生物医用纳米(Y0.95Eu0.05)2O3的体外细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.12.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (12): 1846-1851.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.12.009

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生物医用纳米(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃的体外细胞相容性

帅孟奇，朱文鲁，王友法

武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室，湖北省武汉市 430070

修回日期:2015-02-03 出版日期:2015-03-19 发布日期:2015-03-19
通讯作者: 王友法，教授，武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室，湖北省武汉市 430070
作者简介:帅孟奇，女，1990年生，湖北省仙桃市人，汉族，武汉理工大学材料科学与工程学院在读硕士，主要从事生物医用材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(51172172)

In vitro cytocompatibility of biomedical (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ nanomaterials

Shuai Meng-qi, Zhu Wen-lu, Wang You-fa

State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei Province, China

Revised:2015-02-03 Online:2015-03-19 Published:2015-03-19
Contact: Wang You-fa, Professor, State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei Province, China
About author:Shuai Meng-qi, Studying for master’s degree, State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51172172

摘要/Abstract

摘要：

背景：与有机荧光染料和荧光蛋白相比，稀土纳米材料具有更高的灵敏性和更好的光学稳定性，并且具有更低的细胞毒性。

目的：探讨(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料的体外细胞相容性，以及氨基化修饰对材料细胞相容性的影响。

方法：采用溶胶-凝胶法合成(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料，并进行氨基化修饰。将10，25，50，100，200 mg/L的氨基化与非氨基化(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料悬液分别与SD大鼠血管平滑肌细胞共培养3 d，CCK-8法检测细胞增殖；将100 mg/L的氨基化与非氨基化(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料悬液分别与L929细胞共培养48 h，荧光染色观察细胞凋亡。

结果与结论：随着材料悬液质量浓度的升高，血管平滑肌细胞存活率呈逐渐减少趋势；在材料质量浓度为10，25，50 mg/L时，氨基化组细胞存活率明显高于未氨基化组(P < 0.05)；当材料质量浓度高达200 mg/L时，未氨基化组细胞存活率降到76%，氨基化组细胞存活率仍然在80%以上，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。氨基化组L929细胞生长状况良好，凋亡细胞数量较少；未氨基化组生长较稀疏，细胞凋亡数量较多，显示出轻微的细胞毒性。表明氨基化修饰可以有效提高(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 生物相容性, 氨基化修饰, CCK-8, 细胞毒性, 荧光染色, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Compared with organic fluorescent dyes and fluorescent proteins, rare earth nanomaterials have higher sensitivity, better optical stability, and lower cytotoxicity.

OBJECTIVE: To investigate the in vitro cytocompatibility of (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ rare earth nanomaterial and the effect of amine functionalization on the material cytocompatibility.

METHODS:(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ nanomaterials were synthesized using sol-gel method, and underwent amine functionalization. Amine-functionalized samples (10, 25, 50, 100, 200 mg/L) and non-amine-functionalized (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ rare earth nanomaterial suspensions were co-cultured with vascular smooth muscle cells of Sprague-Dawley rats for 3 days. Cell proliferation was detected using Cell Counting Kit-8 assay. 100 mg/L amine-functionalized samples and non-amine-functionalized (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ rare earth nanomaterial suspensions were co-cultured with L929 cells for 48 hours. Cell apoptosis was observed using fluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: With increased mass concentration of material suspension, survival rate of vascular smooth muscle cells was gradually reduced. At the mass concentration of 10, 25, 50 mg/L, cell survival rate was significantly higher in the amine-functionalized group than in the non-amine-functionalized group (P < 0.05). When the mass concentration of materials reached 200 mg/L, the cell survival rate decreased to 76% in the non-amine-functionalized group, but it was still above 80% in the amine-functionalized group, showing significant differences between the two groups (P < 0.05). The growth of L929 cells was good and the number of apoptotic cells was less in the amine-functionalized group. Cells were sparse and the number of cell apoptosis was more in the non-amine-functionalized group, showing slight cytotoxicity. These data verified that amine-functionalization can improve cytocompatibility of (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ rare earth nanomaterial.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Nanostructures, Materials Testing, Lanthanoid Series Elements

中图分类号:

Ring18

帅孟奇，朱文鲁，王友法. 生物医用纳米(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃的体外细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(12): 1846-1851.

Shuai Meng-qi, Zhu Wen-lu, Wang You-fa. In vitro cytocompatibility of biomedical (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ nanomaterials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(12): 1846-1851.

图/表（结果） 3

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引言

稀土纳米材料主要是指以稀土元素或者稀土化合物为基质、激活剂或者掺杂剂的荧光纳米材料。稀土元素一般是指元素周期表中原子序数为21(钪、Sc)、39(钇、Y)和57-71(镧系元素、La-Lu)的17种元素。由于稀土元素具有十分独特的电子层结构，且稀土离子的4f组态具有非常丰富的能级数量，因而在光子的激发下，稀土元素可以发生多种跃迁，表现出极为丰富的荧光特性。这也使得稀土荧光材料成为了一个庞大的荧光材料宝库，提供了极为丰富的荧光材料资源。稀土荧光材料有很多吸引人的特征，包括较高的荧光稳定性、色纯度高、无荧光闪烁、发射光谱窄、寿命长、易修饰等。同时，稀土荧光材料还具有稳定的理化性质，强紫外光、高能辐射等外界环境对材料的影响非常小，还可以通过对稀土纳米材料表面进行多功能修饰并连接特定的基团，以标记特异的生物大分子。由于稀土荧光材料具有很强的发光性能和化学稳定性，并且已经在显示器和指示标志等方面被广泛应用，所以，应用其作为发光标记物在生物分析领域具有很大的潜力^[1]。目前，已有将稀土荧光材料作为荧光探针应用于生物标记、生物成像、生物传感、生物检测免疫分析等生物医学领域的相关研究^[2-4]。本实验通过对比常见稀土荧光纳米材料的制备方法，并结合实验室的实际情况，采用溶胶-凝胶法合成Y₂O₃:Eu³⁺材料，对材料进行了表面氨基化改性。

生物材料在应用到体内时会直接或间接的与组织相接触，因此在将材料用到人体之前，应该做好其生物相容性的相关研究。生物材料与其他材料最大的区别在于，它不光要作为一种外来物质进入到机体组织，而且在进入体内后会参与体内物质的代谢及其他生物化学反应，因而对生物材料的物理化学性质稳定性和生物相容性都有很高的要求。良好的生物相容性是生物材料具有临床应用安全性的前提^[5]。目前，对生物材料进行生物学评价的方法主要有：细胞毒性实验、血液相容性实验、遗传毒性和致癌实验、植入实验及过敏实验等^[6]。细胞毒性实验是一种常用检测细胞毒性的方法，几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有细胞毒性^[7]，该实验方法简单快速，而且重复性好，其优越性已得到国际上的认可。现已合成大小均匀、形貌规整、理化性质良好的(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃纳米颗粒，为了提高其亲水性和生物相容性，对材料表面做了氨基化改性。

本实验采用CCK-8法、Hoechst33342和PI染色法来检测材料对原代细胞和细胞系的影响，探讨其体外生物相容性。

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材料方法

设计：分组观察实验。

时间及地点：实验于2013年9月至2014年6月在武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室完成。

材料：L929细胞株购自Gibco公司。
实验动物：60 d龄雄性SPF级SD大鼠3只，体质量200-250 g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。

实验方法：

(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料的制备：按Eu³⁺的摩尔数占Y³⁺、Eu³⁺总摩尔数的0.05称取2.5 g Y₂O₃、0.196 g Eu₂O₃，加入300 mL去离子水，缓慢加入浓硝酸，磁力搅拌至完全溶解，过滤掉溶液中的未溶物杂质。加入0.108 g PEG，稀释后滴加氨水至pH值=5.0-6.0，形成溶胶，经过离心洗涤、冷冻干燥后，在800 ℃条件下煅烧后得到样品(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃粉体。

氨基化修饰过程：称取经过干燥处理的(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ 稀土荧光纳米材料粉末1.0 g，加入50 mL去离子水后超声分散，逐滴加入1 mol/L的Na₂SiO₃，不断搅拌，使用浓度为10%的稀H₂SO₄调节pH值稳定在9-11之间，85 ℃水浴条件下反应2 h，经离心洗涤、冷冻干燥后得到包覆有SiO₂层的材料。将具有SiO₂包覆层的粉末超声分散于体积分数为10%的乙醇-水混合液中，滴加0.22 g(233 μL)的KH550，并在80 ℃水浴条件下搅拌1.5 h，重复离心清洗干燥步骤，得到表面氨基化的(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃材料。

血管平滑肌细胞的原代培养：取SD大鼠3只，将0.3 g/mL的戊巴比妥纳按10 mg/kg的量腹腔注射麻醉。腹部脱毛，仰卧固定在操作台上。用碘伏对皮肤消毒后，依次剪开胸腹部皮肤、肌肉及胸骨，暴露胸腔。剪断腹主动脉下段，用5 mL注射器从左心室刺入，生理盐水灌注冲洗主动脉3次，剪下整段主动脉，放入含有1%青链霉素的PBS中，反复漂洗之后立即转入细胞室内的超净工作台上。更换平皿，将血管置于含体积分数20%血清和1%青链霉素的DMEM培养液中，清洗3遍。然后固定血管一端，用显微剪纵行剖开血管，内膜面向上，以眼科弯镊或手术刀片轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞，最后转移到另一个含体积分数20%胎牛血清和DMEM混合液的细胞培养皿中，用眼科剪将血管段剪成1 mm×1 mm 大小的组织块。用吸管把组织块转入25 mL细胞培养瓶中，均匀贴壁于培养瓶底面。翻转培养瓶，让瓶底朝上。加入一定量的含体积分数20%血清和1%青链霉素的DMEM培养液，放入37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内，静置3-5 h后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸没在培养液中，继续培养3-5 d，待细胞从组织块边缘长出后即可换液。待细胞传至3-7代，即可用于实验。

免疫荧光法鉴定细胞：将第3代纯化后的血管平滑肌细胞接种于预先置有无菌盖玻片的6孔板内进行培养，待细胞爬满载玻片时用PBS洗涤3次，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，再用PBS浸洗玻片3次。0.5%Triton X-100室温通透20 min，用PBS浸洗玻片3次。吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，鼠单抗α-SMA 1∶200一抗稀释液4 ℃孵育过夜。用1∶100稀释好的荧光标记二抗，湿盒中20-37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，加入DAPI染核，室温避光10 min，然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，在荧光显微镜下观察。

CCK-8法检测材料的细胞毒性：用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的DMEM培养液，于体积分数5% CO₂的37 ℃恒温培养箱内培养血管平滑肌细胞，待细胞长至85%融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化后计数，以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种至96孔板。将氨基化之前以及氨基化之后的两种材料分别进行高压蒸汽灭菌，烘干后将两种(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃纳米粒子悬浮在无菌PBS中，并且稀释到10，25，50，100，200 mg/L的不同质量浓度，将细胞接种至96孔板24 h后，将分散好的各个质量浓度的纳米颗粒悬液加入细胞中，阴性对照组加等量的PBS。为了避免纳米颗粒对吸光度的干扰，同时设置空白对照组，只加培养液和材料悬浮液。共培养3 d后，加入10 μL CCK-8于37 ℃继续培养1-4 h，取100 μL上清液转移至新的96孔板内，用酶标仪于450 nm处读取吸光度值。

细胞相对存活率(%)=[(材料组吸光度-空白对照吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白对照吸光度)]×100%。

荧光显微镜观察细胞毒性：将对数生长期的L929细胞消化之后，加入含体积分数10%胎牛血清的1640培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，接种于预先置有盖玻片的6孔板内，接种细胞浓度为1×10⁸L^-1，每孔2 mL。置于体积分数5% CO₂的37 ℃恒温培养箱内培养。待细胞贴壁后，加入100 mg/L的氨基化与非氨基化(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃纳米粒子材料悬浮液，对照组加入等量的PBS。培养48 h后，向装有盖玻片的培养板中加入10 mg/L的Hoechst33342染色液(PBS溶解)，37 ℃孵育10 min。继续加入10 mg/L的PI(PBS溶解)，4 ℃反应20 min。直接加入40 g/L多聚甲醛固定液，固定细胞10 min后，PBS洗3次，每次3 min；用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封固液封固，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

主要观察指标：两种材料与细胞共培养之后的细胞增殖结果及荧光观察结果。

统计学方法：计量资料数据采用SPSS 19.0软件包分析，组间差异采用t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

荧光材料在生物成像、疾病诊断及标记示踪等生物医学领域应用具有不可比拟的优点。与传统的荧光标记材料如有机荧光染料等相比，荧光纳米材料的物理化学性质更具有可调性且更加多样化，具有更加灵活的尺寸、形貌、表面结构及荧光性质等，而且易于对材料进行功能化修饰。目前，被广泛应用于生物体系的新型荧光纳米材料主要包括半导体量子点、稀土纳米材料和荧光染料掺杂的纳米颗粒等^[8-13]。然而，量子点的荧光闪烁现象、在体内潜在的细胞毒性及其复杂的功能化策略极大限制了量子点在荧光标记中的应用^[14-18]。

稀土荧光材料具有发光谱带窄、色纯度高、色彩鲜艳等优点。而且，与有机荧光染料和荧光蛋白相比，稀土纳米材料具有更高的灵敏性和更好的光学稳定性，并且具有更低的细胞毒性^[19-24]。

在本实验中采用溶胶-凝胶法合成了(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃稀土纳米材料，但通过这种方法合成的材料一般不适合直接用于和生物分子相连接，其原因主要有以下几点：氧化物型的稀土荧光材料亲水性比较差，在模拟体液中分散性不好；粉体颗粒尺寸越小，其比表面积就越大表面能相对较高，就越容易出现团聚现象；稀土荧光材料对于机体组织来说属于外来物质，需评估并改善其生物相容性之后再作为具体的功能材料应用。为了解决上述3个问题，必须对纳米颗粒表面进行修饰处理，增强其亲水性，以改善其在模拟体液中的分散性，并且在颗粒表面包覆层上连接带有电荷的基团，使颗粒表面带有一定的电势，这在一定程度上也能减少团聚现象。

对生物材料进行表面修饰的目的是尽可能为细胞提供与细胞外基质类似的生长环境，从而有利于细胞生长。对纳米颗粒表面进行修饰的方法有很多，应用较多的有表面羧基化和表面氨基化两种，通过羧基化或氨基化修饰之后，材料表面与生物机体内的环境更为接近。本实验采用表面氨基化方法对粉体颗粒进行改性，但氨基一般不容易直接连接到颗粒表面，需要在材料表面包覆上一层SiO₂，形成核壳结构后，将氨基连接在SiO₂层上。一般来说，经过二氧化硅包覆后的纳米颗粒都具有很好的亲水性和生物相容性，因此，二氧化硅包覆法在荧光纳米材料的表面修饰中应用较多^[25-29]。

Li等^[30]用二氧化硅包覆上转换荧光材料，在体内和体外都表现出较好的生物相容性。Xiong等^[31]的研究表明氨基化不仅可以提高材料在溶液中的分散性，还有利于材料与特定的蛋白分子连接。

细胞毒性测试是评价生物材料与细胞之间相互作用的一个非常重要指标^[6]。CCK-8检测法是常用检测细胞毒性的方法之一^[32]。CCK-8检测试剂中含有WST-8，而细胞线粒体里面存在的一种脱氢酶可以将WST-8还原成一种黄色甲臜物质，由于死细胞内的脱氢酶失活，不能将WST-8还原，因而反应后生成的甲瓒物越多则表明活细胞的数量越多，两者之间的数量呈正比。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由于此方法操作简单方便、灵敏度高、实验可重复性好而被广泛应用于检测细胞的存活率，以判断生物材料的细胞毒性。本实验中从CCK-8结果可以看出，氨基化可以明显提高材料的细胞相容性，在材料质量浓度较高时细胞存活率也在80%以上，表明氨基化表面修饰在提高材料的生物相容性方面发挥了较大作用。

Hoechst33342和PI染色是实验室常用鉴别死细胞和活细胞的方法之一。Hoechst33342和PI染料均可与细胞核DNA(或RNA)结合，但是PI不能通过正常细胞的细胞膜，而Hoechst33342能够透过细胞膜与DNA(或RNA)结合，因此可以进入活细胞和早期凋亡细胞。Hoechst33342染色后的细胞在荧光显微镜下会发出蓝色荧光，但由于凋亡细胞的细胞核会发生固缩，因而在凋亡细胞中的荧光强度会高于正常细胞，呈亮蓝色。PI可以使坏死细胞着色，在显微镜下发红色荧光。从荧光显微镜观察结果可以看到，氨基化组细胞生长状态良好，凋亡细胞数量较少，远低于未氨基化组的细胞，说明氨基化修饰有利于细胞生长，在很大程度上减少了细胞的凋亡。

目前在稀土纳米材料的生物应用过程中，材料的合成和修饰方面还存在一些困难。稀土元素的分子质量大、易团聚等特点，也在一定程度上限制了稀土纳米材料在生物医学方面的应用。虽然许多专家和学者已经注意到了这方面的问题，且正在逐步改进合成和修饰方法，但如何制备尺寸较小、均匀且生物相容性满足要求的材料还需要大量的研究工作。通过二氧化硅包覆稀土纳米颗粒来进行氨基化修饰，为人们提供了很好解决稳定性和生物相容性的可行途径，值得深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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1 荧光纳米材料的设计、表征及其在生物医药中的应用已成为材料、生物医学等交叉领域的研究热点，而稀土纳米材料以其独特的光学性能正受到越来越多的关注，但如何对其进行表面修饰以提高其生物相容性还处于研究阶段。

2 实验采用溶胶-凝胶法合成了(Y0.95Eu0.05)2O3稀土纳米材料，但通过这种方法合成的材料一般不适合直接用于与生物分子相连接，其原因主要有以下几点：氧化物型的稀土荧光材料亲水性比较差，在模拟体液中分散性不好；粉体颗粒尺寸越小，其比表面积就越大表面能相对较高，就越容易出现团聚现象；稀土荧光材料对于机体组织来说属于外来物质，需评估并改善其生物相容性之后再作为具体的功能材料应用。为了解决上述3个问题，必须对纳米颗粒表面进行修饰处理，增强其亲水性，以改善其在模拟体液中的分散性，并且在颗粒表面包覆层上连接带有电荷的基团，使颗粒表面带有一定的电势，这在一定程度上也能减少团聚现象。故采用二氧化硅包覆稀土纳米材料表面进行氨基化修饰对粉体颗粒进行改性，使材料表面与生物机体内的环境更为接近。故采用二氧化硅包覆稀土纳米材料表面进行氨基化修饰对粉体颗粒进行改性，使材料表面与生物机体内的环境更为接近。

3 实验从材料与细胞相容性着手，通过CCK-8实验和荧光染色观察探讨了氨基化修饰对稀土纳米材料细胞相容性的影响，结果表明氨基化修饰可以有效提高稀土纳米材料的细胞相容性。

基金资助：
国家自然科学基金资助项目(51172172)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

生物医用纳米(Y_0.95Eu_0.05)₂O₃的体外细胞相容性

In vitro cytocompatibility of biomedical (Y_0.95Eu_0.05)₂O₃ nanomaterials

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