吡咯喹啉醌促进软骨细胞增殖及抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现吡咯喹啉醌可以促进许旺细胞增殖及生长因子的分泌，但其对关节软骨或关节软骨细胞有何作用尚未见报道。
目的：验证吡咯喹啉醌对膝关节软骨细胞增殖及对白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡的影响，以探讨吡咯喹啉醌保护软骨细胞的作用机制。
方法：在无菌环境下消化得到1月龄新西兰白兔膝关节软骨细胞，培养并传代，第2代软骨细胞用于实验。细胞贴壁后用吡咯喹啉醌浓度为0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 μmol/L的无血清培养基分别培养软骨细胞48 h，采用MTT法检测细胞的增殖活力；培养30 h，采用流式细胞术测细胞周期。细胞贴壁后用不同浓度吡咯喹啉醌预处理软骨细胞24 h，然后加入白细胞介素1β作用15 h后，采用流式细胞术测细胞凋亡率。
结果与结论：吡咯喹啉醌能明显提高软骨细胞的增殖活力、S期，G2/M比例和细胞增殖指数(P < 0.05)，且在吡咯喹啉醌浓度为12.5 μmol/L和25.0 μmol/L时作用最强。吡咯喹啉醌能明显抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞早期凋亡和晚期凋亡(P < 0.05)，在吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L时作用最明显。结果表明吡咯喹啉醌可以促进膝关节软骨细胞的分裂与增殖，对白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡有抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨细胞, 吡咯喹啉醌, 流式细胞术, 细胞周期, 细胞凋亡, 白细胞介素1β

Abstract:

BACKGROUND: Pyrroloquinoline quinone is found to accelerate Schwann cell proliferation and growth factor secretion, but there is no report addressing its role in articular cartilage and chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the role of pyrroloquinoline quinone in chondrocyte proliferation and interleukin-1β-induced chondrocyte apoptosis in the articular cartilage of knee joints and to verify the protective mechanism involved.
METHODS: Chondrocytes were isolated from New Zealand white rabbits (1 month of age), digested under aseptic conditions, and cultured in DMEM/F12 in the presence of 10% fetal bovine serum to allow for proliferation until passage 2. Adherent chondrocytes were cultured in serum-free DMEM/F12 medium with 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 and 100.0 μmol/L pyrroloquinoline quinone, separately. Proliferation activity was determined by MTT at 48 hours of pyrroloquinoline quinone administration. Cell cycle was determined by flow cytometry at 30 hours after pyrroloquinoline quinone administration. Apoptosis was determined by flow cytometry following 24 hours of pyrroloquinoline quinone pretreatment and 15 hours of interleukin-1β induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Pyrroloquinoline quinone enhanced chondrocyte proliferation activity, increased percentage of S phase and G2/M phase in a dose dependent manner and reached the peak when the concentration of pyrroloquinoline quinone was 12.5-25.0 μmol/L (P < 0.05). Pyrroloquinoline quinone also inhibited interleukin-1β-induced chondrocyte apoptosis in early and late stage, and 25.0 μmol/L pyrroloquinoline quinone had the best effects (P < 0.05). These findings suggest pyrroloquinoline quinone can promote chondrocyte division and proliferation, and protect the cells from interleukin-1β-induced apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Chondrocytes, Interleukin-1beta, Apoptosis

中图分类号:

R318

张振江，吕国枫. 吡咯喹啉醌促进软骨细胞增殖及抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(15): 2305-2309.

Zhang Zhen-jiang, Lv Guo-feng. Pyrroloquinoline quinone promotes chondrocyte proliferation and inhibits interleukin-1beta-induced chondrocyte apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(15): 2305-2309.

图/表（结果） 4

2.1 软骨细胞的形态学观察及鉴定结果 倒置相差显微镜下观察，原代软骨细胞一两天贴壁，细胞呈现三角形、多角形或不规则形(图1A)，当软骨细胞生长连接成片时可见呈现“铺路石样”。软骨细胞分泌特异性的酸性糖胺多糖，酸性糖胺多糖可被甲苯胺蓝染成蓝紫色，实验中所用的第2代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后软骨细胞均质蓝染，细胞外基质染成蓝紫色(图1B)，由此证实了本实验所用细胞为软骨细胞。

2.2 不同浓度吡咯喹啉醌对软骨细胞增殖活力的影响 MTT比色法是一种常规用于检测细胞增殖活力的实验方法，MTT 实验结果显示，与对照组相比软骨细胞增殖活力随吡咯喹啉醌浓度的增加而逐渐升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，在吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L时达到最大值，50.0 μmol/L和100.0 μmol/L时细胞增殖活力下降。吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L组增殖活力与0，6.25)，50.0)，100.0 μmol/L组相比差异有显著性学意义(P < 0.05)，与12.5 μmol/L组相比差异无显著性意义(P=0.08)。见表1。

2.3 不同浓度吡咯喹啉醌对软骨细胞周期的影响 软骨细胞单染后经流式细胞仪检测结果显示，随吡咯喹啉醌浓度的增加，与0 μmol/L组比较，软骨细胞G₀/G的比例降低，S期，G₂/M比例和细胞增殖指数(PI)明显升高，在吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L时G₀/G₁的比例降到最低，S期，G₂/M比例和细胞增殖指数升高到最大值。吡咯喹啉醌浓度为0，6.25，50.0，100.0 μmol/L组分别与25.0 μmol/L组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，12.5 μmol/L组与25.0 μmol/L组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞周期的变化与MTT的结果相吻合。见表2。

2.4 不同浓度吡咯喹啉醌对抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡的影响 通过Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测结果显示，吡咯喹啉醌浓度为0 μmol/L加白细胞介素1β组与对照组比较，软骨细胞早期和晚期凋亡率明显增加(P < 0.01)。吡咯喹啉醌浓度为6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 μmol/L组，分别与吡咯喹啉醌浓度为0 μmol/L组相比，对白细胞介素1β介导的软骨细胞早期和晚期凋亡都有明显的抑制作用，差异有显著性意义(P < 0.05)。吡咯喹啉醌浓度为 0，6.25，12.5，50.0，100.0 μmol/L组分别与25.0 μmol/L组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。由此可见吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L时对白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡有明显抑制作用。见表3，图2。

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引言

骨关节炎是指以关节软骨受损，软骨下骨和关节边缘骨赘形成相关的一组特异性的疾病，最常累及膝、髋等关节，以关节软骨变性为特征。关节软骨主要是由少量软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞的营养主要靠滑膜分泌的滑液供给，软骨损伤后，自我修复能力很弱，当关节软骨缺损超过一定面积的全层软骨缺损通常不能自行修复。白细胞介素1β在骨关节炎病情进展中通过多种致病途径诱导软骨细胞凋亡和抑制软骨细胞的生长，在骨关节炎发病机制中起到关键性作用^[1]。

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)化学式C₁₄H₆N₂O₈，摩尔质量330.206 g/mol，密度1.963 g/cm³，是继黄素核苷酸(FMN、 FAD)和烟酰胺核苷酸(MAD、NADP)之后发现的第3种辅酶，是一种阴离子水溶性化合物，几乎存在于所有生物组织中，可可粉中含量最高，母乳次之^[2]。

吡咯喹啉醌具有一些重要的生物活性和功能，如刺激微生物、植物发育和人体细胞生长^[3-4]，是动物生长、发育和繁殖所必需的营养因子；清除体内过多的自由基来保护机体；参与电子的传递；刺激神经生长因子的合成和提供神经保护作用^[5-6]。也有报道发现，吡咯喹啉醌对海马神经元有促增殖的作用^[7]，并能够通过激活PI3K/Akt信号通路来拮抗谷氨酸诱导的海马神经元凋亡^[8]。贺斌等^[9]在许旺细胞培养过程中施以吡咯喹啉醌，结果发现其可以促进许旺细胞增殖及生长因子的分泌。但吡咯喹啉醌对关节软骨或关节软骨细胞有何作用尚未见报道。

实验通过MTT比色法和流式细胞术观察了不同浓度吡咯喹啉醌对体外培养的兔膝关节软骨细胞细胞活力、细胞周期及抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡的影响，以探讨吡咯喹啉醌保护软骨细胞的作用机制。

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材料方法

设计：细胞学对比观察实验

时间及地点：实验于2013年3月至2014年2月在大连医科大学科研中心完成。

材料：

实验动物：1月龄新西兰大白兔，动物由大连医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(辽) 2013-0003。

实验方法：

软骨细胞细胞的获取与培养：原代软骨细胞取自1月龄新西兰大白兔。无菌条件下将兔膝关节暴露关节面，用PBS清洗关节面，用手术刀刮下软骨片，放于盛PBS的培养皿中，将软骨片切得尽量小，最好切成泥状，用PBS清洗2遍，加入4倍体积的0.2%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃恒温水浴震荡5 h，待肉眼观查离心管中软骨组织基本消化完全后从水浴锅中取出，用200目钢网过滤，将滤液离心，900 r/min，5 min，吸弃上清，用含体积分数10%FBS及双抗(1x10⁵U/L青霉素，100 mg/L链霉素)的DMEM/F-12培养液重悬软骨细胞，按5×10⁴ 个/cm²接种于培养皿中，放于37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中，3 d后换液，弃去不贴壁的细胞，之后每2 d换1次液，待细胞培养至90%融合时进行传代，第2代对数生长期细胞用于实验。

软骨细胞的鉴定：取第2代软骨细胞接种于盛有载玻片的6孔板里爬片，软骨细胞贴壁后，PBS清洗5 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2次，每次5min，用1%甲苯胺蓝溶液染色30 min，经蒸馏水漂洗后于倒置相差显微镜下进行鉴定观察。

MTT比色法测细胞增殖：取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，铺入96孔板中，每孔0.1 mL，共设6组，每组5个复孔，培养24 h使细胞贴壁。弃上清，用含吡咯喹啉醌浓度为0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 μmol/L的无血清培养基继续培养48 h后，弃掉上清，加入MTT液(2.5 g/L)，每孔50 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490 nm处测得吸光度(A)值。

细胞周期的检测：PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂(RNase A)将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以了解不同细胞周期各细胞亚群的比例。

按软骨细胞5×10⁴个/cm²的密度接种于6个100 mm培养皿中，24 h贴壁后，弃上清，分别加用吡咯喹啉醌浓度为0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 μmol/L的无血清培养基继续培养30 h，收集细胞，用PBS洗涤1次(900 r/min，5 min)，收集并调整细胞浓度为1×10⁹L^-1，取1 mL单细胞悬液离心去上清，加入体积分数70%冷乙醇500 μL固定，4 ℃过夜，PBS洗去固定液，加100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL Propidium Iodide染色混匀，4 ℃避光30 min，上流式细胞仪检测细胞周期，计算增殖指数(PI(%)=(S+G₂/M)/ (G₀/G₁+S+G₂/M)×100%)。重复试验3次。

细胞凋亡的检测：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。PI能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

在10个100 mm培养皿中按软骨细胞5×10⁴个/cm²的密度接种，24 h贴壁后，弃上清，分别加用含吡咯喹啉醌0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 μmol/L的无血清培养基培养24 h后，其中吡咯喹啉醌浓度为0 μmol/L的一个培养皿中不加白细胞介素1β，作为对照组，其余9个培养皿中分别加入终浓度为10 μg/L的白细胞介素1β，继续作用15 h。收集上清液，与用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化收集的细胞悬液混合，离心900 r/min，5 min，预冷PBS洗涤细胞2次，加入200 μL的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC(AV)混匀，继续加入5 μL Propidium Iodide(PI)混匀，避光、室温孵育15 min，加入300 μL Binding Buffer轻轻混匀。同时设置阴性对照组，只加AV组和只加PI组，于1 h内上流式细胞仪测细胞凋亡。实验重复3次。

主要观察指标：①软骨细胞的形态学观察及鉴定结果。②不同浓度吡咯喹啉醌对软骨细胞增殖活力的影响。③不同浓度吡咯喹啉醌对软骨细胞周期的影响。④不同浓度吡咯喹啉醌对抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡的影响。

统计学分析：数据用x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件分析，组间计量资料采用方差分析，MTT实验采用完全随机设计方差分析，检测细胞周期和细胞凋亡采用随机区组设计方差分析，显著性水平α=0.05。

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讨论

有资料显示，线粒体在调节细胞生长和分化中起重要的作用^[10]，呼吸链的缺乏会影响与细胞周期相关的蛋白质的表达以至降低细胞增殖速率^[11]。细菌的吡咯喹啉醌和醌蛋白在不消耗能量的条件下直接参与底物的氧化反应，形成截短的呼吸链从而产生能量，吡咯喹啉醌能通过增加线粒体mtDNA的含量和细胞色素酶C的活力来影响生物体的代谢^[12]。吡咯喹啉醌可以保护大鼠线粒体活性免受氧化应激的损伤，阻止线粒体内脂质过氧化和氧化损伤引起的线粒体呼吸链失活^[6]。在培养人成纤维细胞时发现，低浓度的吡咯喹啉醌能刺激细胞DNA的合成，并能显著增加细胞的密度^[13]。结合软骨细胞MTT实验结果和吡咯喹啉醌作用下软骨细胞S期，G₂/M比例和细胞增殖指数的升高推测吡咯喹啉醌可能具有似生长因子的作用，通过影响细胞的代谢速率而影响软骨细胞的分裂与增殖的。

体外培养及在体实验表明，因受创伤、自由基等刺激而激活的软骨细胞能合成和分泌白细胞介素1β，并诱导软骨细胞膜上受体高表达。软骨细胞膜上的受体与白细胞介素1β结合，通过信息传递系统将病变的信息输送到细胞内，从而干扰软骨细胞正常代谢活动，如改变软骨细胞正常的结构和功能、降解软骨细胞基质、促进软骨细胞凋亡的发生和参与滑膜炎性病变及影响骨代谢，对骨关节炎的发生和发展起着重要的作用。

吡咯喹啉醌参与DNA损伤修复的信号转导，并选择性诱导周质蛋白激酶的活性，使宿主菌具有抗氧化压力的能力，并能保护宿主不受DNA损伤剂的损伤^[14-15]。在保护心肌细胞方面，吡咯喹啉醌可以清除活性氧，诱导产生其他的抗氧化酶，在一定程度上保护DNA和蛋白质等生物分子免受氧化的损害^[16]。此外，吡咯喹啉醌基因工程菌对氧化应激反应具有较高耐受力，而且具有较高的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力，推测吡咯喹啉醌不仅可以直接清除活性氧，同时具有诱导其他抗氧化酶的产生的作用^[17]。另外吡咯喹啉醌可以防止氧化应激相关的细胞损伤，吡咯喹啉醌被视为具有抗氧化功能^[18]。

吡咯喹啉醌在缺血缺氧的动物模型中亦发挥神经保护作用^[19]。有报道，吡咯喹啉醌能够阻止Aβ25-35作用下的SH-SY5Y细胞内活性氧过量产生^[20]；可以有效清除过氧化物，它的效果优于常用的抗氧化剂α-生育酚和抗坏血酸^[17]。吡咯喹啉醌与其他活性氧清除剂如吡咯和吲哚类衍生物的结构相比，表现出更高活性的电子密度^[17]，表明吡咯喹啉醌是一种更强的抗氧化剂。吡咯喹啉醌通过单电子转移机制直接完成中和活性氧的作用，形成的复合物吡咯喹啉醌- OH无氧化性，这种特性可能是使它成为强大的抗氧化剂的重要原因，同时也说明了吡咯喹啉醌的抗氧化作用与清除活性氧的作用密切相关。

白细胞介素1β是骨关节炎病变进展中破坏软骨细胞代谢平衡的主要细胞因子之一，能促使软骨细胞发生凋亡，其作用机制有一氧化氮途径，活性氧途径和MAPK途径等。本实验中吡咯喹啉醌浓度都为0 μmol/L的两组中加白细胞介素1β组软骨细胞凋亡率增加，不同浓度吡咯喹啉醌对白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡有较强抑制作用，且在吡咯喹啉醌浓度为25.0 μmol/L时抑制作用最强。其发挥的作用机制可能就是吡咯喹啉醌参与DNA损伤修复的信号转导，并选择性诱导周质蛋白激酶的活性，同时清除活性氧，并诱导产生其他的抗氧化酶来实现的。

关节软骨损伤是人类所面临的主要运动性疾病之一，软骨组织自愈能力非常有限，治疗比较困难，组织工程修复关节软骨缺损给治疗关节软骨损伤提供了一种新的方法，但组织工程所需的软骨细胞要在体外进行扩增，由于生长环境的改变，软骨细胞增殖活力弱，且容易发生凋亡，如何在体外使软骨细胞快速增殖，抑制软骨细胞凋亡是组织工程修复关节软骨缺损所面临的重要问题。本研究中作者发现，吡咯喹啉醌在一定浓度范围内对体外培养的软骨细胞有明显的促进细胞分裂和增殖，并可抑制白细胞介素1β介导的软骨细胞凋亡，因此吡咯喹啉醌可以作为一种营养因子和保护剂为临床开展软骨细胞工程化培养提供支持。

本实验也存在不足，实验是对体外培养的关节软骨细胞进行的研究，尚未对动物进行体内实验，因此为明确吡咯喹啉醌在骨关节炎中的详细作用机制及调节机制还需要做进一步的研究。

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