钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.03.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (3): 384-388.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.03.010

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钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性评价

马慧¹，徐国强²，迪丽努尔•阿吉²，魏琴³，康雯¹，吴泽钰⁴，茹菲亚•祖拉提¹，阿丽娜•阿布都吉力力¹，排黑尔丁•凯赛尔¹

¹新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；³新疆医学动物模型研究实验室(自治区重点实验室)，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；⁴新疆医科大学基础医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

出版日期:2015-01-15 发布日期:2015-01-15
通讯作者: 徐国强，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:马慧，女，1989年生，新疆维吾尔自治区库尔勒市人，回族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金项目(2013211B59)

Biocompatibility of barium titanate piezoelectric ceramic coatings

Ma Hui¹, Xu Guo-qiang², Diilnur Aji², Wei Qin³, Kang Wen¹, Wu Ze-yu⁴, Rufiya Zulati¹, Alina Abdujilil¹, Pahirdin Kaisar¹

¹First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Xinjiang Laboratory of Animal Models (Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ⁴School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2015-01-15 Published:2015-01-15
Contact: Xu Guo-qiang, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Ma Hui, Studying for master’s degree, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2013211B59

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组利用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面喷涂钛酸钡制备了压电陶瓷涂层，但其生物相容性尚不清楚。

目的：检测钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性。

方法： ①溶血实验：在兔抗凝血中分别加入受试样品浸提液、生理盐水与蒸馏水，检测溶血率。②短期全身毒性实验：对Wistar大鼠分别灌胃给予受试样品浸提液与生理盐水，观察动物体质量变化。③热源实验：自新西兰兔耳缘静脉分别注射受试样品浸提液与生理盐水，观察动物体温变化。④致敏实验：将豚鼠随机分为2组，实验组以材料浸提液与完全弗氏佐剂为供试液，对照组以生理盐水溶液与完全弗氏佐剂为供试液。按照GBT16886.10-2005医疗器械生物学评价第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验规定，用最大剂量法进行致敏实验。

结果与结论：受试材料钛酸钡压电陶瓷涂层无溶血作用、无毒性、不致热、无致敏作用，结果表明钛酸钡压电陶瓷涂层具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 压电陶瓷, 羟基磷灰石, 钛酸钡, 等离子喷涂, 生物相容性, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The research group have used plasma spraying technique to prepare a piezoelectric ceramic coating on the surface of hydroxyapatite, but the biocompatibility of this new material is not clear.

OBJECTIVE: To detect the biocompatibility of barium titanate piezoelectric ceramic coatings prepared by plasma spraying technique.

METHODS: (1) Hemolysis test: The leaching solution of test samples, saline and distilled water were added into the rabbit anti-clotting, to detect the rate of hemolysis. (2) Short-term systemic toxicity test: Wistar rats were intragastrically given the leaching solution of test samples and normal saline, to observe the animal body weight changes. (3) Pyrogen test: The leaching solution of test samples and saline were injected into the ear vein of New Zealand rabbits, to observe the changes of animal body temperature. (4) Sensitization test: The guinea pigs were randomly divided into two groups, and respectively given the leaching solution of test samples and complete Freund’s adjuvant (experimental group) as well as the saline solution and complete Freund’s adjuvant (control group). In accordance with the stimulus and delayed-type hypersensitivity test requirements in GBT16886.10-2005 Part 10, the maximum dose was used for sensitization test.

RESULTS AND CONCLUSION: The barium titanate piezoelectric ceramic coatings have no hemolytic effect, non-toxicity, no sensitization, and cannot cause hot, indicating that the biological piezoelectric ceramic coating has good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Hydroxyapatites, Materials Testing, Hemolysis

中图分类号:

R318

马慧，徐国强，迪丽努尔•阿吉，魏琴，康雯，吴泽钰，茹菲亚•祖拉提，阿丽娜•阿布都吉力力，排黑尔丁•凯赛尔. 钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性评价[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(3): 384-388.

Ma Hui, Xu Guo-qiang, Diilnur Aji, Wei Qin, Kang Wen, Wu Ze-yu, Rufiya Zulati, Alina Abdujilil, Pahirdin Kaisar. Biocompatibility of barium titanate piezoelectric ceramic coatings[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(3): 384-388.

图/表（结果） 5

2.1 溶血实验结果钛酸钡压电陶瓷材料浸提液对新鲜兔血溶血度的平均值为0.024，根据公式计算得溶血率为0.86%，低于5%，结果符合生物材料的血液相容性标准，判断生物压电陶瓷涂层材料不具备溶血作用(表1)。

2.2 短期全身毒性实验结果在灌胃初期2 d，实验组与对照组均出现体质量减轻症状，考虑为不适应灌胃针的刺激，在之后的观察期中，两组大鼠均呈体质量持续增加状态。两组大鼠在观察期内每周的体质量增长率及食物利用率见表2，体质量增长数见表3。统计学分析表明，两组大鼠之间的体质量增长数比较差异无显著性意义(P > 0.05)。在观察期间，大鼠反应敏捷、活跃、毛色光亮，未观察到出现运动技能减退、呼吸困难、腹泻、眼睑下垂、震颤、虚脱及其他毒性症状或死亡等症状。

观察14 d后处死动物，病理解剖宏观观察两组动物的心、肺、消化道、肝、脾、肾、肾上腺等重要脏器，未见充血、出血、水肿或其他异常，见图1。病理组织切片未见两组动物的心、肺、消化道、肝、脾、肾、肾上腺等重要脏器异常。根据毒性评定标准判定生物压电陶瓷无毒性。

2.3 热源实验结果实验组与对照组注射浸提液后体温升高值均在0.6 ℃以内，实验组体温升高值总和为0.6 ℃，对照组体温升高值总和为0.62 ℃，均< 1.4℃，符合国家标准，说明生物压电陶瓷不具有致热源物质，材料不引起热源反应，见表4。

2.4 致敏实验结果实验组与阴性对照组在去除贴敷物后24，48，72 h均未观察到动物皮肤红斑和水肿等过敏反应，按Magnusson和Kligman 分级标准记分为0，表明生物压电陶瓷材料的浸提液无潜在的可致敏物质。

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引言

牙槽骨的吸收、缺失是临床修复的难题，如何重建牙槽骨对后续的口腔治疗至关重要^[1-2]。临床常用的手段有自体骨、同种异体骨及人工合成材料填充，治疗骨缺损较理想的方法是自体骨移植^[3]。自体骨移植是目前移植的黄金标准^[4]，但由于自体骨来源有限并可能引起供区部位的并发症，因此难以满足临床中对骨组织的需求，限制了它的应用。异体骨有取材广泛的优点，但它易传播疾病并产生排斥反应，可引起感染，仍需需要进一步的改善。人工合成骨可避免自体骨取材的数量限制和并发症，可避免异体骨排斥的危险，已成为目前骨移植研究的热点。人工合成骨主要有羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥等。羟基磷灰石是人体和动物骨骨和齿的主要无机成分，具有优异的生物相容性，已被广泛用于各类骨缺损修复^[5-6]，是目前公认性能良好的骨修复替代材料^[7-8]。尽管羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性和骨传导性^[9]，但其骨诱导活性低，使其临床应用中受到限制^[10]。日本学者Yasadu^[11]，Bassett等^[12]首先提出了自然骨在弯曲或受力时有压电极化产生，自然骨本身具有压电性，其压电性能刺激和控制骨自身的生长。骨的压电性决定了骨的塑形和改建^[13]，压电陶瓷的压电效应可进行机械能和电能之间的转换，这与天然骨的作用极其类似^[14]。因此，压电陶瓷作为一种新型的功能性陶瓷走入了人们视野。目前，制作陶瓷涂层的方法有很多，等离子喷涂技术是应用最为广泛且较为成功的一种方法^[15-16]。目前课题组利用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面等离子喷涂钛酸钡制备了压电陶瓷涂层，但其生物相容性尚不清楚。为此，本实验参考ISO 10993《医疗器械生物学评价标准》选取溶血实验、短期毒性实验、热源实验、致敏实验等方法^[17]，初步评价生物压电陶瓷的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外与体内观察实验。

时间及地点：动物实验于2014年1至6月在新疆医科大学第一附属医院实验动物中心(自治区重点实验室)完成，本实验已通过动物伦理委员会审核批准，审批号：IACUC-20120321005内容。

材料：

实验动物：健康成年新西兰白兔6只，清洁级，雌雄不拘，雌兔无孕，体质量2.0-3.5 kg；清洁级Wistar大鼠20只，雌雄各半，体质量300 g左右；清洁级豚鼠15只，雌雄不拘，体质量300-400 g。实验动物均购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心，实验过程中动物处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》^[18]。

实验方法：

在羟基磷灰石表面等离子喷涂钛酸钡制备生物压电陶瓷试件：在1 cm×1 cm×0.2 cm的羟基磷灰石表面，运用等离子喷涂技术制备钛酸钡压电陶瓷^[19-20]。将制备好的生物压电陶瓷用体积分数75%乙醇超声振荡清洗15 min，再用三蒸水冲洗3次，烘干后用⁶⁰Co辐射灭菌备用。

生物压电陶瓷浸提液的制备：将高温高压灭菌消毒后的圆柱状含有钛酸钡压电陶瓷涂层的羟基磷灰石材料，按样品表面积/浸提液=3 cm²/mL^[21]，在37 ℃水浴箱中生理盐水持续浸泡72 h，制备材料浸提液，用0.22 μm滤器过滤除菌，然后密封于无菌瓶中，置于4 ℃冰箱中备用，24 h内进行试验。

溶血实验：取健康成年新西兰兔耳缘静脉血10 mL，加入0.5 mL 2%的草酸钾(20 g/L)，取8 mL抗凝兔血加入10 mL生理盐水，调整生理盐水的用量，使稀释后的0.2 mL抗凝兔血在10 mL蒸馏水中于545 nm处的吸光度值为0.8±0.3。实验分为实验组、阴性对照组、阳性对照组，实验组在离心管中加入10 mL生物压电陶瓷材料浸提液，阴性对照组在离心管中加入10 mL生理盐水，阳性对照组在离心管中加入 10 mL蒸馏水，各组制备3个平行样，将所有离心管置于 (37±1) ℃恒温水浴中保温30 min，再在各离心管中加入 0.2 mL稀释抗凝兔血，轻摇匀，继续放入37 ℃恒温水浴中保温60 min。所有离心管2 000 r/min离心5 min，取上清液移入96孔板中，在酶标仪上测量在波长545 nm处的吸光度， 3个平行样吸光度值为其吸光度(A)值。

评价方法：溶血率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%。阴性对照组A值≤0.03，阳性对照组A值为0.8±0.3时实验结果有效，若溶血率小于5%，可判断该实验材料不具备溶血作用。

短期全身毒性实验(经口途径)：选用体质量300 g左右的Witar大鼠20只，雌雄各半，标准饮食、饮水，将Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，每组10只，雌雄各半。饲养时，每个笼内放同性别、服用同一材料的Wistar大鼠5只，并标记Wistar大鼠。用连有灌胃针的注射器按每天5 mL/kg灌服，给实验组灌服生物压电陶瓷材料浸提液，对照组灌服生理盐水。灌服材料前禁食4-8 h，禁食期间不禁水。连续灌服7 d，然后观察1周。每天观察动物的临床毒性体征，包括运动技能减退、呼吸困难、腹泻、眼睑下垂、震颤、虚脱及其他毒性症状或死亡。将体征分为无、轻、中、重度及死亡。每只动物按上述症状最重者分级。每天记录各动物的体质量及每组动物食物消耗量，计算每周每组动物食物利用率及每只动物体质量相对增长率，并将两组每周体质量相对增长率做统计处理。体质量相对增长率=体质量增长数(g)/原始体质量(g)×100%。食物利用率为每吃100 g食物所增长的体质量克数。病理解剖宏观观察动物动物心、肺、消化道、肝、脾、胰、肾、肾上腺等重要脏器，观察有无充血、出血、水肿或其他变化，如有异常则进行常规组织病理切片观察。

热源实验：取新西兰白兔6只，雌雄不拘，随机均分成2组。在测肛温前禁食、水2 h，将兔固定后测肛温，间隔 1 h测1次，共4次，体温在38.7-39.5 ℃之间且最大温差不超过0.4 ℃者符合实验要求^[6]。7 d后在相同室温和湿度环境下进行实验，测肛温2次，间隔1 h，取2次温度平均值为正常体温。测得正常体温后15 min后，实验组自耳缘静脉缓慢注入37 ℃的生物压电陶瓷材料材料浸提液，对照组注入37 ℃的生理盐水，剂量为10 mL/kg，注射后每隔1 h测1次肛温，共3次，以3次中最高体温减去正常体温即为升高的体温度数。

评价标准：每组3只动物体温升高不超过0.6 ℃且肛温升高度数总和在1.4 ℃以下，则表明生物压电陶瓷材料材料无致热作用。

致敏实验：取豚鼠15只，体质量250-320 g，雌雄不拘，雌豚鼠无孕，随机分为2组，实验组10只、阴性对照组5只。以生物压电陶瓷材料浸提液与完全弗氏佐剂为实验组供试液，生理盐水溶液与完全弗氏佐剂为阴性对照组供试液。按照GBT16886.10-2005医疗器械生物学评价第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验规定，用最大剂量法进行致敏实验，并按Magnusson 和Kligman 分级标准，描述每一实验步骤后各个致敏部位的皮肤反应情况。

评价标准：阴性对照组动物记分小于1，而实验组动物记分不小于1时一般提示致敏。如阴性对照组动物记分≥1时，实验组动物反应超过阴性对照组最严重的反应提示致敏。

主要观察指标：钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。数据组间比较采用t 检验，P < 0.05为组间差异有显著性意义。

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讨论

骨组织工程开发新型骨组织移植替代材料成为了近年的主要发展方向^[22-24]。羟基磷灰石是天然骨无机盐的主要成分，具有良好的生物相容性、骨传导性，被视为骨缺损修复的理想材料^[25-28]，因此羟基磷灰石被广泛应用在口腔领域中，但其骨诱导活性低，仍需研究优化其性能。压电陶瓷是具有电能和机械能相互转换功能的材料，与天然骨的作用极其类似。利用压电陶瓷植入骨内可引导新生骨质定向沉积^[29]。钛酸钡是发现最早的无铅压电陶瓷材料，也是最先应用的压电陶瓷材料，它具有高的稳定压电性能。课题组设想运用等离子喷涂技术在羟基磷灰石材料上喷涂钛酸钡压电陶瓷涂层，以期综合羟基磷灰石良好的生物相容性、骨传导性及钛酸钡压电陶瓷的压电性能，提高材料的临床应用价值。用于临床的理想骨组织工程材料除了需要具备理想的理化性质，还应具备良好的生物相容性。本课题组已对生物压电陶瓷涂层材料进行了细胞相容性研究，证实该材料具有良好的细胞相容性，并无细胞毒性^[30]。溶血实验结果表明，实验组和阴性对照组均未观察到溶血现象，在阳性对照管观察到明显溶血现象，计算得被试材料溶血率为0.86%，低于5%，说明新型生物压电陶瓷材料无溶血作用。短期毒性实验(经口途径)结果表明，在观察期间大鼠反应敏捷、活跃、毛色光亮，未观察到实验组与对照组大鼠出现运动技能减退、呼吸困难、腹泻、眼睑下垂、震颤、虚脱及其他毒性症状或死亡等症状；观察14 d后处死动物，病理解剖宏观观察两组动物的心、肺、消化道、肝、脾、肾、肾上腺等重要脏器，未见充血、出血、水肿或其他异常，说明新型生物压电陶瓷材料无毒性。热源实验结果表明，实验组兔体温升高值总和为0.6 ℃，小于1.4 ℃，符合国家标准，说明新型生物压电陶瓷材料不具有致热源物质，材料不引起热源反应。致敏实验结果表明，去除贴敷物后24，48，72 h均未观察到动物皮肤红斑和水肿等过敏反应，按Magnusson 和Kligman 分级标准记分为0，表明生物压电陶瓷材料的浸提液无新型生物压电陶瓷材料无潜在的可致敏物质。

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