechanism of connective tissue growth factor on degenerative disc and its related tissues published from January 1997 to October 2014. The keywords were “intervertebral disc; CTGF; TGF-β; hypoxia; disc degeneration” in Chinese and English, respectively, which appeared in the title, abstract or keywords. Articles published recently or in authoritative journals were preferred, and finally 34 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Recently in vivo and in vitro studies on the intervertebral disc have clearly demonstrated the anabolic role of connective tissue growth factor in stimulating matrix production from nucleus pulposus cells and revealed that the transforming growth factor β-connective tissue growth factor axis was of great importance to cellular matrix production via regulations and stimulations to transforming growth factor β and hypoxia, while the regulation of hypoxia for connective tissue growth factor was another in a specific cell and tissue manner.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Intervertebral Disk, Connective Tissue Growth Factor, Transforming Growth Factor beta

中图分类号:

R318

王东，王立春. 椎间盘中结缔组织生长因子：对细胞基质数量的合成代谢作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(15): 2410-2414.

Wang Dong, Wang Li-chun. Connective tissue growth factor in the intervertebral discs exerts an anabolic effect on the extracellular matrix[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(15): 2410-2414.

图/表（结果） 1

2.1 结缔组织生长因子概述及其生物学效应 由于结缔组织生长因子对细胞外基质的合成具有重要作用，因此在对椎间盘的立早基因结缔组织生长因子家族成员的研究中，对其研究较多^[1]。结缔组织生长因子有如下4个结构域：胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)结构域，C型血管假性血友病因子(VWC)结构域，血小板反应蛋白1(TSP-1)结构域以及含半胱氨酸的羧基端(CT)结构域。结缔组织生长因子凭借这4个结构域能够起到类似信号传感器或者调节器的作用，其与多种生长因子及细胞外基质蛋白相互配合，通过作用于细胞表面受体来对多种生物进程产生影响。结缔组织生长因子的很多功能都具有组织特异性；其既能够对细胞外基质的合成进行调节，也能促进血管的生成以及细胞的迁移、黏附、分化。

在脊椎动物发育到成熟的过程中，结缔组织生长因子被不同程度地表达，例如在梅克尔软骨、骨和间盘等骨组织中会被高度表达^[2]。早期的胚胎发育过程中可以发现，结缔组织生长因子在原始组织(体节、底板、脊索)以及起源于此的几个表达相对旺盛的成熟组织中被高度表达^[3]。Kawaki等^[4]凭借体外实验验证了结缔组织生长因子对软骨细胞表型起到保护作用，并且能够促进生长板中的软骨分化。Geisinger等^[5]的研究表明，结缔组织生长因子对成骨细胞的分化以及软骨内的成骨有促进作用，结缔组织生长因子可以在人体内将成骨细胞增殖、胶原蛋白沉积和矿化作用减少，在人体外将碱性磷酸酶，骨钙素水平降低。虽然有不少文章研究了结缔组织生长因子在其他组织中的功能和作用，但是对于结缔组织生长因子在间盘组织中的调节机制细节迄今为止依旧未被阐明。

2.2 间盘内结缔组织生长因子在发育过程中的表达与功能 椎间盘的结构比较复杂，而且属于多轴向活动性关节；其会分隔表面覆盖有软骨组织的相邻椎体，以支持一系列的肢体动作，同高生物学力量相适应^[6]。间盘的外周围绕的纤维软骨环，其由紧密填充的Ⅰ型胶原纤维所构成，Ⅰ型胶原纤维会嵌插到相邻的上下软骨终板及椎体中。内纤维环则由Ⅱ型胶原纤维、聚焦蛋白聚糖以及多功能蛋白聚糖构成。纤维环和软骨终板包围着含有丰富聚焦蛋白聚糖及胶体样的髓核。髓核中没有血管，只有极少量的细胞，因此髓核中的细胞存活于一个极度缺氧和高渗的微环境之中^[7]。完整的蛋白聚糖和胶原纤维支撑着间盘功能的正常运转，而间盘细胞的活性和维持基质稳定的能力敏感地受外界环境的刺激和诸如结缔组织生长因子等信号因子的影响。

如图1可以在处于发育过程中的E16.5转基因小鼠间盘明显地观察到结缔组织生长因子的表达^[8]。Huang等^[8]的研究表明，间盘组织中4 kb的结缔组织生长因子基因启动子的特异活性是相对稳定的。这证实了高等脊椎动物中，结缔组织生长因子在椎骨和间盘分节后起到了重要的作用。Erwin等^[9]研究发现，结缔组织生长因子对髓核细胞生产聚焦蛋白聚糖有促进作用。Sakai等^[10]的研究则显示，是脊索衍生出的所有髓核细胞。需要注意的是Tran等^[11]的体外实验，其实验结果也表明脊索细胞所分泌的结缔组织生长因子能够刺激脊索细胞生成聚焦蛋白聚糖。最近，Tran等^[12]的实验验证了结缔组织生长因子可以维持间盘组织基质成分的蛋白同化。出生后体内间盘结缔组织生长因子的稳定表达以及在结缔组织生长因子表达沉默的人髓核细胞外基质中^[13]，聚焦蛋白聚糖、Ⅰ型和Ⅱ型胶原的显著下降都表明结缔组织生长因子有益于维持基质的稳定^[12]。因此，针对间盘退变过程微环境的改变是如何对基质稳定、细胞功能、关键基因的表达和调节产生影响的研究显得至关重要。

2.3 结缔组织生长因子在间盘退变过程中的表达 相关研究表明，在椎间盘退变性疾病方面，退变的椎间盘大多会伴有血管新生，而且结缔组织生长因子在血管新生区域的表达也会显著增高，这个现象同间盘疼痛有一定的关系^[14]。Tran等^[12]依据结缔组织生长因子促进髓核细胞基质合成的体内外实验，指出在组织退行性变的情况下，结缔组织生长因子所扮演的角色是促进有限修复反应的蛋白同化因子。最新的研究证实，细胞因子和结缔组织生长因子在髓核细胞中构成了一个负反馈回路，细胞因子、白细胞介素1β以及肿瘤坏死因子α对结缔组织生长因子的表达有抑制作用，结缔组织生长因子反过来对白细胞介素1β的分解代谢活动也有抑制作用^[15]。Abbott等^[1]的研究则发现，在退变过程中微环境的变化可能会改变结缔组织生长因子和其他蛋白因子的相互作用，进而影响了细胞对结缔组织生长因子的反应。Liu等^[16]通过对腺病毒载体的应用进行了结缔组织生长因子转染兔椎间盘髓核细胞的体内外实验，对椎间盘细胞外基质的变化进行观察。试验结果表明，结缔组织生长因子不仅可以成功表达，而且具有生物学效应。Strass-burg等^[17]对人骨髓间充质干细胞和退变的人髓核细胞进行混合培养后发现结缔组织生长因子的表达明显上调，其上调的原因可能是由于干细胞向髓核样细胞分化的时候产生了结缔组织生长因子。王飞等^[18]通过体外实验证实了结缔组织生长因子不仅能够抑制大鼠腰椎终板细胞的凋亡，还能够增强细胞的活性，结缔组织生长因子在凋亡环境中能够使终板细胞Ⅱ型胶原、聚焦蛋白聚糖等基质的合成能力提升，并维持软骨细胞表型。在对细胞外基质的调节方面，生理量的结缔组织生长因子能够明显使细胞中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的基因的表达增加，使椎间盘结构维持正常，但是结缔组织生长因子的过量表达就会导致细胞外基质降解，组织发生纤维化改变^[19]。

2.3.1 转化生长因子β对结缔组织生长因子表达的调控 转化生长因子β是在很多细胞中对结缔组织生长因子表达进行调控的一个重要因子，例如髓核细胞^[20]。李楠等^[21]的研究显示，人类腰椎间盘组织中转化生长因子β1和结缔组织生长因子的表达含量与腰椎间盘退变的进展程度密切相关并且随着腰椎间盘退变程度的加重，两种因子的表达含量也随之增高。在经典的转化生长因子β信号转导通路中，转化生长因子β同Ⅰ型和Ⅱ型受体相结合，造成Smad2和Smad3磷酸化。这些活化的Smad同Smad4相结合，共同转移至细胞核，然后于细胞核中同靶基因启动子区的Smad结合性元件(SBEs)相结合。除此之外，在非经典的转化生长因子β信号转导通路中，以上过程同丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的活化有一定关联。

转化生长因子β介导结缔组织生长因子的重要顺式作用元件是SBE。其位于-173/-166 bp，在不少种类的细胞中对于转化生长因子β介导结缔组织生长因子都是必要的，例如髓核细胞^[22]。Tran等^[23]的研究结果显示，在髓核细胞中，启动子的活化必须基于Smad3同SBE的结合，并非Smad2同SBE的结合。除SBE外，转化生长因子β在髓核细胞中的诱导作用还需要-294/-286 bp处具有顺式作用的AP-1位点。同髓核细胞类似，瘢痕内成纤维细胞的血清反应性结缔组织生长因子表达同以上调节机制也有一定关系^[24]。

在很多组织中，转化生长因子β对结缔组织生长因子强烈的诱导作用都验证了一个结论，即结缔组织生长因子能够使转化生长因子β的下游效应得以加强。Nakerakanti等^[25]的研究表明，结缔组织生长因子有助于转化生长因子β诱导Smad1和ERK1/2的磷酸化，并非Smad3的磷酸化。单独结缔组织生长因子的激活在成骨细胞和髓核细胞中，对转化生长因子β作用的维持以及保持ERK信号通路的畅通有促进作用^[26]。结缔组织生长因子在肺上皮细胞中对骨形态发生蛋白4诱导的Smad1的磷酸化有抑制作用，可是其也能够促进转化生长因子β1诱导Smad2磷酸化，这就能说明结缔组织生长因子具有放大转化生长因子β信号效应的特异性^[27]。在软骨细胞中也存在这样的关系，因为软骨细胞的分裂增殖需要骨形态发生蛋白和结缔组织生长因子的共同作用才能实现^[28]。从转化生长因子β与结缔组织生长因子这个信号通路整体来看，结缔组织生长因子对转化生长因子β通路信号具有保护作用，反过来转化生长因子β也诱导了结缔组织生长因子的表达，二者之间是协同、互补的关系。

2.3.2 缺氧状态下结缔组织生长因子的表达 在多种细胞类型中发现的低氧张力调节结缔组织生长因子都是同间盘缺氧环境有关^[29]。缺氧调节结缔组织生长因子具有细胞种类的特异性和复杂性，在多数细胞中缺氧会使结缔组织生长因子的表达增加，而在少数细胞中缺氧则会使结缔组织生长因子的表达下降。在软骨肉瘤(HCS-2/8)细胞中，缺氧环境会调节结缔组织生长因子的表达水平，其中的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为一组同结缔组织生长因子的mRNA稳定相关的结合蛋白^[30]。凭借低氧诱导因子的作用，加强结缔组织生长因子对缺氧细胞特异性类型的调控，抑制结缔组织生长因子在近端肾小管上皮细胞的表达^[31]。Tran等^[12]的研究发现，在髓核细胞中缺氧会使结缔组织生长因子的转录减少，而且髓核细胞中缺氧和缺氧诱导因子1α调节结缔组织生长因子相对比较复杂。Tran等^[12]的研究证实转化生长因子β在缺氧条件下依旧可以对结缔组织生长因子的表达进行诱导，即使诱导量并不大。在脊椎动物中，位于结缔组织生长因子启动子的激素调节元件(HREs)说明缺氧调节既具备细胞的特异性，又具备物种的特异性。而且很多报道表明不少种类的细胞中，结缔组织生长因子会对缺氧诱导因子1α的表达和活动进行控制。该种调节同样具备细胞类型的特异性，在某些细胞中结缔组织生长因子会使缺氧诱导因子的活动加强，但是在有些细胞中则不然。例如，在HCS-2/8中，结缔组织生长因子在对缺氧诱导因子1αmRNA和蛋白进行诱导的同时提高了血管内皮生长因子的水平，这说明二者之间存在正反馈，该种关系有益于肿瘤的生存和稳定^[32]。在髓核细胞中通过重组人结缔组织生长因子进行治疗可以将缺氧诱导因子1α的转录减少，即减少反式激活区域(TAD)的活动，这说明结缔组织生长因子可能会对缺氧诱导因子1α同共同动力器官的相互作用造成干扰^[12]。

2.4 结缔组织生长因子同间盘生理与病理学相关的因子调节同研究的其他细胞类型相比较，结缔组织生长因子在软骨肉瘤细胞中的转录与其他几种因子的复杂调节有一定关系。Eguchi等^[33]的研究表明，在HCS-2/8中结缔组织生长因子不仅同基质稳态的维持息息相关，也能够负反馈调节基质的退化。除此之外，有研究显示在增殖和肥大的软骨生长盘中结缔组织生长因子的表达会受到SOX-9和β-catenin分别介导的特殊机制调节^[8]。可以发现，在这些软骨细胞的分化阶段，结缔组织生长因子的调节共同存在于鼠和人类相同的TCF/LEF基序之中。SOX-9在增殖的软骨细胞中有助于细胞表型的维持，是一种重要的转录因子，其同TCF/LEF基序相结合会抑制结缔组织生长因子的表达。当软骨细胞分化成肥大细胞表型时，β-catenin会同相同位点结合进而诱导结缔组织生长因子的表达。由于间盘中基质稳态的调节受到SOX-9和β-catenin的调节作用^[34]，因此对于髓核细胞中TCF/LEF生物关联性的检测具有重要的生物学意义。

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