糖尿病牙周炎昆明系模型小鼠牙周组织中脂联素的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂联素与牙周炎和2型糖尿病发病有密切关系。
目的：检测糖尿病牙周炎昆明系小鼠牙周组织中脂联素表达的变化及对牙周组织病理形态及预后的影响。
方法：将3周龄的昆明系小鼠按不同造模方式分随机为3组：对照组正常饲养，糖尿病组通过四氧嘧啶注射法建立2型糖尿病模型小鼠，糖尿病+牙周炎组采用牙周局部结扎联合涂菌建立牙周炎模型小鼠。
结果与结论：造模后20 d，糖尿病组小鼠血糖、空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数高于对照组(P < 0.05)。ELISA法、RT-PCR、western lot检测显示，造模1，3，6个月后，脂联素基因及蛋白的表达对照组>糖尿病组>糖尿病伴牙周炎组小鼠牙周组织中表达水平依次减弱(P < 0.05)。造模1，3，6个月后，取3组小鼠的牙周组织通过直接观察牙龈组织炎症变化及病理组织学检测显示，糖尿病伴牙周炎组小鼠牙周组织炎细胞浸润最明显、在糖尿病组部分小鼠可见中度牙龈组织炎症、对照组小鼠牙周组织未见炎细胞浸润。结果表明，糖尿病后牙周组织脂联素表达降低是牙周炎发病及加重的重要因素之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 口腔损伤及修复模型, 脂联素, 昆明系小鼠, 牙周炎, 2 型糖尿病, 牙周组织, 四氧嘧啶, 骨保护素, 体质量指数, 表达

Abstract:

BACKGROUND: Adiponectin and periodontal disease are closely related with type 2 diabetes.
OBJECTIVE: To detect the expression of adiponectin in periodontal tissue of Kunming mice of diabetes periodontitis, and explore the effects on periodontal tissue pathology and prognosis.
METHODS: Sixty 3-week-old Kunming mice were divided into three groups according to the different modeling methods: control group (normal feeding), diabetes group (diabetic model was established by injection of alloxan), diabetes and periodontitis group (periodontitis model was established by local ligation and bacteria developed). Each group contained 20 rats.
RESULTS AND CONCLUSION: At 20 days after modeling, the blood glucose, fasting insulin and insulin resistance index of mice in the diabetes group were higher than that in the control group (P < 0.05). ELISA, RT-PCR and western blot analysis results showed that, adiponectin gene and protein expression levels in periodontal tissues were the highest in the control group, then in the diabetes group, and the lowest in the diabetes and periodontitis group, at 1, 3, 6, months postoperatively, respectively (P < 0.05). The periodontal gum tissue inflammation and histopathological changes were observed at 1, 3, 6, months postoperatively. The results showed that, the inflammation in periodontal tissues was the most obvious in the diabetes and periodontitis group, and was visible in the diabetes group, but the inflammation was not present in the control group. Experimental findings indicate that, the down-regulation of adiponectin expression in the periodontal tissue is one of the important factors that trigger and aggravate the onset of periodontitis.

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Key words: Tissue Engineering, Adiponectin, Periodontitis, Diabetes

中图分类号:

R318

赵博，王永兰. 糖尿病牙周炎昆明系模型小鼠牙周组织中脂联素的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 721-726.

Zhao Bo, Wang Yong-lan . Expression of adiponectin in the periodontal tissue of Kunming mice with diabetic periodontitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 721-726.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 纳入小鼠60只，均进入结果分析，无死亡和感染，无脱失值。造模流程图见图1。

2.2 2型糖尿病模型小鼠血糖变化 检测小鼠注射四氧嘧啶后，不同时间段的血糖变化，并与对照组对比；结果显示，给药24 h后，小鼠血糖水平已高于正常值(6.7 mmol/L)；给药后10 d，血糖仍维持在较高水平，与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果见表2。

2.3 2型糖尿病模型小鼠空腹胰岛素水平(Fins)及胰岛素抵抗指数检测 检测小鼠注射四氧嘧啶后，不同时间段的空腹胰岛素水平(Fins)及胰岛素抵抗指数变化，并与对照组对比；结果显示，给药24 h后，小鼠空腹胰岛素水平(Fins)及胰岛素抵抗指数已高于正常水平；给药后10 d，仍维持在较高水平，与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果见表3。

2.4 脂联素对糖尿病牙周炎模型小鼠牙周组织学形态的影响 苏木精-伊红染色显示。糖尿病+牙周炎组牙周袋形成，上皮下固有层胶原纤维水肿变性，少量炎细胞浸润；牙周膜局部胶原纤维断裂，少量炎细胞浸润；牙槽骨表面可见活跃的破骨细胞和骨吸收陷窝(图2A)。糖尿病组牙周袋形成，周围少量炎细胞浸润；牙周膜胶原纤维致密，可见炎细胞浸润及活跃的骨吸收(图2B)。对照组未见牙周袋形成，未见炎细胞浸润及活跃的骨吸收(图2C)。

2.5 糖尿病牙周炎模型小鼠牙周组织总RNA的鉴定结果 通过Trizol一步法提取牙周组织总总RNA，分光光度计测定的A_{260 nm/280 nm}为1.7-2.0，A_{260 nm/230 nm}为1.5-1.9，证明所得RNA纯度较高，基本去除了蛋白质等的污染，可用于PCR的扩增。经1%甲醛变性的琼脂糖凝胶电泳结果可见28 S及18 S rRNA条带清晰可见，5 S rRNA条带模糊，同时28 S∶18 S=2∶1，表明总RNA的完整性好，基本无降解(图3)。

2.6 各组小鼠牙周组织PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像 PCR结果可见，造模1，3，6个月后，脂联素mRNA表达：在对照组>糖尿病组>糖尿病+牙周炎组(P < 0.05)，见图4，表4。

2.7 糖尿病+牙周炎模型小鼠不同时间牙周组织脂联素蛋白的表达 Western-Blot结果可见，造模1，3，6个月后，脂联素蛋白对照组>糖尿病组>糖尿病+牙周炎组(P < 0.05)，见图5，表5。

2.8 各组小鼠不同时间血浆脂联素蛋白的表达 造模1，3，6个月，血浆中脂联素蛋白表达：对照组>糖尿病组>糖尿病+牙周炎组(P < 0.05)，见表6 (P < 0.05)。

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引言

脂联素是由成熟脂肪细胞特异分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子，大量存在于血液循环中。近些年来研究发现，脂联素与冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、胰岛素抵抗、高脂血症、2型糖尿病和肥胖等疾病密切相关^[1-3]，脂联素是目前发现的对人体有保护作用的脂肪细胞特异分泌的激素蛋白。慢性牙周炎是一种发生在牙周支持组织的感染性疾病，主要表现为牙周局部软组织的破坏和骨组织的吸收，最后造成牙齿脱落，是严重危害人类健康的常见病和高发病，其中牙槽骨吸收是牙周炎的主要特征之一。近期研究表明脂联素可以激活核因子配体的受体和激活因子通路，抑制自然生成的护骨因子及核转录因子kB受体激活蛋白配体受体的生成，这提示脂联素可能对牙周炎的发生、发展产生影响。

糖尿病是以高血糖为主要特征，由遗传和环境因素共同作用引起的一组糖类、脂类和蛋白质代谢紊乱的临床综合征^[4-5]。近年来大量研究已趋向于证实：糖尿病和牙周炎存在双向关系，两者发病存在共同危险因素且互为高危因素。糖尿病会增加牙周炎的发病风险及严重程度，是牙周炎发生和发展的重要危险因素。

目前糖尿病和牙周病两者相互作用的机制备受关注，近来的研究发现RANKL/RANK/骨保护素系统在骨吸收机制中起重要作用；而糖尿病可引起全身性的骨代谢紊乱。牙周炎则引起局部的牙槽骨吸收, 因此糖尿病和牙周炎在骨代谢方面都与RANKL/RANK/骨保护素系统存在联系。血糖升高可导致组织修复和再生能力的降低，加重牙周炎症，这些炎症和感染，可以激活多种激素和细胞因子，这些激素和因子都可通过影响骨保护素和RANKL的表达来影响骨代谢^[6-8]。在牙周炎、肥胖和2型糖尿病之间，慢性炎症状态成为了其共同的病理机制之一。脂联素与牙周炎和2型糖尿病均有密切关系^{[5, 9-10]}。

实验采用建立糖尿病小鼠牙周炎动物模型的方法，研究脂联素的变化及牙周炎对人体炎症状态的影响，以及这种影响是否与人体的胰岛素有关，从而揭示牙周炎与2型糖尿病病变发生发展的关系。

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材料方法

设计：随机对照动物模型构建实验。

时间及地点：于2012年1月至2013年8月在天津医科大学内分泌研究所完成。

材料：

实验动物：选用的8周龄雄性昆明系小鼠60只，体质量为(20.1±0.9) g，由天津医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(津)2010- 0002。标准颗粒饲料喂养，自然昼夜光线照明，室内相对湿度40%-70%，室温保持于20-25 ℃。实验期间动物自由饮水、进食。

实验方法：

造模方法及分组：选用小鼠60只按不同造模方式随机分为3组：对照组，糖尿病组，糖尿病+牙周炎组，每组20只。

四氧嘧啶(Alloxan)注射法建立糖尿病模型小鼠：具体步骤：四氧嘧啶以55 mg/kg ×3 d分次尾静脉注射造成糖尿病模型小鼠。分别于给药24，72 h，给药10，20，30 d测定尾静脉血糖，以2次血糖值均大于16 mmol/L为标准诊断小鼠糖尿病，实验40只小鼠2次血糖值均高于此诊断标准，糖尿病小鼠模型造模成功^[3]。

牙周局部结扎联合涂菌建立牙周炎模型小鼠：腹腔注射体积分数10%水合氯醛(300-350 mg/kg)麻醉，取仰卧位，小鼠四肢与头固定于手术架，将小鼠舌牵出丝线捆绑固矩，以防止窒息。将3-0丝线分别结扎于左、右上颂第一、二磨牙牙颈部并尽量置于牙龈沟内，将浓度为10¹² CFU/L的4种标准菌混合悬液接种于牙龈沟内，每周检查丝线1次，有脱落者及时重新结扎。建模时间为8周。

血清中脂联素的检测：分别在造模成功后1，3，6个月，随机处死3组小鼠(每组各5只)处死前经心脏取血。具体步骤如下：称质量，体积分数10%水合氯醛(300-350 mg/kg)麻醉，诱导小鼠全麻；小鼠仰卧位固定，用手指触摸心脏搏动明显的位置，用拇指、食指、中指将心脏固定；右手持注射器，平行于胸腔的方向进针，针头向前下穿刺，边进针边轻微回抽，有血液回抽到注射器时，保持针头的位置，采集足够的血液(约3 mL)，放入无菌离心管中，每个离心管编号，与小鼠相对应。收集的血液室温下静置30 min，20 000 r/min离心10 min，取上清于EP管中，置于-80 ℃保存备用。用ELISA方法检测血清中脂联素的水平：收齐标本后检测脂联素的浓度，酶标板分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔加样品稀释液100 µL，余孔分别加样品于酶标板底部，轻轻晃动摇匀，酶标板加上覆膜，37 ℃反应120 min；弃去液体，甩干，每孔加检测溶液A工作液100 µL，37 ℃，60 min；温育60 min后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，350 µL/孔，甩干；每孔加检测溶液B工作液100 µL，37 ℃，60 min；温育60 min后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，350 µL/孔，甩干；依序每孔加底物溶液90 µL，37 ℃避光显色，当标准品出现明显的梯度蓝色，依序每孔加终止溶液50 µL；用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度值(A)。用标准品的浓度与A值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的A值代入方程式，计算出待测样品的浓度。

组织学切片制备及苏木精-伊红染色：将处死的小鼠头部软组织和骨组织分离，取小鼠右下颌骨固定于中性甲醛48 h，体积分数15%EDTA(乙二胺四乙酸二钠)中性甲醛溶液脱钙4周，每隔4 d换1次脱钙液，常规脱水，石蜡包埋，沿第一磨牙近远中矢状面切成5 μm厚切片，每个样本取牙周结构完整切片进行苏木精-伊红染色，光镜观察。

半定量反转录聚合酶链式反应(Semiquantitate Reverse Transcription- polymerase Chain Reaction， SQRT-PCR)：从小鼠牙周组织中提取总RNA，反转录为cDNA。按相关文献刊登的引物序列登陆Genebank网站核对引物的正确性。以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因。确定电泳检测分离的该寡核苷酸片段和内参mRNA条带位置的正确性后，采用凝胶成像分析系统测定目的基因与内参吸光度值的灰度和比例，以此数值代表该基因的相对表达含量，目的基因引物设计及长度见表1。

Westem blot检测脂联素蛋白的表达：离心收集PCR，提取总蛋白。采用BioRad公司的垂直电泳装置电泳并转膜。杂交按KPL公司的Western Blot KitBCIP/NBTSystem说明进行。封闭向转移好的PVDF膜中加入适量体积分数5%脱脂奶粉，37 ℃摇床中1 h；一抗弃去脱脂奶粉，加入1∶800稀释的抗脂联素抗体(采用脱脂奶粉稀释)。37 ℃摇床中2 h；清洗弃去一抗，加入适量TBST，摇床上10 min，共3次；二抗加入适当1∶200稀释的羊抗兔IgG-HKP二抗(二抗采用脱脂奶粉稀释)。37 ℃摇床中1 h；清洗弃去二抗，加入适量TBST，摇床上10 min，共3次；化学发光、显影定影。凝胶图象分析：将胶片进行扫描后，采用凝胶分析软件Bandscan 5.0对目标条带的吸光度值(脂联素/ β-actin)进行分析。

主要观察指标：各组脂联素基因及蛋白的表达。

统计学分析：数据以x(_)±s表示, 由第一作者采用SPSS 15.0统计学软件采用完全随机设计的单因素方差分析法和q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脂联素也称为脂肪组织基因表达中最丰富的蛋白质产物之一；在血循环中大量存在^[11-14]。大多数细胞实验中表明，脂联素在对于促进骨代谢方面具有积极的作用^[15-18]。研究人员同时在人类的原代培养的成骨细胞中观察到了AdipoR1及Ad-ipoR2的表达，AdipoR1在对鼠成骨细胞系 MC3T3-E1中同样也有表达，表明了成骨细胞可以表现脂联素以及其受体，也可能通过旁分泌或者内分泌对成骨细胞产生的影响。脂联素分子和肿瘤坏死因子的家族成员肿瘤坏死因子α和RANKL和RANK以及骨保护素都具有结构的同源性，可通过调节这些因子从而影响破骨细胞的数量以及功能^[19-23]。近些年来骨生物学的重要发现是骨保护素/RANKL/RANK系统：成骨前体细胞/间质细胞表面表达RANKL和破骨前体细胞表面上的RANK结合，促进了破骨细胞的增殖、分化以及成熟。而骨保护素与RANKL的结合阻断了上述作用，抑制了对破骨细胞的形成。有研究的报道对脂联素通过AdipoR1/p38MAPK的信号转导途径诱导了成骨细胞RANKL的表达，抑制了骨保护素的表达，从而经过上述骨保护素/RANKL/RANK系统间接的诱导了破骨细胞的生成^[24]。而Yamaguchi等通过荧光分析的表明牙周病患者的脂多糖/RANKL介导了破骨细胞的型成，脂联素对通过阻断RAW264细胞Toll样受体介导的核转录因子kB的活化，抑制破骨细胞的形成。Oshima等发现了重组脂联素可以抑制单核细胞的集落刺激因子(M-CSF)以及RANKL对于破骨细胞的诱导和分化作用，抑制了CD14⁺的人外周血单核细胞分化成为破骨细胞，同样抑制破骨细胞的骨吸收活性。综上所述，脂联素对于破骨细胞得作用极有可能是双向的。上述体内外基础的研究表明，脂联素通过对于抑制破骨细胞的分化以及活性，刺激了成骨细胞的分化和增加骨基质的矿化，增加了骨量。

牙周炎是和龋病并列的两大口腔疾病之一，其危害在于造成牙体的松动脱落，和破坏咀嚼器官的完整性，引起面部形象和发音、功能的变化。糖尿病可以加重牙周炎和牙周组织破坏，在糖尿病条件下的牙周炎骨丧失显著增加。糖尿病有可能通过促进在炎症部位破骨细胞而生成，从而增强骨吸收，促进了牙周炎骨丧失。同时糖尿病也被证实为牙周疾病的独立的危险因素，存在的微循环障碍可以使组织局部缺氧缺血、其牙周组织修复能力降低、也为细菌繁殖加速从而引发以及加重牙周炎症。糖尿病治疗的及时，血糖控制的良好，牙周炎即可随之减轻；反之，会伴发重度牙周炎和难治性牙周炎；并且，牙周炎的发生往往更会进一步加重糖尿病得病情。牙周状况控制好的话则血糖控制相对比较良好，糖尿病病情久比较稳定。反之，则难以有效的降低血糖，容易使病情恶化，严重的还会引起各种并发症，从而成为不可逆性的改变，严重的会导致患者病残或死亡。近几年来，牙周炎已经被认为是糖尿病第6大并发症，糖尿病患者的防御和修复机制的降低，并会导致牙周病易患和病情的加重；牙周病的患者通过细菌毒素等诱导炎症因子的产生、血糖升高，促使糖尿病的发生。在过去的几年里，糖尿病已经发展成一组全球性的常见性疾病，常常伴发心血管的并发症，给患者的生活带来很大负担。近年来的大量研究已趋向于证明：牙周炎和糖尿病存在双向的关系，两者的发病存在于共同的危险因素而且互为高危因素。而糖尿病会增加牙周炎的发病的风险以及严重程度，是牙周炎的发生和发展的重要的危险因素。在目前糖尿病和牙周炎两者相互作用的机制倍受关注，近来的研究发现了RANKL/RANK/骨保护素的系统在骨吸收机制中起重要的作用；而糖尿病可以引起全身性骨代谢紊乱。而牙周炎则会引起局部的牙槽骨的吸收，因此牙周炎和糖尿病在骨代谢的方面都与RANKL/RANK/骨保护素的系统存在着联系。血糖的升高可以导致组织的修复和再生的能力降低，从而加重牙周的炎症，这些炎症和感染，都可以激活多种的激素和细胞因子，而这些激素和因子却都可通过影响骨保护素以及RANKL的表达从而影响骨代谢。大量的流行病学研究证实了牙周炎与肥胖的关系，纵向的临床研究也表明了牙周炎的发展和体质量指数的增加有关系，并使糖尿病患者的糖化血红蛋白控制不佳。在牙周炎，2型糖尿病和肥胖之间，慢性的炎症状态成为了其共同病理机制之一。