破骨细胞骨吸收中肿瘤坏死因子α可提高空泡型质子泵表达与活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6123-6128.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.010

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破骨细胞骨吸收中肿瘤坏死因子α可提高空泡型质子泵表达与活性

朱伟平¹，林琳¹，刘耿蓉¹，李中和¹，刘双信²，史伟²

1中山大学附属第五医院肾内科，广东省珠海市 519000；2广东省人民医院肾内科，广东省广州市 518900

收稿日期:2014-08-20 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 史伟，博士生导师，主任医师，教授，广东省人民医院肾内科，广东省广州市 518900
作者简介:朱伟平，男，1978年生，广东省珠海市人，汉族，2014年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事终末期肾病和肾性骨病研究。
基金资助:
2014年广东省医学科研基金资助(A2014259)

Tumor necrosis factor alpha enhances the bone-resorptive capabilities of osteoclasts by improving the expression and activity of vocuolar-type ATPase

Zhu Wei-ping¹, Lin Lin¹, Liu Geng-rong¹, Li Zhong-he¹, Liu Shuang-xin², Shi Wei²

1Department of Nephrology, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China; 2Department of Nephrology, Guangdong General Hospital, Guangzhou 518900, Guangdong Province, China

Received:2014-08-20 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Shi Wei, Doctoral supervisor, Chief physician, Professor, Department of Nephrology, Guangdong General Hospital, Guangzhou 518900, Guangdong Province, China
About author:Zhu Wei-ping, M.D., Attending physician, Department of Nephrology, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China
Supported by:
the Medical Research Fund of Guangdong Province in 2014, No. A2014259

摘要/Abstract

摘要：

背景：空泡型的ATP酶(V-ATPase)在破骨细胞的骨吸收功能中起重要作用，肿瘤坏死因子α对破骨细胞中的V-ATPase表达与活性的影响尚不明确。
目的：通过V-ATPase的表达与酶的活性变化，探讨肿瘤坏死因子α促进破骨细胞骨吸收功能的机制。
方法：体外诱导培养破骨细胞，分别给予不同质量浓度的肿瘤坏死因子α干预(5，10，30 μg/L)。采用荧光定量PCR及Western Blot检测肿瘤坏死因子α对破骨细胞V-ATPase 表达的影响；根据吸光度值计算出V-ATPase的相对活性；倒置显微镜下观察骨吸收陷窝形成情况，采用Image J软件分析骨吸收面积。
结果与结论：破骨细胞经过48 h的肿瘤坏死因子α干预以后，V-ATPase的表达与活性均有显著的增加，并且提高肿瘤坏死因子α的干预浓度均可增强此效应。破骨细胞经肿瘤坏死因子α干预后，培养板的骨吸收面积明显增加，这种作用随着肿瘤坏死因子α干预浓度的增加而增强。由此推测肿瘤坏死因子α作为一个重要的炎症递质参与病理性骨质吸收的过程，除促进破骨细胞形成以外，其可能的机制是肿瘤坏死因子α通过增加V-ATPase的表达，并提高V-ATPase活性，从而增强破骨细胞的骨质吸收活动。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 空泡型质子泵, 肿瘤坏死因子, 破骨细胞, 细胞培养, 骨髓单核细胞

Abstract:

BACKGROUND: Vocuolar-type ATPase (V-ATPase) is highly expressed in osteoclasts and especially plays an important role in osteoclastic bone resorption. Tumor necrosis factor-α is a potent stimulator of bone resorption. However, the effect of tumor necrosis factor-α on expression and activity of V-ATPase is still not clear.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of tumor necrosis factor-α to promote osteoclastic bone resorption by observing expression and activity of V-ATPase.
METHODS: Osteoclasts cultured in vitro were intervened by different concentrations of tumor necrosis factor-α (5, 10, 30 μg/L) in order to observe the changes in expression and enzyme activity of V-ATPase and its effects on bone resorption of osteoclasts. Under an inverted microscope, we observed the formation of resorption lacunas, and bone resorption area was analyzed using Image J software.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression and activity of V-ATPase increased significantly after 48 hours of tumor necrosis factor-α intervention and the increase of tumor necrosis factor-α concentration might enhance this effect. In addition, osteoclastic bone resorption was promoted after intervention with tumor necrosis factor-α. The bone-resorbing capabilities of osteoclasts increased in parallel with the concentration of tumor necrosis
factor-α.The results suggested that tumor necrosis factor-α, as a significant inflammatory mediator involved in the pathological process of bone resorption, not only promotes formation of osteoclasts but also enhances bone-resorbing capabilities of osteoclasts by increasing V-ATPase expression and activity.

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Key words: tumor necrosis factor-alpha, osteoclasts, adenosine triphosphatases

中图分类号:

R318

朱伟平，林琳，刘耿蓉，李中和，刘双信，史伟. 破骨细胞骨吸收中肿瘤坏死因子α可提高空泡型质子泵表达与活性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6123-6128.

Zhu Wei-ping, Lin Lin, Liu Geng-rong, Li Zhong-he, Liu Shuang-xin, Shi Wei. Tumor necrosis factor alpha enhances the bone-resorptive capabilities of osteoclasts by improving the expression and activity of vocuolar-type ATPase[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6123-6128.

图/表（结果） 3

2.1 破骨细胞的诱导结果骨髓单核细胞经巨核细胞集落刺激因子1与核因子κB受体活化因子配体共同诱导培养1 d后，未见有抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的细胞出现；骨髓单核细胞刚贴壁时呈类圆形，第2天可见伸出的伪足，单核，极少数有两个核；第3天可见少量的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞，类圆形，体积明显比单核细胞大，由两三个单核细胞互相融合而成，逐渐形成空泡样多核巨噬细胞；第4天，由多个单核细胞形成的破骨细胞体积继续增大，数量增多；第5天，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的细胞形状不规则，多核(核> 3个)，体积大，直径可达 50-100 μm，有伪足，可见囊泡，细胞融合形成破骨样细胞达高峰(图1)第7天开始，部分破骨细胞出现碎裂现象；至第9天破骨细胞数目明显减少，可见较多细胞碎片。

2.2 破骨细胞V-ATPase表达为观察肿瘤坏死因子α对破骨细胞表达V-ATPase的影响，将破骨细胞与不同质量浓度肿瘤坏死因子α经过48 h共培养后，分离出总RNA以及提取蛋白，以评估V-ATPase的基因与蛋白水平的表达情况。结果提示V-ATPase的mRNA表达随着肿瘤坏死因子α干预浓度的增加呈上升趋势(图2)，但治疗组与对照组之间没有统计学差异。免疫印迹实验中结果表明V-ATPase蛋白水平的表达随着肿瘤坏死因子α干预浓度的增加而增加，治疗组与对照组之间差异有显著性意义(图3)。

2.3 破骨细胞V-ATPase活性的变化为评价肿瘤坏死因子α对V-ATPase活性的影响，实验用分光光度仪对各组的V-ATPase活性进行检测，结果表明肿瘤坏死因子α处理组的V-ATPase活性显著增加2.3-5.8倍，并且V-ATPase活性的增加与肿瘤坏死因子α的浓度呈剂量依赖性(图4)。

2.4 破骨细胞骨吸收结果为进一步明确肿瘤坏死因子α对破骨细胞骨吸收功能的影响，测量不同肿瘤坏死因子α干预浓度下破骨细胞骨质吸收面积的变化。在倒置显微镜下观察到的暗黑色区域为破骨细胞吸收骨质后形成的骨吸收陷窝，形态不规则，呈虫蚀样。随着肿瘤坏死因子α干预质量浓度的增加，破骨细胞的骨吸收面积增加2-5倍。结果提示，破骨细胞经肿瘤坏死因子α干预后，培养板的骨吸收面积明显增加，这种作用随着肿瘤坏死因子α干预质量浓度的增加而增强(图5，6)。

参考文献

[1] Sims NA, Gooi JH. Bone remodeling: Multiple cellular interactions required for coupling of bone formation and resorption.Semin Cell Dev Biol.2008;19(5):444-451.
[2] Sims NA, Vrahnas C.Regulation of cortical and trabecular bone mass by communication between osteoblasts, osteocytes and osteoclasts. Arch Biochem Biophys. 2014 May 26. pii: S0003-9861(14)00172-176.
[3] Parfitt AM. Osteonal and hemi-osteonal remodeling: the spatial and temporal framework for signal traffic in adult human bone.J Cell Biochem.1994;55(3):273-286.
[4] Udagawa N, Takahashi N, Akatsu T, et al. Origin of osteoclasts: mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A.1990;87(18):7260-7264.
[5] 朱伟平;史伟;林琳;等.核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞前体的培养与分化[J].中国组织工程研究,2013,17(46): 7981-7987.
[6] 刘波,于世凤,庞淑珍.新伐他汀体外对破骨细胞性骨吸收及大鼠骨代谢的影响[J].中国骨质疏松杂志,2005,11(3):351-355.
[7] 邢联平,张倩,姚振强.破骨细胞介导炎症性骨丢失的研究进展[J]. 中华创伤骨科杂志,2006,8(7):671-674.
[8] Kartner N, Manolson MF. Novel techniques in the development of osteoporosis drug therapy: the osteoclast ruffled-border vacuolar H(+)-ATPase as an emerging target. Expert Opin Drug Discov.2014;9(5):505-522.
[9] Xiao YT, Xiang LX, Shao JZ. Vacuolar H(+)-ATPase.Int J Biochem Cell Biol.2008;40(10):2002-2006.
[10] Su Y, Zhou A, Al-Lamki R S, et al.The a-subunit of the V-type H+-ATPase interacts with phosphofructokinase-1 in humans. J Biol Chem.2003;278(22):20013-20018.
[11] Qin A, Cheng TS, Pavlos NJ, et al. V-ATPases in osteoclasts: structure, function and potential inhibitors of bone resorption. Int J Biochem Cell Biol.2012;44(9):1422-1435.
[12] Xu J, Cheng T, Feng HT, et al. Structure and function of V-ATPases in osteoclasts: potential therapeutic targets for the treatment of osteolysis.Histol Histopathol.2007; 22(4):443-454.
[13] Supanchart C, Kornak U. Ion channels and transporters in osteoclasts. Arch Biochem Biophys.2008;473(2): 161-165.
[14] Braun T, Zwerina J. Positive regulators of osteoclastogenesis and bone resorption in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2011,13(4):235.
[15] Nieminen P, Morgan N V, Fenwick AL, et al. Inactivation of IL11 signaling causes craniosynostosis, delayed tooth eruption, and supernumerary teeth. Am J Hum Genet.2011; 89(1):67-81.
[16] Nakamura I, Jimi E. Regulation of osteoclast differentiation and function by interleukin-1. Vitam Horm.2006;74:357-370.
[17] Schilling B, Yeh J. Expression of transforming growth factor (TGF)-beta1, TGF-beta2, and TGF-beta3 and of type I and II TGF-beta receptors during the development of the human fetal ovary. Fertil Steril.1999;72(1):147-153.
[18] Katagiri T, Takahashi N. Regulatory mechanisms of osteoblast and osteoclast differentiation. Oral Dis.2002; 8(3):147-159.
[19] Kim N, Kadono Y, Takami M, et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. J Exp Med. 2005;202(5):589-595.
[20] Blair H C, Athanasou NA. Recent advances in osteoclast biology and pathological bone resorption. Histol Histopathol. 2004;19(1):189-199.
[21] Fujii T, Kitaura H, Kimura K, et al.IL-4 inhibits TNF-alpha- mediated osteoclast formation by inhibition of RANKL expression in TNF-alpha-activated stromal cells and direct inhibition of TNF-alpha-activated osteoclast precursors via a T-cell-independent mechanism in vivo. Bone. 2012;51(4): 771-780.
[22] Xu J, Cheng T, Feng HT, et al. Structure and function of V-ATPases in osteoclasts: potential therapeutic targets for the treatment of osteolysis. Histol Histopathol. 2007;22(4):443-454.
[23] Drory O, Nelson N. The emerging structure of vacuolar ATPases. Physiology (Bethesda).2006;21:317-325.
[24] Thudium CS, Jensen VK, Karsdal MA, et al.Disruption of the V-ATPase functionality as a way to uncouple bone formation and resorption - a novel target for treatment of osteoporosis. Curr Protein Pept Sci.2012;13(2):141-151.
[25] Nishi T, Kawasaki-Nishi S, Forgac M. Expression and function of the mouse V-ATPase d subunit isoforms. J Biol Chem. 2003; 278(47):46396-46402.
[26] Blake-Palmer KG, Su Y, Smith AN, et al. Molecular cloning and characterization of a novel form of the human vacuolar H+-ATPase e-subunit: an essential proton pump component. Gene.2007;393(1-2):94-100.
[27] Aggarwal BB. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat Rev Immunol.2003;3(9):745-756.
[28] 陈如平,王昌兴,王伟东.类风湿性关节炎中肿瘤坏死因子α的表达及意义[J].医学综述,2011,17(5): 647-649.
[29] Sethi G, Sung B, Aggarwal BB. TNF: a master switch for inflammation to cancer. Front Biosci.2008;13:5094-5107.
[30] Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature.1997;385(6618):729-733.
[31] Osta B, Benedetti G, Miossec P. Classical and Paradoxical Effects of TNF-alpha on Bone Homeostasis. Front Immunol. 2014;5:48.
[32] Macewan DJ. TNF ligands and receptors--a matter of life and death. Br J Pharmacol.2002;135(4):855-875.
[33] Faustman D, Davis M.TNF receptor 2 pathway: drug target for autoimmune diseases. Nat Rev Drug Discov.2010;9(6): 482-493.
[34] Kudo O,Fujikawa Y,Itonaga I,et al.Proinflammatory cytokine (TNFalpha/IL-1alpha) induction of human osteoclast formation. J Pathol.2002;198(2):220-227.
[35] Mucci JM, Scian R, De Francesco PN, et al. Induction of osteoclastogenesis in an in vitro model of Gaucher disease is mediated by T cells via TNF-alpha. Gene.2012;509(1):51-59.
[36] Matsubara R, Kukita T, Ichigi Y, et al. Characterization and identification of subpopulations of mononuclear preosteoclasts induced by TNF-alpha in combination with TGF-beta in rats. PLoS One.2012;7(10):e47930.
[37] Kagiya T, Nakamura S.Expression profiling of microRNAs in RAW264.7 cells treated with a combination of tumor necrosis factor alpha and RANKL during osteoclast differentiation. J Periodontal Res.2013;48(3):373-385.
[38] Pacifici R.Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. J Bone Miner Res. 1996;11(8): 1043-1051.
[39] 赵玉鸣,葛立宏,Grigoriadis Agi E.肿瘤坏死因子α对小鼠破骨细胞分化的影响[J].北京大学学报:医学版,2005,37(4): 433-435.
[40] Horowitz MC, Xi Y, Wilson K, et al. Control of osteoclastogenesis and bone resorption by members of the TNF family of receptors and ligands. Cytokine Growth Factor Rev.2001;12(1):9-18.
[41] Hofbauer LC, Heufelder AE. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.J Mol Med (Berl).2001;79(5-6):243-253.
[42] 孙嗣国,马保安,周勇,等.肿瘤坏死因子-α诱导外周血单核细胞分化为破骨细胞[J].第四军医大学学报,2005,(21):1988-1991.
[43] Fuller K, Murphy C, Kirstein B, et al. TNFalpha potently activates osteoclasts, through a direct action independent of and strongly synergistic with RANKL. Endocrinology. 2002; 143(3):1108-1118.

引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2013年1至6月在广东省医学研究中心完成。

材料：4周龄C57小鼠，雌雄不限，由中山大学动物实验中心提供，许可证号：粤SYXK20072081。

实验方法：

骨髓细胞培养：拉颈处死4周龄C57小鼠，用体积分数75%乙醇浸泡5 min；无菌条件下分离股骨，清除骨表面的软组织；剪断两侧骨骺端，用1 mL注射器将培养液缓慢地冲洗骨髓腔；收集骨髓细胞混合液共10 mL，加入巨核细胞集落刺激因子至终浓度25 mg/L，并接种至75 cm²培养瓶中，在含有10%BSA的α-MEM培养液中添加100 U/mL青霉素与100 mg/L链霉素，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内；培养48 h后，PBS漂洗，去除未黏附的淋巴细胞及血细胞，以贴壁的骨髓单核细胞作为诱导破骨细胞的前体细胞。

肿瘤坏死因子α 通过提高空泡型质子泵的表达与活性促进破骨细胞骨吸收实验所用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
青链霉素(10 000 U/mL，10 000 mg/L)	Gibco
胎牛血清，BSA	Biological Industries, Israel
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒	Sigma
巨核细胞集落刺激因子、细胞核因子κB受体活化子配体(soluble murine RANKL )	R&D公司
重组小鼠肿瘤坏死因子α	PeproTech公司
BCA蛋白检测试剂盒	Beyotime公司
兔抗鼠V-ATPase抗体	GenScript，USA
羊抗兔IgG二抗	Santa Cruz，USA
数字凝胶电泳图象处理与分析系统	Tanon，上海

诱导破骨细胞形成：根据作者以往的研究，骨髓单核细胞经细胞计数板计数后按10⁴/cm²的密度接种于培养板。核因子κB受体活化因子配体以含0.1%BSA的PBS作溶媒。培养基中加入30 μg/L的核因子κB受体活化因子配体与 25 μg/L的巨核细胞集落刺激因子共同诱导。置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养5 d，隔天换液1次，并保持核因子κB受体活化因子配体的终浓度为30 μg/L，观察细胞形态特征变化。培养四五天后可以观察到破骨细胞的形成。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色实验：骨髓单核细胞按上述方法培养5 d后取出培养板，PBS冲洗1次；25 g/L的多聚甲醛固定10 min；PBS冲洗3次；加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色液，将培养板置入37 ℃的恒温箱，避光孵育1 h；倒置相差显微镜下观察及拍片。

荧光定量PCR：从破骨细胞中加入trizol分离并提取出总RNA。引物序列：内参GAPDH：5’-3’ CCA TGT TTG TGA TGG GTG TGA ACC，3’-5’ GGT TGT GAC TCG TAG AGG GAG TGT；V-ATPase：5’-3’ CCG TAC TCC GCA CTG GTA AAC，3’-5’ TGG GTT TCA TAG ATG TAG GGG T。反转录设定反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃结束。实时荧光定量PCR采用25 μL反应体系，包含前后引物各1 μL，12.5 μL SYBR^® Premix Ex Taq II，8.5 μL无酶水与2 μL的cDNA。反应条件如下：95 ℃ 30 s，然后 40个循环为95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min。通过熔解曲线分析，验证PCR产物的特异性。采用2^-^ΔΔCt法分析结果。

Western Blot：破骨细胞与肿瘤坏死因子α(5，10和 30 μg/L)经过48 h共培养后，用RIPA缓冲液制备破骨细胞蛋白裂解液。取细胞裂解液(30 μg)在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。然后蛋白质转移到硝酸纤维素膜，与兔抗鼠V-ATPase A亚基抗体(0.2 mg/L)孵育，GAPDH作为内参，二抗是1 mg/L的羊抗兔IgG-辣根过氧化物。使用数字凝胶电泳图像处理与分析系统分析条带与吸光度。

V-ATPase活性：破骨细胞与肿瘤坏死因子α(5，10，30 μg/L)经过48 h共培养后，按试剂盒描述的方法制备蛋白质样品。首先通过BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，然后使用V-ATPase活性检测试剂盒测定酶的活性。巴弗洛霉素A1是V-ATPase的特异性抑制剂。在巴弗洛霉素A1存在与否的情况下，V-ATPase在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(LDH)反应系统中水解底物ATP，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被转换了成氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，根据两者在340 nm的吸光度差异可以计算出V-ATPase的相对活性。样品活性读数：340 nm波长读数(0 min)-340 nm波长读数(10 min)。样品活性的计算：[(样品读数-背景读数)×1(体系容量；mL)×样品稀释倍数]/[0.05(体系容量；mL)×6.22(毫升摩尔吸光系数)×10(反应时间)]=[单位/mL]/样品蛋白浓度(mg/mL)=单位/mg(微摩尔NADH/分钟)；样品总活性-样品非特异活性=样品特异活性。

骨吸收功能检测：骨髓单核细胞按10⁴/cm²的密度接种于底部覆盖羟磷灰石结晶层的24孔培养板中培养，加入 30 μg/L的核因子κB受体活化因子配体与25 μg/L的巨核细胞集落刺激因子共同诱导，隔天换液1次。诱导5 d后分别加入不同质量浓度的肿瘤坏死因子α(0，5，10，30 μg/L)；共培养7 d后取出培养板，PBS冲洗3次；5%次氯酸钠洗涤 5 min；PBS冲洗3次；在倒置显微镜下观察骨吸收陷窝的形成并拍片，骨吸收面积用Image J软件分析。

主要观察指标：①破骨细胞的诱导结果。②肿瘤坏死因子α对破骨细胞V-ATPase表达、V-ATPase活性及骨吸收的影响。

统计学分析：计量资料数据以x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，结果用单因素方差分析，方差齐性用LSD法进行组间多重比较，方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P < 0.05被定义为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

迄今为止，V-ATPase的核心结构已得到了很好的建模，它由V1和V0两个不同的结构域以及辅助亚基AC45与M8-9组成^[22]。V1部分位于胞质内，是一个570 ku的复杂结构域，由8个不同的亚基(A-H，A，B1，B2，C1，C2，D，E1，E2，F，G1，G2，G3，和H亚基)构成，主要负责ATP的水解^[23-24]。V0部分位于跨膜区，是一个260 ku的复合体，由(a1，a2，a3，a4，c，c’，c”，d1，d2，e)6个不同的亚基组成，主要负责质子的移位^[25-26]。

肿瘤坏死因子α是参与骨骼重塑的几种炎性细胞因子之一。它的主要作用是通过促进破骨细胞形成和抑制成骨细胞的功能维持骨代谢的稳态^[27]。有研究表明，肿瘤坏死因子α在炎症性关节疾病的发病机制中占据重要位置，如以大量近端关节骨质破坏为特点的类风湿性关节炎或者以骨质破坏和过度骨形成为特征的强直性脊柱炎^[28]。肿瘤坏死因子α可能具有诱导成骨细胞分化和破骨细胞生成的双重作用。

肿瘤坏死因子α主要由单核细胞产生，也可以由许多其他细胞分泌^[29]。它以一种跨膜蛋白(mTNF-α)的形式生成，随后由肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)裂解为可溶性的肿瘤坏死因子α^[30]。这两种类型都具有生物活性，并可与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)或肿瘤坏死因子受体1(TNFR2)结合为三聚体^[31]。

TNFR1死亡域通过激活半胱氨酸蛋白酶和核因子κB启动细胞凋亡信号，引起促炎性细胞因子、趋化因子和抗凋亡分子的转录^[32]。相对TNFR1而言，TNFR2在细胞的表达非常有限，并且不含死亡结构域，其作用是通过核因子κB，激活蛋白1(AP-1)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的信号通路促进T细胞的活化和增殖^[33]。

肿瘤坏死因子α刺激破骨细胞形成的作用早已被广泛报道^[34-39]。大量的转录因子的表达，包括核因子κB，是破骨细胞形成的关键^[40]。早期骨髓祖细胞在巨核细胞集落刺激因子的作用下向破骨细胞前体或单核-巨噬细胞发育，而肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和核因子κB受体活化因子配体可促进这些细胞向功能性破骨细胞分化^[41-42]。因此，核因子κB受体活化因子配体和肿瘤坏死因子α具有协同诱导破骨细胞形成的作用^[43]。同时，炎症性骨关节病中大量的肿瘤坏死因子α通过活化TNFR2抑制成骨细胞的骨形成作用，并促进破骨细胞性骨吸收，打破骨代谢的稳态，导致骨关节的骨质破坏^[33]。

一般来说，破骨细胞活性是依赖于肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、核因子κB受体活化因子配体等关键的细胞因子的表达，然而具体的机制却研究甚少。破骨细胞分泌氢离子溶解羟基磷灰石晶体是骨骼脱钙的重要环节。破骨细胞膜上的V-ATPase参与氢离子分泌这一关键生理过程。作者通过体外实验研究，发现破骨细胞经过48 h的肿瘤坏死因子α干预以后，V-ATPase的表达与活性均有显著的增加，并且提高肿瘤坏死因子α的干预浓度均可增强此效应。除此以外，在细胞培养液中添加肿瘤坏死因子α后，破骨细胞的骨吸收作用得以增强，肿瘤坏死因子α质量浓度越高，这种作用越趋明显。由此推测肿瘤坏死因子α作为一个重要的炎症递质参与病理性骨质吸收的过程，除促进破骨细胞形成以外，其可能的机制是肿瘤坏死因子α通过增加V-ATPase的表达，并提高V-ATPase活性，从而增强破骨细胞的骨质吸收活动。

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破骨细胞骨吸收中肿瘤坏死因子α可提高空泡型质子泵表达与活性

Tumor necrosis factor alpha enhances the bone-resorptive capabilities of osteoclasts by improving the expression and activity of vocuolar-type ATPase

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[1]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[2]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[3]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[4]	杨彩会, 刘启成, 董明, 王丽娜, 左美娜, 陆颖, 牛卫东. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3654-3659.
[5]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.
[6]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.
[7]	张振华, 刘姿辰, 禹宝庆. 聚己内酯及其复合材料在组织工程骨构建中的地位与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3571-3577.
[8]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[9]	许辉, 康冰心, 钟声, 高晨鑫, 赵翅, 邱国伟, 孙松涛, 解骏, 肖涟波, 施杞. 点按局部腧穴与坐位调膝法联用治疗膝关节骨关节炎：随机对照研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 216-221.
[10]	李松桃, 李欣奕, 宋云峰, 宁加银, 任强, 杨仁旭, 彭波. 麻杏芎葶合剂干预肺心病急性发作模型小鼠肺组织重构和肺血管重塑相关因子的表达 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 274-280.
[11]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.
[12]	汪鎏, 宋东哲, 黄定明. 骨形态发生蛋白9调控干细胞分化与骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3064-3070.
[13]	辛鹏飞, 柯梦楠 , 张海涛, 乌日莎娜, 李子祺, 庄至坤, 魏秋实, 何伟. 活血化瘀中药治疗股骨头坏死共同作用机制的网络药理学数据[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2727-2733.
[14]	张为, 崔帅帅, 周志超, 胡小华, 杨晓红. 微小RNA调控组蛋白去乙酰化酶治疗骨相关疾病的发展现状[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2767-2774.
[15]	付力伟, 杨振, 李浩, 高仓健, 眭翔, 刘舒云, 郭全义 . 亲和肽在软骨组织工程中应用的新策略和问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2569-2574.