相关转录组分析鉴定色素沉着绒毛结节性滑膜炎的潜在生物标志物

doi:10.12307/2023.424

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (14): 2182-2193.doi: 10.12307/2023.424

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

Identification of potential biomarkers of pigmented villonodular synovitis by transcriptome analysis

Liu Yuan1, Liang Xuezhen1, 2, Xu Bo1, 2, Liu Jinbao1, 2, Li Gang1, 2

1Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2022-06-06 Accepted:2022-07-12 Online:2023-05-18 Published:2022-09-30
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Liu Yuan, Master, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81774333 (to LG); Shandong Province Traditional Chinese Medicine Classic Prescription Cooperative Innovation and Opening Project, No. 2019KFY17 (to XB); Shandong Provincial Key R&D Program, No. 2016GSF202022 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转录组分析：是目前应用最广的高通量测序分析技术之一，常见设计是不同样品之间比较，寻找差异基因、标志基因、协同变化基因，并进行结果可视化、功能注释和网络分析等，转录组狭义上指所有mRNA的集合。
生物标志物：是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

背景：色素沉着绒毛结节性滑膜炎是一种罕见的滑膜炎性病变，早期诊断缺乏相关生物标志物，mRNA已被证实参与了疾病的发生发展，但其作用机制尚不清楚。
目的：通过生物信息学及相关转录组分析鉴定色素沉着绒毛结节性滑膜炎的潜在生物标志物和发病机制，以用于疾病鉴别诊断。
方法：通过GEO数据库检索与色素沉着绒毛结节性滑膜炎相关的滑膜组织微阵列数据集，并用NetworkAnalyst分析鉴定差异表达基因(P < 0.05)。使用疾病数据库检索与色素沉着绒毛结节性滑膜炎相关的基因，并与差异表达mRNA取交集得到最终差异表达基因。利用BioGPS对特异性基因进行组织/器官定位。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，KOBAS 3.0和GSEA 4.1.0对差异表达基因进行富集分析，并运用多重计算方法鉴定核心基因。利用Cytoscape构建竞争性内源性RNA(CeRNA)网络。GEO数据集验证了具有较高诊断价值的生物标志物。此外，通过Xcell网站分析64种免疫细胞和基质细胞的浓度，并计算丰度分数。
结果与结论：在GSE175626数据集中共鉴别出2 546个差异表达基因，包括2 317个差异mRNA和229个差异长链非编码RNA。与疾病数据库中的相关基因取交集后最终得到70个差异表达基因，其中60个被BioGPS识别。与骨性关节炎患者相比，GO和KEGG富集分析显示，色素沉着绒毛结节性滑膜炎患者的差异表达基因主要参与炎症、细胞增殖、血管生成和免疫反应等方面。CytoHubba筛选出15个核心基因，MCODE识别出4个基因簇模块。GEO数据集验证了12个差异性表达核心基因。免疫与基质细胞去卷积分析发现12个核心基因与部分免疫细胞均有密切关系。结果表明：IL-6、TNF、CD163、KRAS、FN1、HMOX1、GAPDH、IL1B、PTPRC、MAPK1、CCR2、NFKBIA可能是色素沉着绒毛结节性滑膜炎诊断的潜在生物标志物。SNHG14-hsa-miR-206-FN1和XIST-hsa-miR-107-HMOX1/CD163可能是调节色素沉着绒毛结节性滑膜炎疾病进展的潜在RNA途径。

https://orcid.org/0000-0001-8961-4743(刘源)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 色素沉着绒毛结节性滑膜炎, 生物标志物, 组织/器官特异性表达, RNA调节途径, 去卷积分析

Abstract: BACKGROUND: Pigmented villonodular synovitis is a rare synovial inflammatory disease. There is no relevant biomarker for early diagnosis. Messenger RNA (mRNA) has been confirmed to be involved in the occurrence and development of the disease, but its mechanism is not clear.
OBJECTIVE: To identify the potential biomarkers and pathogenesis of pigmented villonodular synovitis by bioinformatics and related transcriptome analysis for differential diagnosis of the disease.
METHODS: The microarray data set of synovial tissue associated with pigmented villonodular synovitis was searched by GEO database, and the differentially expressed genes were identified by NetworkAnalyst analysis (P < 0.05). The genes related to pigmented villonodular synovitis were searched in the disease database, and the differentially expressed genes were obtained by overlap with differentially expressed mRNAs. Tissue/organ localization of specific genes was carried out by BioGPS. The protein-protein interaction network was constructed by STRING database. The differentially expressed genes were enriched and analyzed by KOBAS3.0 and GSEA4.1.0, and the hub genes were identified by multiple computing methods. Cytoscape was used to build competitive endogenous RNA network. GEO dataset validated the biomarkers with high diagnostic value. In addition, the concentrations of 64 kinds of immune cells and stromal cells were analyzed by Xcell website, and the abundance fraction was calculated.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 2 546 differentially expressed genes were identified in the GSE175626 dataset, including 2 317 differentially expressed mRNA and 229 differentially expressed lncRNA. After intersection with the related genes in the disease database, 70 differentially expressed genes were obtained, 60 of which were identified by BioGPS. Compared with patients with osteoarthritis, GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes in patients with pigmented villonodular synovitis were mainly involved in inflammation, cell proliferation, angiogenesis, and immune response. Fifteen hub genes were determined by CytoHubba and four gene cluster modules were identified by MCODE. Twelve heterosexual hub genes were verified by GEO dataset. Immune and stromal cell deconvolution analysis showed that 12 hub genes were closely related to some immune cells. Overall, IL-6, TNF, CD163, KRAS, FN1, HMOX1, GAPDH, IL1B, PTPRC, MAPK1, CCR2, and NFKBIA may be potential biomarkers for the diagnosis of pigmented villonodular synovitis. SNHG14-hsa-miR-206-FN1 and XIST-hsa-miR-107-HMOX1/CD163 may be potential RNA pathways to regulate the progression of pigmented villonodular synovitis.

Key words: pigmented villonodular synovitis, biomarker, tissue/organ specific expression, RNA regulatory pathway, deconvolution analysis

中图分类号:

刘源, 梁学振, 许波, 刘金豹, 李刚. 相关转录组分析鉴定色素沉着绒毛结节性滑膜炎的潜在生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2182-2193.

Liu Yuan, Liang Xuezhen, Xu Bo, Liu Jinbao, Li Gang. Identification of potential biomarkers of pigmented villonodular synovitis by transcriptome analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(14): 2182-2193.

图/表（结果） 13

2.1 数据的预处理和差异基因的筛选原始数据集归一化后PCA分析如图2A所示。GSE175626中包括3个PVNS样本和3个骨性关节炎样本，通过NetworkAnalyst共筛选出2 546个差异基因，其中包括2 317个差异表达mRNA和229个差异表达lncRNA。有929个基因在PVNS患者中表达上调，1 388个基因在PVNS患者中表达下调。使用Hiplot(https://hiplot.com.cn/)绘制热图和火山图将这些差异基因进行可视化，见图2B，C。

2.2 最终差异mRNA的获取通过TTD、OMIM、GeneCard、DrugBank和DisGeNET数据库分别检索到与PVNS相关的基因为5，83，402，35和15个。去除重复之后共得到539个基因，与数据集得到的差异mRNA取交集后得到最终差异基因70个。
2.3 组织/器官特异性表达基因的鉴定通过BioGPS共确定了60个组织/器官特异性表达基因，见表1。进一步分析发现大多数基因在血液/免疫系统中特异性表达，共有20个基因(20/60，33.33%)；骨骼/肌肉系统共包含了12个特异性表达基因 (12/60，20.00%)，其次为神经系统(7/60，11.67%)、呼吸系统(5/60，8.33%)、消化系统(5/60，8.33%)、内分泌系统(3/60，5.00%)、胎盘(2/60，3.33%)；而生殖系统、泌尿系统、免疫器官、胎儿器官以及舌和脂肪组织所包括的特异性表达基因最少(1/60，1.67%)。

2.4 富集分析使用GSEA 4.1.0进行功能富集分析，将原始基因表达谱上传到GSEA中，背景基因集分别设定为c5(c5.all.v7.4 symbols. gmt)和c2(c2.cp.kegg.v7.4 symbols. gmt)，在总体水平上对原始表达谱进行GO和KEGG分析，P < 0.05为差异有显著性意义。通过观察结果发现，GSE175626数据集中基因表达主要涉及免疫与炎症相关因子通路(如IL-7、TNF、Toll样受体、B细胞等)以及肿瘤相关通路(如腺癌、TNF、JAK-STAT等)，见图3。

随后，运用KOBAS 3.0对差异表达mRNAs进行GO、KEGG和反应途径的富集分析，q < 0.05为条件，筛选出富集显著的GO条目和功能途径。结果显示，差异表达mRNA的GO富集分析中，生物过程(Biological process，BP)主要涉及炎症反应与调控、血管生成、细胞因子介导的信号通路、凋亡过程的负调控、细胞群增殖的正调控等，根据q < 0.05筛选出前10个GO条目绘制弦图和圈图可视化，见图4。KEGG通路富集分析显示，差异表达mRNA主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、类风湿性关节炎以及IL-17信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路等免疫与炎症相关信号通路有关。反应途径表明差异表达mRNA主要富集在免疫系统中的细胞因子信号转导以及白细胞介素信号转导等途径。

根据q < 0.05，筛选前10个KEGG通路和前10个反应途径绘制气泡图。为了进一步了解KEGG富集情况，将KEGG通路数据上传到Omicshare平台进行整合分析，根据富集在每种类型每个通路上不同数量的基因，按照上调基因与下调基因比例绘制气泡图与圈图，见图5。

2.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建与核心基因的鉴定蛋白-蛋白相互作用网络包含52个节点和211条边，平均节点度值为8.16，通过Cytoscape进行可视化，见图6A。根据筛选标准，使用MCODE识别出4个蛋白模块，见图6B-E。模块1的聚类得分最高，得分为5.429，包含8个节点和19条边；模块2得分为4.364，包含12个节点和24条边；其次，模块3和模块4的聚类得分相同，均为4.000，模块3包含5个节点和8条边，模块4包含4个节点和6条边。随后，使用CytoHubba通过MCC、MNC、Degree和Closeness等4种计算方法来筛选出前15个核心基因，见图6F。

PVNS滑膜样本中组织/器官特异性表达基因的鉴定可能有助于PVNS发病机制中关键靶点的发现。为了深入了解核心基因在组织/器官中的表达情况，将筛选得到的15个核心基因与基因表达量较为明显的血液/免疫与骨骼/肌肉系统中的特异性表达基因取交集，最终获得12个血液/免疫与骨骼/肌肉系统的特异性表达核心基因，见表2，包括KRAS、FN1、GAPDH、IL1B、IL6、PTPRC、TNF、MAPK1、CD163、CCR2、NFKBIA、HMOX1。这些基因是蛋白-蛋白相互作用网络中最重要的基因，可能在PVNS的发病机制中起重要作用。

2.6 诊断相关核心基因与浸润性免疫细胞和基质细胞的相关性分析通过xCell获取到每个样本中64种免疫细胞和基质细胞的丰度分数。PCA聚类分析结果显示，两组间免疫细胞和基质细胞浸润有显著差异，见图7A。通过进一步观察发现，与骨性关节炎组相比，PVNS组脂肪细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、CD4+T细胞、CD4+Tcm、CD4+Tem、CD4+记忆性T细胞、CD8+T细胞、CD8+Tcm、CD8+Tem以及软骨细胞相对较多，见图7B。

Spearman相关分析表明，见图8，IL-6、TNF与Macrophages M2(r=0.941，P=0.005)、cDC(r=0.928，P=0.008)、NKT(r=0.880，P=0.021)等呈正相关，与Tregs(r=-0.841，P=0.036)、GMP(r=-0.880，P=0.021)等呈负相关。CD163与CD4+Tem(r=0.986，P=0)、祖B细胞(r=0.941，P=0.005)、Th1细胞(r=0.845，P=0.034)、B细胞(r=0.845，P=0.034)呈正相关，与Plasma细胞(r=-0.820，P=0.046)、Adipocytes(r=-0.880，P=0.021)等呈负相关。CCR2与巨噬细胞M2(r=0.941，P=0.005)、自然杀伤T细胞(r=0.880，P=0.021)等呈正相关，与脂细胞、神经元等呈负相关(r=-0.880，P=0.021)。FN1与Macrophages M2(r=0.941，P=0.005)、cDC(r=0.928，P=0.008)等呈正相关，与Osteoblast(r=-0.880，P=0.021)、GMP(r=-0.880，P=0.021)等呈负相关。GAPDH与Macrophages M2(r=0.893，P=0.016)、CD4+Tem(r=0.897，P=0.015)、pro B细胞(r=0.893，P=0.016)成正相关，与Fibroblasts(r=-0.832，P=0.04)、Megakaryocytes(r=-0.832，P=0.04)等呈负相关。HMOX1与CD4+Tem(r=0.928，P=0.008)、Macrophages M2(r=0.880，P=0.021)等呈正相关，与Plasma细胞(r=-0.820，P=0.046) 、Fibroblasts(r=-0.986，P=0)等呈负相关。IL1B与Macrophages M2(r=0.880，P=0.021)、NKT(r=0.880，P=0.021)等呈正相关，与MEP(r=-0.833，P=0.039)、Megakaryocytes(r=-0.894，P=0.016)等呈负相关。KRAS与NKT(r=0.941，P=0.005)、aDC(r=0.845，P=0.034)等呈正相关，与Endothelial细胞(r=-0.941，P=0.005)、Chondrocytes(r=-0.845，P=0.034)等呈负相关。MAPK1与CD4+Tcm(r=0.845，P=0.034)、NKT(r=0.880，P=0.021)等呈正相关，与Preadipocytes(r=-0.829，P=0.042)、Megakaryocytes(r=-0.880，P=0.021)等呈负相关。NFKBI与Hepatocytes(r=0.941，P=0.005)、CD8+Tcm(r=0.841，P=0.036)等呈正相关，与Adipocytes、Neurons等呈负相关(r=-0.880，P=0.021)。PTPRC与NKT(r=0.941，P=0.005)、CD8+Tcm(r=0.928，P=0.008)等呈正相关，与MEP(r=-0.833，P=0.039)、Megakaryocytes(r=-0.880，P=0.021)等呈负相关。

2.7 特异性表达核心基因的验证选取GSE176133数据集(包含3个PVNS样本和3个骨性关节炎样本)来验证12个特异性表达核心基因。用Omicshare进行统计分析，采用t检验统计分析并绘制箱线图，见图9。统计结果与预测一致，PVNS样本中的12个特异性表达核心基因表达水平显著高于骨性关节炎样本中核心基因的表达水平(P < 0.05)。使用IBM SPSS (v26.0)对GSE176133中PVNS样本和骨性关节炎样本的12个特异性表达核心基因表达谱进行ROC分析，并绘制ROC曲线。ROC曲线下与坐标轴围成的面积被定义为Area Under Curve(AUC)。AUC越接近1.0，检测方法真实性越高；等于0.5时，则真实性最低，无应用价值[37]。通过分析结果发现，与骨性关节炎样本相比，这12个特异性表达核心基因在PVNS样本中具有较高的诊断价值。其中，TNF、IL-6、CCR2、GAPDH、HMOX1在PVNS样本中的诊断价值相对较高(AUC：1.000)，其他核心基因对PVNS的诊断价值分别为：CD163(AUC：0.889)、FN1(AUC：0.778)、IL1B(AUC：0.889)、KRAS(AUC：0.778)、MAPK1(AUC：0.667)、NFKBIA(AUC：0.778)、PTPRC(AUC：0.889)，见图10。由于它们在PVNS样本中表现出良好诊断性能，因此，根据目前的样本，推测这12个特异性表达核心基因可能是诊断PVNS的生物标志物。

2.8 miRNA-mRNA网络及ceRNA网络构建通过ENCORI、miRDB、miRTarbas、TargetScan和miRcode5个在线miRNA数据库来预测差异表达mRNA的靶向miRNAs，选择至少存在于4个数据库中的miRNAs作为靶向miRNAs。最终得到22个miRNA，见图11A。使用Cytoscape构建miRNA-mRNA共表达网络，该网络共包含87个节点和581条边，见图11B。

ceRNA 假说揭示了一种 RNA 间相互作用的新机制，miRNA作为一个转录后调控的重要因子，其活性可被 lncRNA通过“海绵”吸附的方式调控ceRNA。lncRNA作为ceRNA竞争性地与miRNA结合影响miRNA的功能，从而调节编码基因的蛋白质水平，参与靶基因的表达调控。使用ENCORI数据库预测与差异表达lncRNA相互作用的miRNA，筛选条件设定为：human，hg19基因组，high stringency≥3。最终获得3 676个miRNA-lncRNA对，运用Cytoscape软件构建lncRNA-miRNA表达网络。在 Cytoscape 软件中将miRNA-mRNA和IncRNA-miRNA表达网络合并，借助其“merge”功能得到IncRNA-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA调控网络，见图12A。根据ceRNA假说，检索了大量文献发现，PVNS相关RNA研究较少，但PVNS相关ceRNA网络中包含的hsa-miRNA-206在骨性关节炎组织和软骨细胞中显著升高，并明显抑制软骨细胞增殖，促进细胞凋亡[38]。此外，hsa-miR-206已确定为多种肿瘤疾病中的重要抑制基因[39]。另一个包含在网络中的hsa-miR-107已被证明可抑制细胞增殖并调节脂质代谢和免疫炎症过程[40]。hsa-miR-107在骨性关节炎软骨细胞中的表达水平明显低于正常软骨细胞，miR-107的过表达可以抑制骨性关节炎软骨细胞的凋亡[41]。选取hsa-miR-206和hsa-miR-107建立子网络进一步分析，见图12B，C。根据mRNA、miRNA和lncRNA之间的上下调关系，作者认为SNHG14-hsa-miR-206-FN1和XIST-hsa-miR-107-HMOX1/CD163可能是调节PVNS疾病进展的潜在RNA调控途径。

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引言

色素沉着绒毛结节性滑膜炎(pigmented villonodular synovitis，PVNS)是一种以滑膜炎症和富含脂质的巨噬细胞、多核巨细胞、含铁血黄素沉积为特征的罕见的滑膜增生性病变，目前病因仍不明确[1-4]。早期的流行病学研究显示PVNS年发病率为1.8例/百万[5]。PVNS通常是单关节发病，主要影响膝关节，累及关节滑膜、法氏囊、肌腱鞘和肌腱附近的纤维组织[6-8]。临床常表现为关节的无痛肿胀或轻度疼痛伴肿胀，偶尔可以出现急性的关节疼痛和肿胀，患者还可能出现关节绞锁等症状[7-9]。根据其生长方式和临床表现形式将PVNS分为局部结节型和弥漫型，其中弥漫型更具有侵袭性[1-2，10]。PVNS最早被认为是一种肿瘤过程，因为其弥漫性增生能够侵袭周围关节和软组织，以及手术切除后有较高的复发率[2，5，11-12]。然而，1941年JAFFE等[13]提出了滑膜炎症的病理实体，从而将焦点从肿瘤性过程转移到炎性过程。

目前，PVNS的诊断缺乏有效的生物标志物，早期常伴有关节血性积液，致使一些观察者认为此症是一种血管异常性疾病，对PVNS的诊断造成困难。已有研究显示，一些生物标记物，如CD163、肿瘤坏死因子和白细胞介素6可能对PVNS的诊断有意义[14-16]。但是这些生物标志物与PVNS的临床相关性尚不清楚，且未用于临床诊断。因此，寻找新的有效的生物标志物对PVNS的诊断和治疗具有重要意义。

生物信息学、RNA测序(RNA-seq)和微阵列数据分析已广泛应用于各种疾病，包括肿瘤、关节炎等，通过对微阵列以及RNA-seq数据的分析来确定新的疾病生物标志物用于改善诊断和治疗[17-19]。此外，竞争性内源性RNA(competitive endogenous，ceRNA)网络可以阐明生物学功能在病理和生理相关过程中的作用以及调控疾病发生发展的新路径[20]。该研究利用NetworkAnalyst对PVNS相关数据集进行处理筛选差异基因，并与疾病数据库获取的PVNS相关基因取交集，得到最终差异基因。蛋白-蛋白相互作用网络筛选核心靶点并使用RNA-seq数据集进行验证。Cytoscape软件构建mRNA-MicroRNA(miRNA)共表达网络和ceRNA网络。此外，使用xCell网站对64种免疫细胞和基质细胞进行富集分析并计算丰度分数。该研究从转录组水平上揭示了PVNS的发生机制，并为PVNS的早期诊断和治疗提供了潜在的生物标志物以及生物途径。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学及转录组分析，外部数据集交叉验证。
1.2 时间及地点 2022年4-5月在山东中医药大学第一临床医学院中医骨伤教研室完成。
1.3 数据的获取该研究的工作流程如图1所示。从Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中下载与PVNS相关的数据集[21]，筛选标准包括：研究对象为“智人”；样本为关节滑膜组织；数据集信息完整且样本量不少于4个。最终获得2个数据集，包括GSE175626(GPL13825平台，Arraystar Human LncRNA microarray V2.0)和GSE176133(GPL17303，Ion Torrent Proton)，GSE175626纳入了3个PVNS滑膜样本和3个骨性关节炎滑膜样本，作为测试集。GSE176133同样纳入了3个PVNS滑膜样本和3个骨性关节炎样本，作为验证集。

1.4 数据预处理与差异基因的筛选 NetworkAnalyst(https://www.networkanalyst.ca/)是一个用于基因表达分析的综合网络可视化分析平台[22]，通过NetworkAnalyst对数据集进行背景校正和归一化处理，分析并鉴定PVNS与骨性关节炎之间的差异基因，通过Benjamini-Hochberg程序计算的假发现率(FDR)和基于Limma算法的调节t检验，将P的阈值调整为P < 0.05。差异基因的筛选条件为log2(倍数变化) > 1或< -1，调整P值(Q值) < 0.05。
1.5 PVNS相关靶点预测与最终差异表达mRNA获取在Therapeutic Target Database(TTD)、Online Mendelian Inheritance In Man(OMIM)、GeneCard、DrugBank及DisGeNET数据库[23-27]，以“pigmented villonodular synovitis”为关键词，规定物种为“Homo Sapiens”，检索与PVNS相关靶点。将得到的靶点整理后删除重复值，与NetworkAnalyst分析获得的差异RNA取交集，得到最终差异表达RNA。
1.6 组织/器官特异性表达基因的鉴定通过BioGPS(http://biogps.org)来分析差异表达mRNA在组织/器官中的分布情况以及特异性表达[28]。筛选条件包括：①在单个器官系统中表达量为中位数的10倍以上；②均基于GeneAtlas U133A，gcrma数据库。符合筛选条件的基因被认为是组织/器官特异性表达基因。
1.7 蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建与分析将最终得到的差异表达mRNA输入STRING数据库(https://string-db.org)[29]，设定minimum required interaction score为高等置信度(得分> 0.7)，构建蛋白-蛋白相互作用网络。下载“tsv”格式文件，将其导入Cytoscape中，运用Cytoscape软件(v3.7.2)进行网络优化。使用Molecular Complex Detection (MCODE)对蛋白-蛋白相互作用网络进行模块分析(设定条件：Degree Cutoff=2，Node score Cutoff=0.2，k-score=2，Max.Depth=100)[30]，获取有意义的蛋白模块和聚类得分。Cytoscape插件CytoHubba鉴定核心基因[31]。通过Maximal Clique Centrality (MCC)，Maximum Neighborhood Component (MNC)，Degree和Closeness等4种计算方法来筛选出前15个核心基因[31]。
1.8 基于GSEA和KOBAS的富集分析 GSEA是一种针对全基因组表达谱芯片数据的分析方法，将基因与预定义的基因集进行比较。通过分析基因表达谱数据，了解它们在特定的功能基因集中的表达状况，以及这种表达状况是否存在某种统计学显著性[32]。使用GSEA 4.1.0进行功能富集分析，背景基因集分别设定为c5(c5.all.v7.4 symbols. gmt)和c2(c2.cp.kegg.v7.4 symbols. gmt)。KOBAS是一种广泛使用的基因富集(GSE)分析工具，运用KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/genelist/)对差异表达mRNAs进行GO、KEGG和反应途径的富集分析[33]，以调整后P值(Q值)< 0.05为条件，筛选出富集显著的GO条目和功能途径。
1.9 浸润性免疫细胞和基质细胞与诊断相关核心基因的相关性分析将芯片数据集上传到xCell中 (https://xcell.ucsf.edu/) [34]，对64种免疫细胞和基质细胞进行富集分析并计算丰度分数。然后，利用R软件中“ggplot2包”对免疫细胞和基质细胞矩阵数据的浸润情况进行PCA聚类分析，并绘制PCA聚类图。PCA是最简单的以特征量分析多元统计分布的方法[35]。为了更好地观察免疫细胞和基质细胞浸润的区别，借助ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)生成相关丰度堆积柱状图。通过IBM SPSS (v26.0)软件进行浸润性免疫细胞和基质细胞与诊断相关核心基因的Spearman相关分析，并使用Bioinformatics online tools(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。P < 0.05为差异有显著性意义。
1.10 统计分析与验证使用Omicshare online tools(https://www.omicshare.com/)进行统计分析。采用t检验分析两组样本间的差异并绘制箱线图。使用IBM SPSS (v26.0)分析数据并绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)。
1.11 靶向miRNA的预测及miRNA-mRNA网络构建使用5个在线miRNA数据库来预测差异表达mRNA的靶向miRNAs，即ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarbase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRcode(http://www.mircode.org/)，选择至少存在于4个数据库中的miRNAs作为靶向miRNAs。利用Cytoscape构建miRNA-mRNA共表达网络。ENCORI数据库预测与差异表达lncRNA相结合的miRNA[36]，构建lncRNA-miRNA表达网络。在 Cytoscape 3.7.2中将miRNA-mRNA和IncRNA-miRNA表达网络合并，借助其“merge”功能得到IncRNA-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA调控网络。

讨论

PVNS是一种罕见的良性病症，具有侵袭性，对关节和软组织造成破坏从而影响肢体功能[42]，其发病隐匿，症状通常在诊断前存在多年[43]。然而，PVNS的诊断缺乏有效的生物标志物，早期PVNS很难诊断，因此寻找有效的生物标志物对PVNS的诊断和治疗具有重要意义。该研究通过比较PVNS和骨性关节炎滑膜样本中表达的基因，共筛选出2 546个差异基因，其中包括2 317个差异表达mRNA和229个差异表达lncRNA。使用5个疾病数据库检索到与PVNS相关的基因539个，与差异表达mRNAs取交集后得到最终差异基因70个。通过BioGPS共鉴定出60个组织/器官特异性表达基因。GSEA对于全基因的GO和KEGG富集分析显示，大多数基因富集在免疫与炎症相关因子参与的生物过程和通路上。差异表达mRNAs的GO分析结果显示，生物过程主要涉及炎症反应与调控、血管生成、细胞因子介导的信号通路、凋亡过程的负调控、细胞群增殖的正调控等，而KEGG通路富集分析表明，差异表达mRNA主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、类风湿性关节炎以及IL-17信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路等免疫与炎症相关信号通路有关。反应途径则表明差异表达mRNA主要富集在免疫系统中的细胞因子信号转导以及白细胞介素信号转导等途径。

使用xCell获取到每个样本中64种免疫细胞和基质细胞的丰度分数，并通过PCA聚类分析发现两组间免疫细胞和基质细胞浸润有显著差异。随后，通过Spearman相关分析来观察诊断相关核心基因与浸润性免疫细胞和基质细胞的相关性。结果表明，12个特异性表达核心基因与CD4+Tem、CD4+Tcm、CD8+Tcm、NKT、Th1 cells等免疫细胞均具有较为密切的联系。既往研究表明，IL-6可以通过靶向 CD4+Tem细胞抑制NKT细胞，从而预防T细胞介导的炎症，其机制主要是通过抗凋亡蛋白的诱导[44]。而该研究中IL-6与NKT(r=0.880，P=0.021)呈正相关关系，这与前期研究相符合。TNF在体内免疫反应期间向CD4+Tem、CD8+Tcm等细胞提供刺激信号，促进免疫炎症过程[45]。此外有研究显示，使用TNF阻断剂会减缓CD4+Tem的活化、成熟及增殖，这种减缓状态可能会减弱它们激活基质细胞的能力，降低炎症反应[46]。FN1与Macrophages M2(r=0.941，P=0.005)呈正相关关系，ZHOU等[47]在研究中发现FN1的下调在体外抑制了Macrophages M2的极化，而FN1过表达诱导了Macrophages M2的极化，这与该研究得出结果一致。综合富集分析和免疫分析，这些结果预示着PVNS的疾病过程可能与免疫炎症方面相关。

使用GSE176133数据集(包含3个PVNS样本和3个骨性关节炎样本)通过t检验及ROC分析验证了由蛋白-蛋白相互作用网络和血液/免疫与骨骼/肌肉系统筛选出的12个特异性表达核心基因，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果与作者的预测一致，ROC曲线分析表明，这12个特异性表达基因对PVNS有较高的诊断价值，AUC均大于0.5。因此，根据现有研究的样本，作者推测IL-6、TNF、CD163、KRAS、FN1、HMOX1、GAPDH、IL1B、PTPRC、MAPK1、CCR2和NFKBIA可能是诊断PVNS的生物标志物。此外，为了从转录组水平探究PVNS的发病机制，该研究还构建了mRNA-miRNA共表达网络和ceRNA网络。

IL-6是趋化因子家族的一种细胞因子，在细胞增殖、免疫炎症和细胞发育等方面发挥着重要作用[48]。IL-6已被认为是多种生理和病理条件下主要的骨吸收细胞因子，通过参与破骨细胞前体的聚集、分化和激活，从而刺激骨吸收[49]。早期研究认为，PVNS中所表现出的关节周围骨吸收和软骨破坏可能与炎症细胞因子IL-6的表达有关[15]，这表明IL-6在PVNS的发病机制中发挥重要作用。这与该研究结果一致，作者发现IL-6在PVNS滑膜组织中表达上调，并且ROC曲线表明在PVNS中显示出非常高的诊断价值(AUC=1.000)，作者认为IL-6是诊断PVNS较为有效的生物标志物。TNF是一种可以引起细胞死亡(凋亡)的细胞因子，它参与全身的炎症，在免疫应答中具有多种调节功能[50]。免疫细胞与基质细胞相关性分析表明，TNF主要与巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞相关。据研究报道显示，TNF能够刺激滑膜细胞并分泌基质金属蛋白酶，并被认为是炎症性关节炎中软骨和骨破坏的主要原因[49]。该研究中根据统计学分析发现，TNF在PVNS滑膜样本中表达量明显高于骨性关节炎样本，并且在PVNS样本中表达上调，具有较高的诊断价值(AUC=1.000)。因此，TNF可能在PVNS滑膜细胞凋亡以及疾病发生发展过程中起到重要作用。CD163是一种由单核细胞和巨噬细胞特异性表达的清道夫受体，并参与机体多种免疫活动[51]。研究发现，PVNS的增殖区主要由双阳性CD68+/h4Ph+(CD163+/CD55+)滑膜细胞组成，并且在滑膜组织中巨噬细胞和成纤维细胞数量显著增加[52]。CD163表面表达仅限于单核细胞/巨噬细胞谱系，并被炎症信号激活，如IL-6、脂多糖、TNF等[52]。此外，研究还发现与健康对照相比，骨性关节炎患者和PVNS患者的滑膜组织中CD163的表达升高[53]。这与此文作者的研究结果相吻合。研究证实CD163在PVNS滑膜样本中的表达量显著高于骨性关节炎滑膜样本。此外CD163与 CD4+Tem、祖B细胞、Th1细胞、B细胞呈正相关，且对PVNS有较高的诊断价值(AUC=0.889)。作者认为CD163是诊断PVNS的一种有效的生物标志物。虽然还未有研究证实KRAS、FN1、HMOX1、GAPDH、IL1B、PTPRC、MAPK1、CCR2、NFKBIA与PVNS有直接关系，但其在相关疾病发展中所表现出的生物特性值得进一步思考。KRAS是一种致癌基因，在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用[54]。KRAS对炎症因子的诱导以及通过PD-L161的AKT/mTOR途径导致的免疫逃逸值得关注[55]。FN1作为一种具有重要生物学功能的基质因子，在创伤修复的各个阶段发挥了重要作用，能够广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程[56]。在该研究中，FN1在PVNS滑膜样本中表达下调，表明滑膜组织受到侵袭损伤后修复能力下降。HMOX1(HO-1)是一种游离血红素蛋白水解酶。研究认为，在HO-1存在的情况下会对机体抗炎活性和细胞保护产生影响，被认为是骨性关节炎患者骨代谢的潜在生物标志物[57]。此外，HO-1在维持抗氧化剂/氧化剂的动态平衡和诱导免疫调节、抗炎和抗凋亡作用方面也起着关键作用[58]。CCR2作为一个潜在的靶点受到了极大的关注，特别是在炎症性关节炎方面[59]。CCR2是趋化因子配体2(CCL2)的受体，CCL2是趋化因子CC亚家族中一种重要的促炎因子，它对单核细胞、巨噬细胞和其他炎症因子有特殊的趋化激活作用，这些因子通常存在于骨性关节炎患者的滑液中[59]。研究证明使用CCR2抑制剂处理软骨细胞后，CCL2的过表达下降且关节炎症明显改善[60]。CD34被认为是非造血干细胞的标志，在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用，参与细胞的活化、细胞增殖与分化、免疫应答、炎症发生、凝血及创伤愈合等过程[61]。CD34+干细胞已被证实有缓解关节疼痛，再生关节软骨，改善关节功能的作用[62]。经验证发现TNF、IL-6、CCR2、GAPDH、HMOX1在PVNS样本中的诊断价值AUC为1，说明筛选出的核心靶点在验证集中灵敏度较高，但由于样本量相对较少，存在统计误差，因此对于临床诊断的精准性仍需进一步扩大样本量来进行验证。

此外，根据ceRNA假说，通过检索大量文献发现，关于PVNS相关RNA研究较少，但PVNS样本中所包含的hsa-miRNA-206和hsa-miR-107在骨性关节炎患者中所表现出的生物特性值得关注。因此选取hsa-miRNA-206和hsa-miR-107分别建立自网络进行分析。据报道，hsa-miRNA-206在骨性关节炎滑膜组织以及软骨细胞中表达明显升高，并能够抑制软骨细胞增殖，促进细胞凋亡[38]。而lncRNA-SNHG14被证实在骨性关节炎组织中的表达明显增加[63]。另一个子网络中，hsa-miR-107在骨性关节炎软骨细胞中的表达水平较低，研究发现miR-107的过表达能够抑制软骨细胞凋亡[40]。而lncRNA-XIST表达降低可以促进细胞活力，同时抑制了炎症因子对软骨细胞凋亡的影响[64]。根据网络中上调和下调关系并结合核心基因，作者提出SNHG14-hsa-miR-206-FN1和XIST-hsa-miR-107-HMOX1/CD163可能是调节PVNS疾病进展的潜在RNA调控途径。在该研究中，用于分析和验证的样本量相对较少，未来仍需要加大样本量并进行前瞻性队列研究来进一步验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程