抵抗素刺激软骨细胞趋化因子CCL3及CCL4基因表达及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (15): 2297-2304.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.001

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抵抗素刺激软骨细胞趋化因子CCL3及CCL4基因表达及机制

张紫机，康焱，杨子波，侯昌禾，黄广鑫，陈蔚深，盛璞义，何爱珊，傅明，廖威明，张志奇

中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080

修回日期:2015-03-17 出版日期:2015-04-09 发布日期:2015-04-09
通讯作者: 张志奇，博士，主治医师，中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080
作者简介:张紫机，男，1984年生，广东省河源市人，汉族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事关节外科、软骨修复的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171709，81301558，81371941，81201388)；教育部高等学校博士点基金新教师类资助项目(20130171120074)；广东省自然科学基金博士启动项目(S2013040016269)

Resisin stimulates the expression of CCL3 and CCL4 in chondrocytes

Zhang Zi-ji, Kang Yan, Yang Zi-bo, Hou Chang-he, Huang Guang-xin, Chen Wei-shen, Sheng Pu-yi, He Ai-shan, Fu Ming, Liao Wei-ming, Zhang Zhi-qi

Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2015-03-17 Online:2015-04-09 Published:2015-04-09
Contact: Zhang Zhi-qi, M.D., Attending physician, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Zhang Zi-ji, M.D., Attending physician, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171709, 81301558, 81371941, 81201388; the National Research Foundation for the Doctoral Program of Higher Education, No. 20130171120074; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040016269

摘要/Abstract

摘要：

背景：既往研究表明抵抗素可刺激软骨细胞产生大量趋化因子，在炎症性关节病变中具重要作用，但具体作用机制未明。
目的：进一步探讨抵抗素刺激软骨细胞趋化因子CCL3及CCL4基因表达上调的机制。
方法：培养人源性软骨细胞，T/C-28a2细胞及ATDC5细胞，采用qPCR检测抵抗素刺激趋化因子基因的作用，C/EBPβ表达，核因子κB亚型及软骨特异性miRNAs。给予核因子κB抑制剂(IKK-NBD)和C/EBPβ抑制剂(SB303580)，对C/EBPβ 及核因子κB的共同调节作用进行检测。在给予抵抗素刺激或无抵抗素刺激时分别进行亚细胞结构定位检测。
结果与结论：①抵抗素可非依赖性上调趋化因子基因表达。②软骨细胞对抵抗素刺激应答具有非严格细胞特异性，通过C/EBPβ抑制剂、核因子κB及一些软骨细胞特异性miRNAs，可对趋化因子基因表达进行联合调控。③一过性核因子κB活性增高可增强C/EBPβ活性，且两个转录因子对趋化因子基因CCL3及CCL4的作用均为非依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 抵抗素, 软骨细胞, 趋化因子, CCL3, CCL4, 转录调控, C/EBPβ, 核因子κB, 转录后调控, miRNAs, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have indicated that resistin stimulates a large set of chemokines in chondrocytes that are known to be important in inflammatory joint lesions.
OBJECTIVE: To further investigate the mechanism of co-regulation roles of transcription and post-transcription in the up-regulation of two chemokine genes CCL3 and CCL4 in chondrocytes in response to resistin.
METHODS: Human chondrocytes, T/C-28a2 and ATDC5 cells were cultured. The function of resistin on the chemokine genes, and the expression of C/EBPβ, nuclear factor-κB isoforms and chondrogenic specific miRNAs were tested by qPCR. The co-regulation of C/EBPβ and nuclear factor-κB was investigated by nuclear factor-κB inhibitor (IKK-NBD) and C/EBPβ inhibitor (SB303580) treatments, and subcellular localization was detected with or without resistin stimulation.
RESULTS AND CONCLUSION: Resistin could increase the expression of chemokine genes independently. Chondrocytes reacted in a non-restrictedly cell-specific manner to resistin; C/EBPβ inhibitor, nuclear factor-κB and some chondrogenic specific miRNAs in a combinatorial manner regulated chemokine gene expression. The activity of C/EBPβ was augmented by a transient increase in activity of nuclear factor-κB, and both transcription factors acted independently on the chemokine genes, CCL3 and CCL4.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Chondrocytes, Chemotactic Factors, NF-kappa B

中图分类号:

R318

张紫机，康焱，杨子波，侯昌禾，黄广鑫，陈蔚深，盛璞义，何爱珊，傅明，廖威明，张志奇. 抵抗素刺激软骨细胞趋化因子CCL3及CCL4基因表达及机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(15): 2297-2304.

Zhang Zi-ji, Kang Yan, Yang Zi-bo, Hou Chang-he, Huang Guang-xin, Chen Wei-shen, Sheng Pu-yi, He Ai-shan, Fu Ming, Liao Wei-ming, Zhang Zhi-qi. Resisin stimulates the expression of CCL3 and CCL4 in chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(15): 2297-2304.

图/表（结果） 3

2.1 抵抗素可非依赖性刺激正常软骨细胞趋化因子基因表达 作者已经报道了正常成人和骨关节炎患者软骨组织受到抵抗素或白细胞介素1β刺激后产生大量趋化因子的表达上调，且抵抗素可刺激白细胞介素1β表达^[8^，^13-14]。在本实验中，证明了即便给予有效白细胞介素1受体拮抗剂，重组人白细胞介素1ra(图1A)，抵抗素刺激仍然可诱导人关节软骨细胞中细胞因子和趋化因子基因表达显著上调(图1B)，进一步证实抵抗素发挥作用不依赖白细胞介素1刺激。2.2 抵抗素刺激软骨细胞 C/EBPβ表达以往的计算分析和C/EBPβ共转染提示C/EBPβ参与抵抗素诱导的趋化因子基因表达上调^[14]。COL2A1 基因下调及C/EBPβ上调显示剂量依赖性反应(图2A)。当给予细胞100 μg/L抵抗素刺激超过24 h，C/EBPβ mRNA表达水平逐渐增高达约3倍(图2B)。C/EBPβ在24 h内抑制人软骨细胞Ⅲ型胶原mRNA表达低至约60%，与预期相符(图2B)，在大鼠软骨肉瘤细胞及人关节软骨细胞等以往研究也得到证实^{[8，13-14，29]}。

2.3 核因子κB参与调控抵抗素诱导的软骨细胞趋化因子基因表达上调结果 鉴于有研究表明核因子κB转录复合物通过核因子κB及C/EBPβ共同转染及抑制IKK-NBD来参与抵抗素诱导的多细胞因子和趋化因子基因表达上调，实验对C/EBPβ及核因子κB的相对作用进行探讨。对正常人关节软骨细胞中的核因子κB进行检测。给予不同剂量和时间抵抗素刺激软骨细胞，并且检测相应的核因子κB1(p50)，核因子κB2(p52)，RelA(p65)，c-Rel，RelB，IκBα mRNAs水平。核因子κB亚型表达对抵抗素刺激存在剂量依赖性应答(图3A)。核因子κB亚型迅速增加，但在4 h后降低(图3B)，其药动学与以往报道采用pNF-kappaB荧光素酶报告基因检测抵抗素刺激24 h对核因子κB作用的结果一致^[8]。细胞中，与C/EBPβ浓度相比，核因子κB亚型浓度更低。在人骨细胞中，C/EBPβ的?C均值为1.73，相比核因子κB1低(5.33)，而核因子κB2(5.46)，RelA(18.23)，c-Rel(6.89)及RelB(7.04)。然而，这些研究提示软骨细胞核因子κB亚基可能对抵抗素刺激产生应答。p50，p52及c-Rel的相对增高值最大。因此，上述结果提示核因子κB参与调节趋化因子表达，尤其在刺激4-8 h时。

2.4 抵抗素刺激软骨形成期ATDC5细胞miRNAs表达 ATDC5细胞为小鼠胚胎癌株，体外可成软骨分化，研究已经证实调控其成软骨分化的已知标记与在体相似^[30]。给予不同剂量和时间的抵抗素刺激ATDC5细胞，探讨软骨形成和骨关节炎软骨组织中关键miRNAs(miR-455-3p，miR-92a及miR-381)水平，确定抵抗素诱导的转录后基因调节机制。所测miRNAs对抵抗素产生剂量依赖性应答(图4A)。miR-92a显示最高的相对增高值。miR-381及miR-455-3p在第1h迅速增高，但是4 h后下降(图4B)，这与作者以往报道的核因子κB药动学一致^[8]。这些研究提示miRNAs可能特异表达于抵抗素刺激ATDC5细胞软骨形成。因此，这些结果表明在给予抵抗素刺激，尤其是1-4 h时，miRNAs可能参与调控趋化因子表达。所以，这些miRNAs参与抵抗素诱导ATDC5细胞转录后调控机制。

2.5 C/EBPβ及核因子κB共同上调抵抗素诱导的人软骨细胞CCL3及CCL4 表达 以前结果显示C/EBPβ及核因子κB可导致CCL3及CCL4上调^[14]。为进一步探讨C/EBPβ及核因子κB作用于CCL3及CCL4的具体机制，对转录因子C/EBPβ及核因子κB分别抑制和同时抑制后的效果进行检测。SB303580为抑制p38MAPK的C/EBPβ抑制剂^[31-32]， IKK-NBD为核因子κB特异性抑制剂，在同时给予两抑制剂时，给予抵抗素刺激，CCL3和CCL4表达降低，差异有显著性意义(图5A)。IKK-NBD及SB303580联合干预进一步降低CCL3及CCL4 mRNA表达，差异有显著性意义(图5A)。

根据计算数据评估显示CCL3(-1395)及CCL4(-1281)构建含很多可能C/EBPβ及核因子κB候选结合位点^[14]。为证实两转录因子都起作用，在抑制转录因子后检测CCL3(-1395)及 CCL4(-1281)启动子活性。结果显示给予两转录因子抑制剂后CCL3及CCL4启动子活性显著下降，且IKK-NBD及SB303580联合促进CCL3及CCL4启动子活性下降，差异均有显著性意义(图5B)。

2.6 C/EBPβ及核因子κB免疫组织化学检测结果 生化实验证明CCL3及CCL4的调节与核因子κB早期反应一致，且C/EBPβ应答持续增加。为验证这个结论，采用免疫组织化学对不同时间转录因子的表达进行定位检测(图6)。图6显示给予抵抗素刺激后用双重免疫组织化学C/EBPβ及c-Rel抗体进行检测。在0 h时，c-Rel定位表达在胞浆，随后在4 h时定位表达在细胞核，24 h后表达显著减弱。C/EBPβ在给药开始有表达，4 h和24 h后表达均上调。

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引言

抵抗素为一种脂肪因子，在类风湿性关节炎或骨关节炎患者及受损滑膜关节中均有表达^[1-4]。血浆抵抗素水平与红细胞沉降率和C-反应蛋白显著相关^[3]。抵抗素为富含半胱氨酸的相对分子质量12 500的多肽，不仅在人脂肪细胞中表达，在巨噬细胞中也大量表达^[5-6]。抵抗素可上调白细胞介素1、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α，在类风湿性关节炎患者的血标本及关节滑膜液中均有表达，关节腔内注射抵抗素可诱发健康大鼠的关节炎^[7]。尽管抵抗素的多方面生物学效应和调节作用存在争议，以往有研究表明抵抗素可刺激软骨细胞产生大量趋化因子，这些趋化因子在包括类风湿性关节炎和骨关节炎等炎症反应中具有重要作用^[8]。

趋化因子可调节炎症反应，在包括类风湿性关节炎和骨关节炎等炎症反应中具有重要作用^[9-11]。趋化因子为特异性调节细胞间趋化作用的经典细胞因子，其中2个主要亚类保留了半胱氨酸残留基[相邻(CC)或由一个氨基酸隔开(CXC)]^[12]。作者研究表明促炎细胞因子白细胞介素1β和抵抗素可上调正常成人和骨关节炎患者软骨中的大量趋化因子基因表达^[8^，^13]，提示广泛上调的趋化因子对软骨细胞和其他相关关节组织具有显著影响，因此考虑其参与骨关节炎的病理生理。

以往报告抵抗素可10倍上调人关节软骨细胞中白细胞介素1β、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL5、CCL8、CCL20、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6，及CXCL8(白细胞介素8)表达^[8]。对共同调节基因进行计算分析，确定核因子κB，C/EBPβ及肌细胞增强结合因子(MEF-3)为候选调控转录的调控因子。作者研究表明C/EBPβ及核因子κB与白细胞介素1β介导的软骨细胞趋化因子基因表达上调相关^[14]。此外，还发现C/EBPβ，核因子κB及mRNA稳定性参与抵抗素诱导的人软骨细胞趋化因子表达上调，而且在与白细胞介素1β类似的短暂模式中抵抗素在转录水平和转录后水平均上调了趋化因子表达^[13]。实验给予抵抗素刺激软骨细胞对趋化因子的转录后调控进行进一步研究，也有其他学者用成纤维细胞研究^[15]。microRNAs(miRNAs)作为软骨细胞代谢转录后水平的重要调节因子，主要依赖转录因子，通过结合目标基因发挥调节作用^[16-18]。

miRNAs为一类短的(-22 nt)，非编码，单链RNA分子，在包括骨组织和软骨组织发育的广泛生物和组织类型的分化和发展中具有重要作用^[17，19-23]。miRNAs可通过结合目的mRNAs的3-非编码区(UTR)的不完美补充序列，导致翻译阻遏，发挥基因沉默的调节作用。以往的研究识别了一组对间质干细胞的软骨生成起重要调节作用的miRNAs及其靶基因^[24]。作者前期研究通过基因芯片筛查人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中的miRNA变化，发现miR-455-3p，miR-92a及miR-381在多个样本中的成软骨诱导前后均有超过2倍的差异性表达，属于软骨相关性miRNAs，可能在软骨细胞的分化及退变过程中参与转录后调控^[24]。本实验对转录水平C/EBPβ及核因子κB联合调节和转录后水平miRNAs调节抵抗素诱导软骨细胞趋化因子基因CCL3(巨细胞炎症反应蛋白1α，MIP-1α)和CCL4 (MIP-1β)表达上调的作用机制进行探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：2011年1月至2013年12月在中山大学医学院公共实验室、美国华盛顿大学圣路易斯分校中心实验室完成。

实验方法：

细胞培养：①人源软骨细胞培养自全关节置换或膝关节以上截肢术中关节软骨组织，已获患者知情同意且通过华盛顿大学和中山大学人类研究审查委员会许可(IRB No. 05-0279 and 2011-029)。软骨细胞分离参考以往发表文献步骤^[13]，细胞在含体积分数10%胎牛血清，50 mg/L抗坏血酸，50 U/mL 青霉素和50 mg/L 链霉素的DMEM/F12培养基中培养，种板密度2.5×10⁵/cm²。②T/C-28a2人软骨细胞株培养条件与人关节软骨细胞相同。细胞静置24 h，随后按不同浓度(0，100，500 μg/L)和不同时间(0，1，4，8，24 h)给予抵抗素刺激。抵抗素溶于灭菌水。③ATDC5细胞采用含5%胎牛血清，2 mmol/L 谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，10 mg/L人转铁蛋白，及5 μg/L亚硒酸钠的1∶1 DMEM/Ham’s F-12混合培养基在37 ℃含体积分数5%CO₂的孵箱培养。ATDC5细胞在无血清含体积分数1%胎牛血清培养基中孵育24 h，然后换无胎牛血清培养基进行实验，给予不同时间和浓度的人抵抗素孵育刺激。

RNA分离和实时定量PCR：按生产商(Qiagen)操作说明，采用脱氧核糖核酸酶I处理的RNeasy Mini Kit提取人源关节软骨细胞，T/C-28细胞及ATDC5细胞中的总RNA。总RNA(1 μg)通过SuperScript^TM Ⅱ反转录酶反转录合成cDNA。随后，cDNA用于实时定量PCR(qPCR)。实时定量PCR在含10 μL的SYBR Green PCR Master Mix，2.5 μL cDNA，200 nmol/L引物，共20 μL的总反应体系中进行，检测使用7300实时PCR系统(Applied Biosystems)，实验重复3个附孔。针对每个基因选择最优qPCR引物，实时PCR系统检测解离曲线。引物设计参数包括引物大小18-21 bp，产物大小80-150 bp，引物退火温度为59-61 ℃，引物 GC含量为45%-55%。结果用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)校正。引物序列总结见表1^[8^，^14]。检测每个样本GAPDH和目标基因的循环阈值(Ct)，用χ= 2^-??Ct公式计算相对转录水平，??Ct= ?处理-?Cand?处理=Ct处理- CtGAPDH；?C=Ct对照-CtGAPDH。

质粒构建：用PCR进行一系列 CCL3和CCL4 启动子 5’-缺失构建，随后用pGL2-CCL3(-1 972/+75)及pGL3- CCL4(-1 281/+12)亚克隆为pGL3-基础载体，详见上述^[25-26]。CCL3及CCL4启动子构建，C/EBPβ及IkappaB激酶2(IKK2)表达载体，及pNF-κB萤光素酶报告基因来自：人pGL2-CCL3(-1 972/+75)来自匹兹堡大学Dr.G.David Roodman^[25]；人pGL3-CCL4(-1 281/+12)来自台北阳明大学Dr.Sheau-FarnYeh^[26]；pCDNA3载体中的人IKK2和pNF-κB萤光素酶报告基因来自华盛顿大学Dr.Yousef Abu-Amer^[27]；pCDNA3载体的人C/EBP-全长来自华盛顿大学Dr.Erika Crouch^[28]。从相应C/EBP表达载体中切除cDNAs，获得空表达载体^[29]。反义引物含HindIII限制位点适应因子，可协助扩增片段亚克隆。正义引物含XhoI或SmaI位点。连接反应前，用XhoI或SmaI及HindIII消化PCR片段和荧光素酶表达载体pGL3-基础载体。所有构建均采用GL2 和RV3引物经过DNA测序分析确认。

瞬时转染和荧光素酶检测：T/C-28a2细胞DNA转染采用FuGENE 6TM 转染试剂。过夜在6孔板中培养2×10⁵个T/C-28a2细胞。转染混合液包含3-9 μL转染试剂(转染试剂μL∶DNA μg，6∶1)，500 ng各类启动子构建，添加100 ng 或200 ng pCMV-β-gal，按说明给予或不给予抵抗素刺激细胞。在共转染实验中，按说明将500 ng C/EBP表达载体或空载体加入100 μL转染混合液。由于C/EBPβ翻译效率低，使用大量质粒(500 ng)进行转染，详见上述^[9^，^29]。4 h后在转染培养基中添加终体积分数为10%的胎牛血清。培养24 h后换新的完全培养基，在有或无抵抗素刺激下继续培养4 h。用报告基因裂解缓冲液TM收集细胞，使用Promega荧光素酶分析试剂TM对裂解液荧光素酶活性进行检测。检测β-乳糖苷酶活性用以校正转染效率差异。每次转染实验均有两个或3个附孔，重复至少3次。

免疫荧光：在8孔板中培养每孔5×10⁴个人关节软骨细胞。细胞休止24 h，按说明时间给予抵抗素刺激。细胞在含40 g/L多聚甲醛PBS液中孵育10 min，然后在含0.2% Triton-X-100的PBS中孵育5 min，接着在含体积分数10% 正常山羊血清的PBS中室温孵育2 h。细胞加入溶于体积分数2%正常山羊血清PBS稀释至1∶400的兔抗-C/EBPβ及小鼠抗-c-Rel抗体4 ℃过夜反应。随后细胞在室温跟二抗反应1 h，Alexa fluor 488染料标记山羊抗小鼠IgG稀释至1∶250，Alexa fluor 594染料标记山羊抗兔IgG稀释至1∶400，均溶于体积分数2%正常山羊血清PBS。采用荧光显微镜检测免疫活性。

主要观察指标：①抵抗素非依赖性刺激正常软骨细胞趋化因子基因表达。②抵抗素刺激软骨细胞 C/EBPβ表达。③核因子κB参与调控抵抗素诱导的软骨细胞趋化因子基因表达上调结果。④抵抗素刺激软骨形成期ATDC5细胞miRNAs表达。⑤C/EBPβ及核因子κB共同上调抵抗素诱导的人软骨细胞CCL3及CCL4表达。⑥C/EBPβ及核因子κB免疫组织化学检测结果。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s的形式表达，每次实验至少重复3次。组间数据比较采用SPSS 13.0软件进行t 检验，P < 0.05则认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

抵抗素为脂肪细胞来源细胞因子家族成员，可能为脂肪因子和包括骨关节炎和类风湿性关节炎的炎症疾病间的潜在联系^[3^，⁵^，^7]。抵抗素刺激人关节软骨细胞可上调很多细胞因子和趋化因子的表达，包括白细胞介素1β^[8]。白细胞介素1β为炎症性关节病中的一种重要细胞因子，可诱导酶使细胞外基质降解，降低原软骨构成成分Ⅱ型胶原蛋白(COL2A1)及聚集蛋白聚糖的合成，促进细胞因子和趋化因子表达^[13-14]。本实验显示在有效抑制白细胞介素1受体后抵抗素仍促进细胞因子和趋化因子的增高。因此，抵抗素和白细胞介素1β在诱导趋化因子合成中均具有作用，抵抗素和白细胞介素1β对趋化因子基因上调的作用可叠加。

本实验结果显示在抵抗素诱导软骨细胞趋化因子和细胞因子表达上调中C/EBPβ具有重要作用。结果还显示，在给予抵抗素刺激24 h时C/EBPβ表达逐渐增加。从数据中得出结论，C/EBPβ参与抵抗素诱导趋化因子基因的合成调控。根据作者以往的趋化因子基因刺激和C/EBPβ抑制细胞外基质基因的实验^[14]，假设C/EBPβ是调节抵抗素诱导软骨细胞基因激活的一个重要因子。事实上，Kawaguchi和他同事的研究证实C/EBPβ在软骨细胞肥大中起关键作用，可上调X型胶原和基质金属蛋白酶13表达，抑制Ⅱ型胶原合成^[33]。他们的结果还表明去除 C/EBPβ可对抗骨关节炎。

与经典促炎递质C/EBPβ类似，抵抗素还可增强核因子κB活性；然而与C/EBPβ相反，核因子κB活性的增强为一过性。鉴于CCL3的表达过程和C/EBPβ的逐渐增强，作者考虑C/EBPβ参与长时间的抵抗素诱导趋化因子基因上调，尤其是对如CCL3趋化因子基因的调控。CCL3趋化因子基因的诱导缓慢，mRNA逐渐稳定增高，在24 h仍未达到峰值。相反，核因子κB参与早期抵抗素诱导趋化因子上调(4 h达到峰值)，后期浓度逐渐下降。近期不同细胞实验提示核因子κB与C/EBPβ可共同调节很多基因^[14^，^34-35]。本实验证明了C/EBPβ及核因子κB均参与调控抵抗素诱导人软骨细胞趋化因子基因上调，调控具有时间线性：核因子κB提供初始上调，C/EBPβ维持基因高表达。

软骨细胞代谢在转录水平和转录后水平均受到调控^[15^，^36-37]。作者以往研究报道，抵抗素刺激可引起包括CCL4基因表达在转录后水平显著提高^[8]。miRNAs为转录后调节因子，在包括骨和软骨组织等广泛生物和组织类型的分化和发展中具有重要作用。miRNAs主要依赖转录因子，通过结合靶基因来发挥作用。Swingler对人关节软骨细胞的miRNA进行了分析^[38]。人间充质干细胞成软骨分化和聚羟基脂肪酸培养小鼠间充质干细胞分化的miRNAs表达对比研究提示不完全重合^[24^，^39-40]，包括miR-455-3p。

Tuschl首次在哺乳动物中发现miR-455-3p^[41]。一些研究发现miR-455-3p与细胞增殖和分化密切相关^[42-43]，抑制miR-455-3p可导致细胞凋亡和死亡^[44]。近期，Swingler和同事发现在关节炎患者软骨细胞和ATDC5细胞成软骨分化时可表达miR-455-3p^[38]。在本实验中，miR-455-3p调节转化生长因子β信号通路，抑制成软骨分化SMAD2/3通路。在作者以往的研究中，miRNA靶点预测软件结果显示 C/EBPβ及核因子κB为miR-455-3p的潜在靶基因^[24]。相同结果还包括在人脂肪干细胞成软骨分化中miR-92a 及miR-381均上调。有趣的是，与核因子κB趋势类似，miR-455-3p及miR-381似乎在早期参与抵抗素诱导上调，浓度随时间逐渐下降，刺激4 h后下降至100 μg/L。这些研究表明miRNAs可能在抵抗素刺激ATDC5细胞成软骨分化中特异性表达，说明miRNAs可能参与调控趋化因子表达。实验表明在抵抗素刺激成软骨过程中，这些miRNAs参与转录后调控机制。将来实验会对内在机制的进一步研究。

综上所述，实验数据表明软骨细胞对抵抗素刺激存在非严格细胞特异性应答，通过C/EBPβ，核因子κB及一些成软骨特异性miRNAs对趋化因子基因表达进行综合性调控。核因子κB活性的一过性增高促进 C/EBPβ活性增强，两转录因子均可独立作用于CCL3及CCL4趋化因子基因。实验结果提供进一步证据，强化作者以往的抵抗素研究结果，为控制慢性关节病趋化因子基因表达提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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抵抗素刺激软骨细胞趋化因子CCL3及CCL4基因表达及机制

Resisin stimulates the expression of CCL3 and CCL4 in chondrocytes

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