人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6116-6122.

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人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

张元豫¹，郭永荣¹，刘霞²，李坤¹

1新疆自治区人民医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2新疆医科大学第一附属医院病理科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2014-06-24 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 李坤，副教授，硕士生导师，新疆自治区人民医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:张元豫，男，1974年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读博士，主要从事脊柱和关节外科研究。
基金资助:
新疆自然科学基金(2011211A054)

Recombinant mycobacterium tuberculosis heat shock protein 10 in human osteoclast differentiation

Zhang Yuan-yu¹, Guo Yong-rong¹, Liu Xia², Li Kun¹

1Department of Orthopedics, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Pathology, the First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-06-24 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Li Kun, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Yuan-yu, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A054

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外小鼠颅盖骨实验已证实了其结核杆菌热休克蛋白10的破骨效应。
目的：在诱导破骨细胞分化的体外细胞培养系统中，研究重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞分化的影响及相关机制。
方法：选用人巨噬细胞集落刺激因子依赖性附着性血液单个核细胞，实验分为：核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、核因子κB受体活化因子配体组、重组结核杆菌热休克蛋白10组(1 mg/L)、阴性对照组(完全培养基)，核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、重组结核杆菌热休克蛋白10组中重组结核杆菌热休克蛋白10质量浓度为1 mg/L，在含有巨噬细胞集落刺激因子的a-MEM培养液重悬单核细胞，各组培养7，14，21 d后，观察所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色多核细胞的形态、数目、骨吸收面积；各组NFATc1、c-Fos基因及蛋白表达情况。
结果与结论：阴性对照组无抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成，其余各组均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成，并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝；重组结核杆菌热休克蛋白10组形成的破骨细胞分化细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组；阴性对照组 NFATc1、c-Fos基因表达水平显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组和重组结核杆菌热休克蛋白10组，而重组结核杆菌热休克蛋白10组表达NFATc1、c-Fos蛋白，显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组。提示结核杆菌热休克蛋白10参与破骨细胞分化的形成，可能与诱导相关基因NFATc1、c-Fos表达上调有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 重组结核杆菌热休克蛋白10, 破骨细胞；单个核细胞, NFATc1, c-Fos, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The mycobacterium tuberculosis heat shock protein 10 exerts effects on the osteoclasts by in vitro mouse cranium experiment,
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of recombinant mycobacterium tuberculosis heat shock protein 10 (CPN10) on the differentiation of osteoclasts in the in vitro culture system that induces osteoclast differentiation.
METHODS: Human macrophage colony-stimulating factor-dependent adhesive blood mononuclear cells were divided into four groups: receptor activator for nuclear factor-κB ligand (RANKL)+CPN10 (1 mg/L), RANKL, CPN10 (1 mg/L), and negative control (complete culture medium). Monocytes were resuspended in a-MEM medium containing macrophage colony-stimulating factor, and were cultured in each group for 7, 14, 21 days. The morphology, quantity and bone resorption area of osteoclasts were examined by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The expressions of NFATc1 and c-Fos gene and protein were also detected.
RESULTS AND CONCLUSION: In negative control group, no TRAP-positive multinucleated osteoclasts generated, while in the other groups, TRAP-positive multinucleated osteoclasts differentiated and formed the lacunae in the small bone grinding. The number of osteoclasts formation and resorption in CPN10 group were significantly lower than that in RANKL+CPN10 group. The expression of NFATc1 and c-Fos in the negative control group C was significantly lower than that of RANKL+CPN10 group and CPN10 group. However, CPN10 expressed NFATc1 and c-Fos protein, which was significantly lower than RANKL+CPN10 group. CPN10 is involved in the formation of osteoclasts, and the mechanism is related with the upregulation of NFATc1, c-Fos expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoclasts, NFATC transcription factors, genes, fos

中图分类号:

R318

张元豫，郭永荣，刘霞，李坤 . 人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6116-6122.

Zhang Yuan-yu, Guo Yong-rong, Liu Xia, Li Kun. Recombinant mycobacterium tuberculosis heat shock protein 10 in human osteoclast differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6116-6122.

图/表（结果） 5

2.1 体外培养的人破骨细胞的形态在核因子κB受体活化因子配体+巨噬细胞集落刺激因子组中，细胞培养的第1天，各组细胞为形态均一的单个核细胞，呈圆形或椭圆形，可见极少量的多核大细胞(图1A)。培养第7天开始，贴壁的单个核细胞形态上逐渐伸展，相比头几天时细胞体积增大明显(图1B)；培养第14天时，相比第7天有的细胞表现的体积就更显的明显增大，在细胞聚集区可观察到部分单个核细胞开始融合，含有2个细胞核的细胞多见，细胞形态总体上还是呈现圆形或椭圆形(图1C)。

培养第21天时，细胞呈现多种形态，如：不规则形、大的椭圆形、彗星形等，部分破骨细胞可见带一小尾巴，胞浆内可见空泡影或多个细胞核(图1D)，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色可见抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性多核巨细胞形成，胞浆成酒石红，细胞核成淡黄色(图1E，F)。

2.2 重组结核杆菌热休克蛋白10对人破骨细胞形成的影响重组结核杆菌热休克蛋白10组中，能诱导形成抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞，其数量和体积与核因子κB受体活化因子配体组比无明显的差异(图2)。

核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组中形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞与其他3组相比，体积明显增大，细胞中的胞核数目也明显增多，培养至第14天和第21天时，所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞数明显多于其余组，差异有非常显著性意义(P < 0.01，图2)。

2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨吸收陷窝检测结果核因子κB受体因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组培养第21天细胞作抗酒石酸酸性磷酸酶染色，阳性染色细胞呈红色，定位于胞浆，阴性染色细胞呈黄色(图3A)，瑞氏-吉姆萨染色，细胞浆染色呈淡紫色，细胞核染色呈紫红色(图3B)。接种培养21 d后的小牛骨磨片甲苯胺蓝染色，光镜下观察骨磨片上，见骨吸收陷窝，呈蓝紫色圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态，边界较清楚。每孔小牛骨磨片随机选取20个骨吸收陷窝，计算其平均面积，数值/5代表该磨片的陷窝数目及面积(图3C)。

电镜下观察骨陷窝中的破骨细胞及所形成的骨陷窝，得到多核巨细胞能执行破骨功能的破骨细胞(图4)。重组结

核杆菌热休克蛋白10处理第21天的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性破骨细胞计数、骨吸收陷窝形成数目和面积见表2。

2.4 Realtime PCR检测及Western-blot 检测c-Fos、NFATc1 mRNA及蛋白水平核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组检测c-fos和NFATc1基因mRNA表达水平显著增高，与所形成的破骨细胞数量和功能相符，提示结核杆菌热休克蛋白10能协同核因子κB受体活化因子配体是通过促进破骨细胞形成相关基因c-fos和NFATc1的表达(表3)。

Western-blot检测核因子κB受体活化因子配体组 1 mg/L重组结核杆菌热休克蛋白10细胞处理30 min、24 h及48 h的c-Fos、NFAT c1蛋白条带见图5。核因子κB受体活化因子配体组中NFATc1蛋白(M_r92 000)表达随时间增加不明显，c-Fos蛋白(M_r62 000)随时间的延长而表达增加明显。

以上实验结果提示：重组结核杆菌热休克蛋白10在无核因子κB受体活化因子配体时，直接或间接地激活核因子κB通道，引起c-Fos、NFAT c1蛋白表达。

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引言

破骨细胞是参与骨代谢，行使骨吸收功能的重要骨细胞，目前主要观点认为其来源于骨髓造血干细胞，由单个核细胞融合成的(细胞核≥ 3)多核细胞。破骨细胞分化因子(核因子κB受体活化因子配体)和巨噬细胞集落刺激因子是由骨髓基质细胞或成骨细胞分泌的两种重要的细胞因子^[1-2]，也是破骨细胞分化所必需的，除此之外多种细胞因子和激素等通过直接或间接的途径对破骨细胞的分化、形成和功能进行调节。脊柱结核引起椎体骨质破坏，脊髓受压，神经功能损害，而结核杆菌热休克蛋白10是一种结核杆菌分泌到周围环境中的分子伴侣素^[3]，体外小鼠颅盖骨实验已证实了其破骨效应^[4]，主要由活动环和65-70片段引起，但其引起破骨效应的细胞分子机制一直未被阐明。

破骨细胞的形成和分化受多种细胞及其产物的调节，其中巨噬细胞集落刺激因子与核因子κB受体活化因子配体的作用尤为关键，是迄今为止发现的直接参与破骨细胞分化的两种细胞因子。巨噬细胞集落刺激因子参与调节人类破骨细胞发生的多个步骤，目前已知破骨细胞形成的机制是^[5-14]：核因子κB受体活化因子-核因子κB受体活化因子配体-破骨细胞形成抑制因子轴，其中核因子κB受体活化因子是破骨细胞前体上的重要受体；由成骨细胞、骨髓基质细胞等分泌的破骨细胞分化因子(核因子κB受体活化因子配体)，它可促进单个核细胞向破骨细胞分化，增强成熟破骨细胞的破骨活力，阻止破骨细胞凋亡；破骨细胞分化抑制因子存在于骨髓基质细胞、成骨细胞等细胞中，作为与核因子κB受体活化因子配体作用完全相反的细胞因子，它能抑制破骨细胞的分化、成熟破骨细胞的骨吸收、诱导破骨细胞的凋亡^[15]。核因子κB受体活化因子配体与破骨细胞前体上的核因子κB受体活化因子受体结合后^[16]，核因子κB受体活化因子胞内部分与胞内的肿瘤坏死因子受体相关蛋白TRAF6结合，诱导核因子κB通路活化并移位到细胞核内。激活的核因子κB通路能增加c-fos基因的表达，c-Fos与NFATc1结合后启动破骨细胞特异性基因的转录^[17]，从而使破骨前体细胞分化成成熟的破骨细胞执行骨吸收功能。

实验旨在观察人体外破骨细胞培养环境中，重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞分化和形成的影响，了解其引起骨质破坏的机制，探讨其对骨结核防治的启示和临床意义。

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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：于2012年11月至2013年8月在新疆医科大学第一附属医院科技楼完成。

材料：

重组结核杆菌热休克蛋白10对人破骨细胞分化影响实验用主要试剂：
试剂	来源
基础培养基a-MEM、特级胎牛血清	Gibco，USA
重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)	上海生物工程生物有限公司
人重组核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、人重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)	美国PEPROTECH公司
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒	上海杰美公司
抗人c-Fos多克隆抗体、抗人NFATc1多克隆抗体	北京博奥森
PCR引物	上海生工
PCR试剂盒	BIOSystems，USA
扫描电镜JSM-6390LV	JEOL，Japan

实验方法：

细胞培养：6名20-30岁的健康男性志愿者从静脉中分别抽取80-100 mL全血，按照密度梯度离心法分离出人单核细胞，用a-MEM生长培养液与等体积加入了肝素抗凝的全血混合，取FICOLL加入50 mL离心管，将a-MEM与血的混合液沿管壁缓慢加入，保证两者之间有清晰界面， 1 800 r/min离心30 min，获取白膜状单个核细胞层，多次离心后将获取的单个核细胞置于2个25 cm²培养皿中， 37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养24 h后，用培养基清洗3遍，将未贴壁细胞洗脱，剩下的贴壁细胞即为单个核细胞。

用含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、30 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的a-MEM全培养液制备稀释了的细胞悬液，调整细胞浓度为(2.0-3.0)×10⁹L^-¹。分注于2个24孔培养板中，每孔2 mL，其中一板孔预置盖破片以便染色，另外一板预置小牛骨磨片以便观察骨陷窝面积。37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养，第2天换液按照分组加入含质量浓度1 mg/L重组结核杆菌热休克蛋白10条件培养液，共培养21 d，期间每3 d换液1次。

用含巨噬细胞集落刺激因子(30 μg/L)和核因子κB受体活化因子配体(40 μg/L)的a-MEM培养液重悬离心后的单个核细胞并制备成细胞浓度为(2.0-3.0)×10⁹L^-¹的细胞悬液，每2 mL细胞悬液加入到24孔板的每孔中，第2天换液，按照分组加入含质量浓度1 mg/L重组结核杆菌热休克蛋白10和核因子κB受体活化因子配体(40 μg/L)条件培养液，每3 d换1次培养液，共培养21 d。同法将细胞加入预先放置骨磨片的24孔板内，设置核因子κB受体活化因子配体组做阳性对照组，阴性对照组(完全培养基)，以上每组设3个复孔。

分组方法：
分组	处理方法
核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组	40 μg/L核因子κB受体活化因子配体+ 1 mg/L重组结核杆菌热休克蛋白10
核因子κB受体活化因子配体组	40 μg/L核因子κB受体活化因子配体
重组结核杆菌热休克蛋白10组	1 mg/L重组结核杆菌热休克蛋白10
阴性对照组	完全培养基

细胞计数：将24孔板中覆有细胞爬片的细胞分别于第7，14，21天固定后在室温下用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒中自带的固定液固定15 min，磷酸缓冲液(PBS)清洗后行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。细胞胞浆红染的细胞被认为是抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，在倒置显微镜下计数每孔中细胞爬片上抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核(含3 个或3个以上胞核)细胞的数目。

骨吸收实验：单个核细胞按以上设置的实验条件培养21 d后固定，体积分数1%甲苯胺蓝用于小牛骨磨片染色以显示骨陷窝，染色时间通常10 s，骨陷窝被染成蓝色，通过倒置显微镜观察和计数骨陷窝形成。

电镜下观察骨陷窝形成：培养至21 d的小牛骨磨片，2.5%戊二醛4 ℃固定10 min，一部分骨磨片在1 mol/L氢氧化胺中用50 Hz超声清洗5 min后，再经双蒸馏水超声清洗 5 min，以洗去附着在骨磨片上的破骨细胞以利观察骨陷窝，一共3次；另一部分骨磨片在2.5%戊二醛固定2 h后不用1 mol/L氢氧化胺处理，为了获取破骨细胞附着于骨磨片的图片，用1%锇酸固定2 h，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，二氧化碳临界点干燥，镀金，电子显微镜(JSM-6390LV)观察骨磨片上的破骨细胞及其形成的骨吸收陷窝，测量不同实验组中小牛骨磨片上骨陷窝吸收的面积。

Realtime PCR检测：用Trizol分别提取处理48 h后4组细胞的总RNA；按照Realtime PCR Kit说明书将RNA反转录合成cDNA，所用引物见表1。cDNA扩增后在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测。反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s；60 ℃退火60 s；72 ℃延伸1 min；共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。每个实验组检测均重复3次。

检测时PCR仪采集每一反应管中荧光强度的变化，并绘制动力学曲线，得出样品荧光强度增加到阈值时的平均Ct值，计算出待测基因与内参基因GAPDH比较的ΔCt值，进而计算出实验组与对照组ΔCt值比较的ΔΔCt，并依据公式基因相对水平=1/2ΔΔC计算出待测基因NFATc1、c-fos基因的相对水平。

Western-blot检测c-Fos、NFATc1蛋白水平：重组结核杆菌热休克蛋白10组细胞在培养30 min，24 h，48 h后，提取蛋白质，用BCA法测定每个时间点的蛋白质浓度，煮沸变性5 min，凝胶电泳并转膜，分别加入兔抗人NFATc1和兔抗人c-Fos多克隆一抗放置于4 ℃冰箱中孵育过夜。室温下加入二抗并在震荡仪上匀速震荡处理1 h，DAB显色 1 min。以GAPDH作为对照。

主要观察指标：①破骨细胞形态。②重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞形成的影响。③重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞破骨功能的影响。④重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞活化T细胞核因子1蛋白及c-Fos mRNA和蛋白表达的影响。

统计学分析：每个实验重复3次，将获取的每次实验结果取平均值。将4组的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数(≥3个细胞核)和骨吸收面积和各基因Realtime PCR的结果相对表达量采用SPSS 17.0软件进行方差分析。

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讨论

骨与关节是除了肺结核以外体内最易受累的组织，抗结核药物的使用曾经使得结核病得以控制，但因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，结核的整体发病率又有上升趋势，尤其在第三世界国家，据统计世界每100个结核患者中有22个是中国人^[18]，中国结核病的回潮在得到控制前还要有很长的路要走。骨结核病理改变的结果之一就是骨质破坏吸收，POTT病引起椎体结构破坏，脊髓受压，神经功能障碍。在已知引起骨质破坏的因素中^[19]，结核杆菌分泌到菌体外的热休克蛋白10是结核杆菌引起骨质溶解和吸收的主要因素之一，它的活动环和65-70的碱基片段能直接能引起骨质破坏。
有假设认为结核杆菌热休克蛋白10要保持它的活动环稳定性需要与二价金属阳离子螯合^[20-21]，与骨质中二价金属阳离子钙离子螯合，将导致骨骼脱钙，引起骨溶解吸收；另一种假设认为破骨细胞分化因子(核因子κB受体活化因子配体)直接绑定到破骨细胞表面的受体核因子κB受体活化因子^[22]，位置是在以TSIKIPSS序列为中心，这与结核杆菌CPN10的序列SGLVIPDT很相似，据此推断结核杆菌热休克蛋白10与核因子κB受体活化因子能直接连接，启动破骨细胞形成，引起骨质破坏。本实验通过体外细胞学实验验证以往体外实验的同时探讨其引起破骨细胞生成的机制。实验在人单个核细胞体外的细胞培养中，分成不同的实验组，单个核细胞培养21 d后形成典型的破骨细胞数量在核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组显著高于核因子κB受体活化因子配体组和重组结核杆菌热休克蛋白10组，且体积增大，胞核数目增多，形成的骨陷窝的数量和面积较大，尤其重要的是重组结核杆菌热休克蛋白10组能单独诱导出破骨细胞，虽然细胞数量、骨陷窝数量级面积上较核因子κB受体活化因子配体组少没有统计学意义。NFATc1和c-Fos的Real time表达核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组的表达量最高，且与其他组比差异有显著性意义，而核因子κB受体活化因子配体组和重组结核杆菌热休克蛋白10组的表达量差异无统计学意义，阴性对照组各项表达量均明显较低；这两种蛋白也都有表达。以上实验结果提示：重组结核杆菌热休克蛋白10组能产生破骨细胞，支持重组结核杆菌热休克蛋白10能替代核因子κB受体活化因子配体作用的假设，激活核因子κB受体活化因子配体通道引起破骨细胞的生成；核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10同样诱导破骨细胞生成，且有更强形成破骨细胞的数量和功能的能力，说明重组结核杆菌热休克蛋白10能增强核因子κB受体活化因子配体的作用。Weston实验证实了NFATC 1、c-Fos蛋白表达的，进一步支持重组结核杆菌热休克蛋白10诱导破骨细胞形成是通过核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子配体-破骨细胞形成抑制因子轴中的核因子κB通道。通过本实验得出以下结论：在无核因子κB受体活化因子配体情况下，重组结核杆菌热休克蛋白10直接或间接地激活核因子κB通道引起破骨细胞增多，在核因子κB受体活化因子配体存在时可以加强核因子κB受体活化因子配体作用促进破骨细胞的功能。

引起骨结核骨质破坏的因素除了结核杆菌分泌的蛋白，还有炎症细胞分泌的众多炎症因子，其中以白细胞介素1、白细胞介素6及肿瘤坏死因子a等为主要炎症因子^[23-30]，其多数通过核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子-破骨细胞形成抑制因子轴发挥作用，或虽不依赖但较核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子-破骨细胞形成抑制因子轴所起的作用弱，利用现有干扰核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子-破骨细胞形成抑制因子轴的药物如：阿仑膦酸等针对重组结核杆菌热休克蛋白10的作用环节进行进一步的实验研究，是作者下一步要做的工作。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

Recombinant mycobacterium tuberculosis heat shock protein 10 in human osteoclast differentiation

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