树鼩血清与多种二抗的交叉反应：可在树鼩疾病动物模型中广泛应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.024

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (5): 794-798.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.024

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树鼩血清与多种二抗的交叉反应：可在树鼩疾病动物模型中广泛应用

阮光萍，姚翔，刘菊芬，王金祥，何洁，杨建勇，潘兴华

解放军成都军区昆明总医院干细胞工程实验室，云南省昆明市 650032

修回日期:2014-11-12 出版日期:2015-01-30 发布日期:2015-03-02
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，解放军成都军区昆明总医院干细胞工程实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:阮光萍，女，1974年生，云南省昆明市人，汉族，2007年解放军第一军医大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金( 31172170)；国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB518106)；云南省高新技术产业发展专项(201204)；国家支撑计划(2014BAI01B01)

Cross-reactivity of tree shrew sera with various secondary antibodies: extensive application to tree shrew models of diseases

Ruan Guang-ping, Yao Xiang, Liu Ju-fen, Wang Jin-xiang, He Jie, Yang Jian-yong, Pan Xing-hua

Stem Cell Engineering Laboratory, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Revised:2014-11-12 Online:2015-01-30 Published:2015-03-02
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Chief physician, Stem Cell Engineering Laboratory, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Ruan Guang-ping, M.D., Associate chief physician, Stem Cell Engineering Laboratory, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31172170; the National Key Basic Research and Development Program (973 Program), No. 2012CB518106; the Special Project of High-New Technology Industrial Development in Yunnan Province, No. 201204; the National Support Program of China, No. 2014BAI01B01

摘要/Abstract

摘要：

背景：由于树鼩是介于食虫目和灵长目之间的代表，进化程度高，较价廉的灵长类动物，医学生物学的用途很高，已受到广大学者的重视。
目的：检测通常用的二抗能否与树鼩的血清发生免疫反应。
方法：用Western和ELISA的方法检测树鼩的血清是否与抗兔、抗羊、抗人、抗小鼠、抗大鼠、抗猴的二抗发生交叉反应。
结果与结论：Western结果表明树鼩的血清与抗兔、抗羊、抗人、抗小鼠、抗大鼠的二抗均不发生反应，与抗猴的二抗有交叉反应。ELISA的结果也表明树鼩的血清与抗猴的二抗有交叉反应，而与其他二抗没有交叉反应。结果说明通常卖的二抗不能用于树鼩IgG的免疫检测，只有抗猴的二抗与树鼩的血清发生交叉反应，必需制备抗树鼩IgG的单克隆和多克隆抗体，在没有现成抗体可用时，可采用抗猴的二抗替代检测，能在树鼩疾病动物模型的研究中得到广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 树鼩, IgG, 二抗, 交叉反应, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tree shrew is a representative between insectivore and primates, has a high degree of evolution, is more inexpensive primates, has high use of medical biology, and has been attached by scholars.
OBJECTIVE: To detect whether the commonly used secondary antibodies have immune response with tree shrew serum.
METHODS: Western blot assay and enzyme linked immunosorbent assay were utilized to detect whether the tree shrew serum had cross-reacts with anti-rabbit, anti-goat, anti-human, anti-mouse, anti-rat, and anti-monkey secondary antibodies.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot assay results indicated that tree shrew serums did not react with anti-rabbit, anti-goat, anti-human, anti-mouse, and anti-rat secondary antibodies and had cross reaction with anti-monkey secondary antibody. Enzyme linked immunosorbent assay results also indicated that tree shrew serums were cross-reactive with anti-monkey secondary antibody, but did not have cross-reactivity with the other secondary antibodies. Above data confirmed that the usually soled secondary antibody cannot be used to immunoassay with tree shrews IgG. Only anti-monkey secondary antibody has cross-react with tree shrew serum. It is necessary to prepare anti-tree shrew IgG monoclonal and polyclonal antibodies. When no antibody is readily available at present, anti-monkey secondary antibody can be used to substitute detection, and can be widely applied in the study of tree shrew models of disease.

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Key words: Tupaiidae, Receptors, IgG, Cross Reactions

中图分类号:

R318

阮光萍，姚翔，刘菊芬，王金祥，何洁，杨建勇，潘兴华. 树鼩血清与多种二抗的交叉反应：可在树鼩疾病动物模型中广泛应用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 794-798.

Ruan Guang-ping, Yao Xiang, Liu Ju-fen, Wang Jin-xiang, He Jie, Yang Jian-yong, Pan Xing-hua. Cross-reactivity of tree shrew sera with various secondary antibodies: extensive application to tree shrew models of diseases[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 794-798.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2014年1至8月在解放军成都军区昆明总医院临床实验科完成。

材料：

实验动物：五六月龄成年树鼩6只，雌雄各半，体质量120-140 g，购自中科院昆明动物所。

实验血清：兔、猴、羊、大鼠的血清取自解放军成都军区昆明总医院临床实验科动物室培养的成年兔、猴、羊、大鼠。人的血清取自成都军区昆明总医院临床实验科分子室检测的标本后剩余的血清，并获得患者知情同意。

实验方法：

SDS-PAGE电泳：重复进行多次Western实验，结果相同，抗猴的二抗会与树鼩血清会发生交叉反应，其他二抗与树鼩血清没有交叉反应。

取树鼩血清50 μL加50 μL 2×上样缓冲液，沸水浴5 min，分别上样5 μL和10 μL，每次Western小鼠、兔、人、猴、羊、大鼠的血清也分别上样5 μL和10 μL，每次实验都进行一次SDS-PAGE电泳。同样的小鼠、兔、人、猴、羊、大鼠的血清也同样处理并上样，电泳上胶80 V，下胶150 V，电泳结束后转到PVDF膜上用抗体孵育。

转膜实验：将胶按泳道切下后，剪与胶相同大小的PVDF膜和滤纸，从正极到负极依次放置滤纸、PVDF膜、胶、滤纸，用Bio-Rad的转膜仪，100 V转1 h，取下膜进行抗原抗体反应。

Western实验：PVDF膜用5%脱脂奶粉的TBS 37 ℃孵育晃动15 min，封闭非特异结合位点，加入抗体1∶500稀释，37 ℃孵育晃动1 h，几次Western实验的抗体分别为HRP标记的羊抗兔IgG，HRP标记的驴抗羊IgG，HRP标记的羊抗人IgG，HRP标记的羊抗小鼠IgG，HRP标记的羊抗大鼠IgG和HRP标记的兔抗猴IgG抗体，每次抗体都是37 ℃孵育晃动1 h，TTBS洗3次，5 min/次，最后DAB显色。

ELISA实验：取树鼩血清200 μL加3 mL包被液，加入ELISA板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。第2天用PBST洗3次，加5%脱脂奶粉的PBST封闭37 ℃ 20 min，甩干，每孔加100 μL 1∶500稀释的二抗，37 ℃ 1 h，PBST洗3次，每孔加100 μL TMB，37 ℃ 15 min显色，50 μL终止液终止，450 nm比色。

主要观察指标：①树鼩血清与羊抗兔IgG-HRP反应结果。②树鼩血清与驴抗羊IgG-HRP反应结果。③树鼩血清与羊抗人IgG-HRP反应结果。④树鼩血清与羊抗小鼠IgG-HRP反应结果。⑤树鼩血清与羊抗大鼠IgG-HRP反应结果。⑥树鼩血清与兔抗猴IgG-HRP反应结果。⑦树鼩血清与6种二抗的ELISA反应结果。

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讨论

树鼩(tree shrews, Tupaia belangeri)是一类外型酷似松鼠的小型哺乳动物，主要以昆虫和水果为食，分布于东南亚的菲律宾、印度、马来西亚、老挝等地，中国国的云南、广西树鼩资源也较为丰富^{[2, 12]}。树鼩(学名：Tupaia belangeri)，树鼩科树鼩属的动物，分布在东南亚各国。在中国大陆，分布于广西、海南、贵州、云南、四川、西藏等地，主要生活于热带和亚热带森林、灌丛、村落附近。该物种的模式产地在缅甸仰光附近。在遗传分类上，树鼩最早被划归为食虫目(Insectivora)，通过染色体涂色技术，国外学者提出将树鼩归为与灵长目(Primates)并列的攀缘目(Scandentia)树鼩科，并认为树鼩与灵长目动物有着较近的亲缘关系^{[7, 13-15]}。由于树鼩能够感染多种人类病毒且个体小、易于饲养，因此其作为多种人类疾病研究模型的可能性已受到广泛关注^{[4, 8, 16-18]}。

由于树鼩是介于食虫目和灵长目之间的代表，所以从事动物学研究的学者把它作为食虫目演化为灵长目的代表加以认真研究。更多的学者则在生态学、形态学、神经生理学、寄生虫学、齿学及生理代谢关系等方面进行了各种研究。树鼩大脑较发达，多用于神经系统方面的研究，如对大脑皮质的定位，嗅神经、纹状体颞皮质，小脑核闭的形态，小树鼩的小脑发育、视觉系统、神经血管的研究，神经节细胞识别能力，口腔黏膜感觉末稍研究，神经系统的多肽、应激等研究^{[9-10, 19]}。

消化系统方面用于进行胃黏膜、下颌牙床、胆石症的研究。泌尿系统方面用于交感神经对肾小球结构的作用，肾功能衰竭等研究。神经介质方面有作乙酰胆碱、5-羟色胺、肾素、血管紧张素等的研究。病毒方面作了隐性病毒如疱疹毒、腺病毒方面的研究。树鼩在自然条件或实验室条件下能感染人的疱疹病毒^{[16-17, 20-22]}。

中国对树鼩的研究早见于教研学和动物学方面，应用于医学方面较晚。1975年最先用于代替恒河猴作为小儿麻痹方面的试验未能成功。以后用于研究鼻咽癌EB病毒，初步取得某些结果，将EB病毒注进肠系膜淋巴结能使淋巴组织增生。用树鼩鼻黏膜细胞作培养后接种EB病毒取得较好的结果。树鼩作为甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的肝炎模型分别取得了一定的阳性结果。以树鼩作为轮状病毒的腹泻病理模型已获得成功。有些学者对树鼩24 h活动规律进行了观察。由于树鼩血中高度密度脂蛋白成份占血脂总量的60%-70%，比例较高，已用于探索抑制动脉粥样硬化发病机理的研究。此外还发现高胆固醇膳食下，容易形成胆结石，为高脂血时胆固醇排出途径提供客观依据。有人还用树鼩进行了化学的致癌，特别是黄曲霉毒素致肝癌的研究，计划生育的研究等^[23-27]。

总之树鼩是一种体小，繁殖快，易捕捉和饲育，进化程度高，新陈代谢比犬、鼠等动物更接近于人，大体解剖也近似于人，较价廉的灵长类动物，医学生物学的用途很高，已受到广大学者的重视。但是还存在一些问题，比较突出的是2013年使用的树鼩大多数为野生捕捉的，年龄及健康情况不详。中国虽有人在实验室繁殖成功，但量太少，不能满足实验室的应用。因而要把树鼩变为实验动物尚需作很大的努力，至于驯化，实验室大量繁殖，系统了解其正常生理指标，遗传背景及常见病的防治等还有待各个学科的共同努力。

作者通过多次western和ELISA的结果直观的表明，树鼩血清与抗兔、抗羊、抗人、抗小鼠、抗大鼠的二抗均不发生反应，但与抗猴的二抗有交叉反应。进一步证明了在树鼩做为一种全新的实验动物时，已有的二抗多数不能检测到树鼩血清中的IgG，只有抗猴的二抗与树鼩血清中的IgG有交叉反应，在用树鼩做动物模型前最好先制备检测树鼩IgG的单克隆或多克隆抗体。已有研究报道，进行了树鼩IgG的单克隆和多克隆抗体的制备，但现还没有标准化的树鼩IgG的二抗卖，因此有必要制备标准化的树鼩IgG的二抗。这将在树鼩做为疾病动物模型的研究中得到广泛应用。在目前还没有标准化的树鼩IgG的二抗卖时，抗猴的二抗可先做为替代，用于一些初步实验。抗猴的二抗与树鼩血清中的IgG有交叉反应可能是因为树鼩和猴都是灵长类动物，在起源上比较接近的原因。

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