携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.013

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (11): 1707-1711.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.013

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携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

梁亮¹，徐韬¹，宋扬²，盛伟斌¹

¹新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²解放军第四军医大学唐都医院骨科，陕西省西安市 710038

修回日期:2014-12-23 出版日期:2015-03-12 发布日期:2015-03-12
通讯作者: 盛伟斌，博士、教授、主任医师、博士生导师，新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:梁亮，男，1984年生，河南省周口市人，新疆医科大学第一附属医院脊柱外科在读硕士。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目面上项目(2014211C026)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目青年基金(2014211C072)

siRNA lentiviral vectors carrying telomerase reverse transcriptase gene hasten astrocytes apoptosis

Liang Liang¹, Xu Tao¹, Song Yang², Sheng Wei-bin¹

¹Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Orthopedics, Tang Du Hospital, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 636600, Shaanxi Province, China

Revised:2014-12-23 Online:2015-03-12 Published:2015-03-12
Contact: Sheng Wei-bin, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Liang Liang, Studying for master’s degree, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014211C026; the Natural Science Foundation for the Youth of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014211C072

摘要/Abstract

摘要：

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用，利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。

目的：利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞，并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。

方法：原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组，转染后并测其转染率，且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。

结果与结论：端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示，端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48 h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明，携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 端粒酶, 端粒酶反转录酶, 慢病毒载体, RNA干扰, 星形胶质细胞, 转染, 凋亡, 脊髓损伤, 胶质瘢痕, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Telomerase reverse transcriptase plays an important role in telomerase activation, and lentiviral vectors carrying human telomerase reverse transcriptase that can inhibit astrocyte expression are rarely reported to have effects on spinal cord injury.

OBJECTIVE: To transfect rat astrocytes with telomerase reverse transcriptase gene lentiviral vectors and to observe the effect of telomerase reverse transcriptase gene lentiviral vectors on apoptosis of astrocytes.

METHODS: Astrocytes from rats were subject to primary culture and subculture, and then transfected with siRNA lentiviral vector carrying telomerase reverse transcriptase gene (siRNA transfection group), simple lentiviral vector (lentiviral vector group) and nothing (blank group), respectively. Then, the transfection efficiency and apoptosis in different time periods after transfection were determined.

RESULTS AND CONCLUSION: The transfection efficiency was up to 85%-90% after siRNA lentiviral vector and simple lentiviral vector transfection. The apoptosis rate of astrocytes in the siRNA transfection group was 50%-60% at 24-48 hours after transfection, but there was no significant change in the other two groups. These findings suggest that siRNA lentiviral vectors carrying telomerase reverse transcriptase gene can accelerate astrocytes apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Genes, Cells, Spinal Cord Injuries

中图分类号:

R318

梁亮，徐韬，宋扬，盛伟斌. 携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1707-1711.

Liang Liang, Xu Tao, Song Yang, Sheng Wei-bin. siRNA lentiviral vectors carrying telomerase reverse transcriptase gene hasten astrocytes apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1707-1711.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2014年7至9月在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院完成。

材料：

实验动物：清洁级雄性SD大鼠4只，体质量约220 g，动物许可证号：SYXK(新)2003-001，由新疆医科大学动物实验中心提供。

实验对动物的处理方式依据中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[7]。

细胞：大鼠脊髓源星形胶质细胞由实验室在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院的各位老师具体指导下分离、纯化和培养获得。

载体：pLentilox3.7U6质粒载体购自广州Cyagen公司。

实验方法：

大鼠原代脊髓星形胶质细胞培养：无菌条件下于超净工作台剥离大鼠脊椎取胸段脊髓，显微镜下去除脊膜、血管等结缔组织。剪碎置于离心管，在37 ℃温度条件下加入适量体积分数0.125%胰蛋白酶消化并轻轻吹打约20 min，再加入适量体积分数20%小牛血清DMEM/F12培养基终止消化，将细胞分散后离心，弃上清，重新加入培养基，吹打，制成细胞悬液，接种至培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培育40 min，过滤、离心浓缩；制成次级细胞悬液，再次接种至培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培育，并补足培养液。于次日更换培养液，弃去未贴壁及活力差或死亡的细胞，继续培养8-10 d。并及时更换补充培养液。

取铺满培养瓶的原代星形胶质细胞，弃去已变色的原培养液并洗涤2次，加入胰酶消化，在倒置显微镜下观察待细胞圆形变是加入培养基并吹打数次终止消化，使其脱落并转移至离心管离心10 min，弃上清液加入完全培养基接种至培养瓶继续培养，8-10 d长满瓶。

胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫荧光检测星形胶质细胞：取传代至三四代细胞并制成悬液，接种至培养板并置于培养箱中培养24 h。去培养液加入固定液(40 g/L多聚甲醛)室温下固定30 min，移除固定液，PBS液37 ℃条件下孵育封闭10 min。加入一抗(兔抗鼠GFAP抗体)，4 ℃冰箱过夜；加入二抗(羊抗兔lgG)并避光，在37 ℃水浴箱内孵育30 min。在激发紫外线光波长为490 nm，滤色光紫外线波长为520 nm的激光共聚焦显微镜下观察并照相。

星形胶质细胞的转染：将传代至3代的星形胶质细胞分成转染组端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组(无任何干预)，取上述细胞制

成悬液，用无抗生素的体积分数15%DMEM将接种至培养板，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培育24 h。将端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体及单纯慢病毒各100 μL用质量浓度8 mg/L的FuGENE HD转染试剂转染星形胶质细胞，按说明书操作。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培育24-72 h备用观察。

Annexin-V/PI双染法检测转染星形胶质细胞的凋亡： 转染后24，48，72 h收集各组培养板上转染后的星形胶质细胞，PBS洗涤细胞2次(2 000 r/min离心5 min)收集(1-5)×10⁵个细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞及 5 μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀，室温避光、反应5-15 min；应用流式细胞仪检测细胞凋亡，计算凋亡百分率。

主要观察指标：星形胶质细胞的原代及传代培养情况；端粒酶反转录酶基因慢病毒载体转染大鼠脊髓源星形胶质细胞的转染率；转染后的凋亡情况。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 11.0软件进行数据分析，组间数据差异的比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

脊髓损伤后神经功能的恢复成为治疗最为棘手的问题，且未能取得满意的临床效果，因此更多的医疗工作者不断探索新的治疗方法。相关的研究显示：脊髓损伤后胶质瘢痕的形成和发展是其主要的病理变化。胶质瘢痕的形成既修复稳定了脊髓的组织构架，但同时也隔离了损伤区与周围神经组织的联系，使得再生的神经轴突难以通过损伤区；而且其分泌的化学性抑制因子，也给神经轴突的再生带来了化学性屏障。这种屏障作用的胶质细胞可于损伤后被激活由常态转化为反应态，作为星形胶质细胞主要构架结构的GFAP其分裂及增生现象增加。因此，是否可通过一种基因干扰的技术，抑制GFAP的表达，减少损伤区瘢痕的形成，从而促进脊髓损伤的修复。鉴于脊髓损伤区神经细胞再生及通过障碍，诸多的研究者开始尝试用细胞移植的方法治疗脊髓损伤区的恢复。其中神经干细胞因其既有增殖能力又有多分化潜能^[7]，被认为是移植治疗的可行方法^[9-10]。相关神经干细胞及干细胞联合相关因子移植治疗脊髓损伤的实验性研究均取得了一定的进展^[11-13]。无论是单独的神经干细胞移植还是联合其他相关因子移植均可改善损伤区的细胞生长、轴突的通过及瘢痕的形成。但神经干细胞移植也带来脊髓修复的另外一些相关的问题，因干细胞具有多项分化的特点，既可向神经细胞分化，同时更多的向胶质细胞的分化，使得胶质区瘢痕的形成也增加，加强了瘢痕的屏障作用。虽然在后续的联合相关因子及诱导向神经细胞分化的移植中，对胶质瘢痕的形成有所改善，但其并没有充分的减轻瘢痕的形成，使移植再生的神经轴突通过损伤区。作者课题组既往的相关实验性研究也从一个方面验证了这一点^[14-15]。针对端粒酶反转录酶基因的激活表达是瘢痕形成的关键步骤，实验设计通过RNA干扰技术抑制端粒酶反转录酶基因的过度表达，从而限制瘢痕的增生。将携带有端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染至体外培养的星形胶质细胞，观察细胞的生长改变及凋亡情况，用以探索RNA干扰技术对胶质细胞的生长及凋亡是否有影响。在实验中同时设置了阴性对照组和空白组，以排除单纯慢病毒对脊髓损伤修复的影响以及在干预的情况下细胞的生存状态。通过对转染后胶质细胞的观察及生长情况的检测，转染端粒酶反转录酶基因慢病毒载体的胶质下拨不仅细胞体积缩小，突触缩短，而且细胞的凋亡速度也明显加快。而阴性对照组及空白组无明显改变。证明利用RNA干扰技术体外转染胶质细胞，可以减少胶质细胞的形成，促进其凋亡。因此实验设想：RNA干扰技术在减少脊髓损伤后胶质瘢痕应具有积极作用。同时验证了实验前期实验中构建的靶向端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体是成功的，且具有抑制目的表达的效应^[6-16]。但该实验的结果及其实验的相关设想只是在体外培养胶质细胞实施转染后的结果，体外环境较为单一，且有严格的人为控制因素。但脊髓损伤后损伤区环境的更加复杂且不可控制，体内实施RNA干预能否取得同样的干预效果，减少胶质瘢痕的形成，尚需进一步的研究探索，也是该实验需要进一步完善之处。

RNAi是人类及动物体内普遍存在的基因表达调控方式，这种通过双链的RNA分子靶向的抑制或沉默基因，在转录后水平上发挥调控作用的基因干扰阻断的方法在近年来也得到了广泛的应用。这种外源的DNA或RNA分子在细胞自身酶的作用下切割靶向mRNA的特定序列从而达到干扰目的基因的技术手段使人们能够更加简便、经济、快捷的从事相关的基因干扰抑制工作^[17-18]。在药物靶基因筛选、肿瘤靶向治疗、脊髓损伤、细胞信号传导基因表达等的研究领域内得到广泛应用^[19]。在研究者发现siRNA可以由载体在细胞内转录生成，以病毒为主要载体的RNA干扰技术逐渐得以推广和应用。较之既往应用较多的反转录病毒、腺病毒等载体，慢病毒载体以其特有的优势在近年的RNA干扰技术应用中备受青睐。其克服了反转录病毒、腺病毒的容量小、整合率低、不能持久表达、且感染具有时相性等不足。以其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力并能在宿主细胞内长期表达，产生高滴度的慢病毒，具有较好的安全性等优点^[20]，使其在RNA干扰技术应用中越来越广泛。近年，诸多的研究者在RNA干扰技术的应用上开展了广泛的工作^[21-22]：在针对靶向基因构建的慢病毒载体获得满意的结果，在转染目的细胞后检测相关蛋白及目的基因的表达均达到了预期的实验效果，达到了RNA干扰的目的。

本课题组在构建RNA干扰的慢病毒载体时亦获得与预期实验目的相一致的实验效果。只是上述研究者及本课题组的前期工作中只是定向的检测干扰之后特定蛋白的表达^[5-21]，或者是在载体构建成功之后直接的进行体内的干预实验，缺乏对脊髓损伤后瘢痕形成的主要细胞胶质细胞生长状况的观察研究。本次实验的设计是在针对端粒酶反转录酶基因慢病毒载体转染目的细胞的基础上，观察细胞的生长态势及其对目的细胞凋亡的影响。对前期载体构建的补充，验证靶向构建的慢病毒载体不仅可以抑制目的基因及相关蛋白的表达，而且可以促进胶质细胞的凋亡，同时也为后期RNA干扰大鼠脊髓损伤修复的体内实验奠定基础。

本次实验在前期实验的基础上，利用已经构建好的端粒酶反转录酶基因慢病毒载体转染大鼠脊髓源星形胶质细胞，获得了良好的转染率。流式细胞技术检测细胞凋亡，发现与阴性及空白组相比较，转染组的星形胶质细胞逐渐呈现出凋亡的趋势，而阴性组、空白组则未发现明显的凋亡迹象。此发现为本课题的后续RNA干扰的大鼠体内实验提供了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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