富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide修复兔牙槽骨临界骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究发现，富血小板血浆可促进骨、软组织损伤修复，但在骨愈合过程中的作用仍存在争议，目前尚无定论。
目的：对比观察富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide在兔牙槽骨缺损修复过程中的成骨效果，以探讨富血小板血浆在骨损伤愈合中的作用。
方法：选择新西兰大白兔16只，手术建立兔下颌牙槽骨临界骨缺损模型，采取自身对照，随机选择一侧下颌骨以富血小板血浆/Bio-Oss/Bio-Gide修复骨缺损(实验侧)；另外一侧以Bio-Oss/Bio-Gide修复骨缺损(对照侧)。分别于术后2，4，8，12周时各处死4只，通过大体观察、X射线观察、CBCT骨密度测定、组织学切片观察以及新生骨占缺损面积百分比的测定，定性及定量分析牙槽骨缺损区的成骨效果。
结果与结论：术后2-12周的X射线、CBCT及组织学切片观察显示，实验侧和对照侧均有不同程度的新骨形成以及植骨材料的降解吸收；12周时，实验侧缺损表面可见连续的皮质骨形成，植骨区新骨形成并趋于成熟，植骨材料降解吸收明显，对照侧修复效果次之。在术后2，4，8，12周各时间点，实验侧骨密度值均低于对照侧(P < 0.05)，实验侧新生骨占面积百分比均大于对照侧(P < 0.05)。说明在兔下颌牙槽骨缺损修复中，富血小板血浆/Bio-Oss/Bio-Gide比Bio-Oss/Bio-Gide具有更好的成骨效果，表明富血小板血浆可促进新骨的形成以及Bio-Oss骨粉的降解吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 富血小板血浆, 牙槽骨缺损, 临界骨缺损, 引导骨组织再生, Bio-Oss骨粉, Bio-Gide骨膜, 兔

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that the platelet-rich plasma (PRP) can promote bone and soft tissue injury repair, but its effect on the process of bone healing is still controversial.
OBJECTIVE: To contrastively observe the osteogenesis effect of PRP/Bio-Oss/Bio-Gide in the repair process of alveolar bone defect in rabbits, so as to explore the role of PRP in bone healing.
METHODS: Sixteen New Zealand white rabbits were used to establish animal models of critical-size alveolar bone defect. One side was damaged randomly and repaired by PRP/Bio-Oss/Bio-Gide as experimental side, and the other side repaired by Bio-Oss/Bio-Gide as control side. Four animals were executed at each time-point, postoperative weeks 2, 4, 8, 12. Through general observation, X-ray radiograph, Cone Beam CT assessment, histological examination, the osteogenesis effect in the defect region was qualitatively and quantitatively analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: It could be know from each observation index that as time went on, the experimental and control sides had a different degree of new bone formation and the degradation-absorption of bone graft material. At 12 weeks, continuous cortical bone formation was seen on the surface of the experimental side, new bone formed and tended to be mature, obvious degradation of the bone graft was found, but those in the control side were not as good. At each time-point of 2, 4, 8, 12 weeks, the bone mineral density of the experimental side were lower than that of the control side (P < 0.05), but the percentage of new bone area was
larger than in the experimental side than the control side (P < 0.05). These findings indicate that the PRP/Bio-Oss/ Bio-Gide has a better osteogenesis effect than the Bio-Oss/Bio-Gide in the repair process of alveolar bone defect in rabbits, and PRP can promote new bone formation and degradation-absorption of Bio-Oss.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: alveolar bone loss, guided tissue regeneration, platelet-rich plasma

中图分类号:

R318

梁恒燕，焦鑫，王洋，葛振林. 富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide修复兔牙槽骨临界骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6079-6084.

Liang Heng-yan, Jiao Xin, Wang Yang, Ge Zhen-lin. Application of platelet-rich plasma composited Bio-Oss/Bio-Gide to repair a critical-size alveolar defect in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6079-6084.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析及大体观察 16只大白兔无感染及其他系统疾病发生，创口愈合良好，愈合处黏膜平整或轻微皱褶，色泽正常，无创口裂开及膜暴露。16只大白兔全部进入结果分析。

2.2 X射线片观察

术后2周：实验侧和对照侧植骨区均呈现高密度阻射影(图2A，B)。

术后4周：对照侧植骨材料仍然清晰可见(图2C)，实验侧植骨材料逐渐吸收，植骨区与正常骨组织界限较模糊(图2D)。

术后8周：对照侧植骨材料颗粒感存在(图2E)，实验侧缺损修复区骨质均匀化(图2F)。

术后12周：对照侧植骨材料残留较多(图2G)，实验侧植骨材料隐约可见，缺损上缘骨皮质桥连(图2H)。

随着时间的推移，对照组和实验组植骨区均有不同程度的新骨形成和植骨材料的降解吸收，实验侧相对成骨均匀。

2.3 CBCT观察及骨密度测量结果在术后2，4，8，12周各时间点，实验侧骨密度值均低于对照侧，差异有显著性意义(P < 0.05)，且随着时间的延长，实验侧及对照侧的骨密度逐渐降低，见表1。

2.4 组织学观察实验所建立的临界骨缺损模型，自行修复12周后，缺损区只见短而小的骨小梁，骨髓腔弥散稀薄，未形成骨桥连(图3)。

术后2周时，实验侧可见骨粉颗粒周围一薄层新形成的骨，成骨细胞排列成行，成骨活跃，纤维结缔组织包绕新骨和骨粉颗粒；对照侧新骨形成较少，骨粉颗粒排列紧密(图4A，B)。

术后4周时，实验侧较对照侧新骨形成多，成骨细胞多见，成骨活跃(图4C，D)。

术后8周时，实验侧新骨形成较多，新形成骨边缘成骨细胞排列规则，骨小梁连接成网状结构，趋向成熟，植骨材料形态及结构不完整；对照侧新骨生成，但不及实验侧均匀、规则(图4E，F)。

术后12周时，实验侧可见大片的骨组织形成，骨板排列规则，骨髓腔形成，血供丰富，植骨材料体积明显变小；对照侧亦有新骨形成，趋向成熟，植骨材料残留量较实验侧多，降解程度不及实验侧(图4G，H)。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机自身对照动物实验。

时间及地点：于2011年4月至2012年3月在兰州大学GLP实验中心及口腔医学院实验室完成。

材料：

实验动物：4-6月龄健康成年新西兰大白兔16只，雌雄不限，体质量2.5-3.0 kg，由兰州大学医学实验中心提供，许可证号：SCXK(甘2009-0004)。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide修复兔牙槽骨缺损实验用材料和试剂：
材料和试剂	来源
Bio-Oss骨粉、Bio-Gide骨膜	瑞士盖氏制药有限公司
牛凝血酶	美国Sigma公司
无水CaCl₂分析纯	北京天然生物有限公司
3.8%枸橼酸钠	中国医药集团试剂公司
速眠新Ⅱ	长春农牧大学兽医研究所
利多卡因	山东华鲁制药有限公司

方法：

实验分组及设计：随机选择一侧下颌骨，以富血小板血浆/Bio-Oss/Bio-Gide修复骨缺损，作为实验侧；另外一侧以Bio-Oss/Bio-Gide修复骨缺损，作为对照侧。

建立兔下颌牙槽骨临界骨缺损模型：实验动物饲养观察1周后开始实验，动物称质量，速眠新Ⅱ按0.30 mL/kg的剂量，肌肉注射麻醉。常规消毒铺巾，于下颌第一磨牙近中牙槽嵴顶及颊舌侧局部注射2%利多卡因加1/1 000盐酸肾上腺素，从下颌第一磨牙近中牙槽嵴顶切开黏膜至骨面，切口向近中延伸，长约5 mm，用刮匙钝性分离，暴露下颌第一磨牙牙颈部及近中牙槽嵴顶骨质，用慢速弯机及配套方柱形裂钻去骨，深度为8 mm，颊舌向扩展，注射生理盐水降温，去骨完成后，用微创铤子楔入下颌第一磨牙远中牙槽间隔，向近中及牙合向施力，将其推向去骨区，完整拔除，然后用带球钻的慢速手机进行颊舌向、近远中向适当扩展，并修整缺损上缘，消除尖锐骨嵴，使其平整，手术形成长×宽×高为6 mm×5 mm×8 mm的骨缺损。整个手术过程中严格无菌操作，防止感染。

制备富血小板血浆：在手术麻醉前，从兔耳中动脉处用3.8%枸橼酸钠抗凝剂润湿好的注射器采血8 mL左右，全血与3.8%枸橼酸钠抗凝剂以5∶1的比例混合。将8 mL全血进行二次离心法制备而得0.8 mL左右的富血小板血浆^[11]，见图1A，B。取20 μL全血以及20 μL富血小板血浆进行血小板计数，计数工作重复3次，求其平均值。本研究所采用的富血小板血浆中的血小板数量为全血中血小板数量的4倍以上^[12-13]，否则重新采血制备富血小板血浆。

植入成骨材料：实验侧将含有1 000 U/mL牛凝血酶的10%CaCl₂溶液按体积比为1∶9加入富血小板血浆中(即 1 mL富血小板血浆+0.5 mL激活剂)，摇匀，富血小板血浆被激活，再与Bio-Oss骨粉混合(约0.05 g/术区)，形成凝胶状(图1C)。

随机将一侧下颌牙槽骨缺损作为实验组，充填富血小板血浆与Bio-Oss骨粉的复合物(图1D)。覆盖Bio-Gide骨膜(8 mm×8 mm)，覆盖范围超出骨缺损边缘2 mm以上，褥式缝合固定骨膜(图1E)。间断缝合牙龈，使创口缝合严密、平整，无膜外露。对照侧：将与同侧富血小板血浆等量的生理盐水与Bio-Oss骨粉混合(约0.05 g/术区)后，同上方法及步骤植入，覆盖Bio-Gide骨膜，缝合。

术后护理：术后给予青霉素肌肉注射预防感染，40×10⁴ U/次，1次/d，连续7 d。由于下颌骨两侧都有创伤，给予软质饲料，持续1周，视其饮食及创伤恢复情况，恢复正常喂食。

标本采集与处理：于术后2，4，8，12周，采用过量速眠新Ⅱ麻醉剂耳缘静脉注射法处死实验动物，取下颌植骨区包括周围牙齿、牙龈，固定于体积分数10%甲醛溶液中。

主要观察指标：

大体观察：术后密切关注实验动物的精神状态、饮食等活动，观察创口的愈合情况。

X射线片观察：拍摄X射线片，观察牙槽骨缺损区的新骨形成及植骨材料的降解吸收情况。

CBCT观察及骨密度测定：采用口腔CBCT，观察缺损区的修复情况，每个标本选择3个矢状截面，层厚0.8 mm，每个截面的3个区域(牙颈部，根中，根尖)，测定每单位面积(1 mm²)牙槽骨缺损修复区的骨密度值，该值表示选中区域灰度与整体图像灰度比值，为相对值^[14]。

组织学切片观察：将标本与脱钙液按体积比1∶20浸泡4-7 d，平行牙长轴近远中向取材，脱水，包埋，按0.5 μm层厚切片，常规苏木精-伊红染色。定性分析：新骨形成以及植骨材料的吸收降解情况；定量分析：每个标本获取2张切片，每张切片低倍镜下选择3个视野，计算机采集图像，通过Photoshop图像分析软件测定新骨形成面积占视野总面积的百分比。

统计学分析：采用SAS 9.2统计学软件，对同一时间点时实验侧与对照侧骨密度值、新骨形成占面积百分比结果比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

在牙周、种植、颌面外科、正畸等各个领域，牙槽骨的形态、高度及宽度的有效重建是口腔各项治疗实施及疗效保持的必要前提。目前应用较多的牙槽骨缺损修复以及增量方式包括组织工程成骨、牵张成骨、引导骨再生、骨移植等。本实验应用引导骨再生技术，观察富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide在临界骨缺损修复中的成骨效果。

本实验所建立的牙槽骨临界骨缺损实验动物模型：长×宽×高为6 mm×5 mm×8 mm，让其自行修复12周，通过大体观察、X射线观察及组织学切片观察，其未形成骨桥连，只见少量短而小的骨小梁充斥于骨髓腔中，满足临界骨缺损的要求，即大于自身修复能力的骨缺损范围，特点是在骨断端的两侧虽有骨生长现象，但不能桥接缺损，形成骨不连^[15]。因此，利用该方法建立牙槽骨临界骨缺损来研究骨替代材料和富血小板血浆复合的成骨效果，实验结果较为可靠。

Bio-Oss骨粉颗粒的内表面积为97 m²/g，孔隙率65%，晶体直径为10-60 nm，与人体松质骨内表面积为 50-90 m²/g，孔隙率71%，晶体直径为10-50 nm基本相近^[16]。大量的动物实验及临床试验表明：Bio-Oss骨粉的多孔状结构能为新骨的长入提供良好的支架，并实现新骨的“爬行替代”，显著的骨引导特性使其被公认为良好的骨替代材料以及组织工程支架材料^[16-18]，但其缺乏成骨细胞和骨生成因子等活性成分，因而缺乏骨生成性和骨诱导性^[16]。

富血小板血浆是由全血进行梯度离心而得的血小板浓缩物，其富含各种生长因子，如：血小板源性生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等，各种因子发挥着促进细胞聚集、分化，促进胶原合成，促进毛细血管形成等作用^[19]，在颌骨缺损修复、软组织损伤修复、牙周组织修复中均发现其积极作用。但也有部分国内外报道称未发现富血小板血浆的促进骨修复、加速软组织愈合等作用，总结其原因可能是，不同研究中，富血小板血浆制备技术的差异；不同的实验动物的组织代谢差异；不同实验制作的缺损模型的差异；不同富血小板血浆浓度以及术后不同观察时间点的差异所致^[19]。因此，基于卢萌等^[11]的研究结果，本实验所采用的富血小板血浆制备方法(一次离心力200× g 10 min，二次离心力1 200× g 10 min)，以保证其有效的浓度和活性。

本实验通过X射线片及CBCT两种影像学检查手段来定性及定量分析牙槽骨缺损区的修复情况。X射线结果显示：植骨区密度较高，Bio-Oss骨粉颗粒呈高密度的阻射影像，随着时间的推移，骨缺损区新骨形成，植骨材料所占面积减小，复合富血小板血浆修复组成骨和植骨材料降解现象更明显。CBCT骨密度测定结果也显示，植骨区的骨密度随时间呈递减趋势，对照侧骨密度普遍高于充填富血小板血浆与Bio-Oss骨粉复合物的实验侧，说明富血小板血浆在一定程度上有加速植骨材料降解的作用。CBCT具有高分辨率，更小的辐射剂量，在观察颌骨硬组织的细微结构，骨形态计量和三维有限元分析方面有其独特的优势^[20-21]，实验充分利用其优势，测定牙槽骨缺损修复区骨密度，以此来评价成骨效果。

本实验的组织学切片观察结果表明：在术后2周时，充填富血小板血浆与Bio-Oss骨粉复合物的实验侧成骨活跃，成骨细胞排列成行，可见薄层的新骨形成并包绕植骨材料，仅植入Bio-Oss骨粉的对照侧则表现为骨粉颗粒拥挤排列，之间夹杂纤维结缔组织，成骨不活跃；术后8周时，实验侧较对照侧骨粉颗粒降解吸收明显；术后12周时，实验侧可见较多的骨小梁结构，并包含骨髓腔，趋于成熟，少量未吸收的骨粉颗粒残片；对照侧可见新骨形成，但还是不及实验侧数量多，局部有成骨较好区域，纤维结缔组织较多。组织学切片新生骨所占视野面积百分比计量结果显示，实验侧在2，4，8，12周时，新生骨所占面积百分比均较对照侧大，在一定程度上反映了富血小板血浆对牙槽骨缺损修复的促进作用，且在2周时对比鲜明，实验侧从最初的骨缺损修复就较对照侧快且活跃。

在以往研究中，有学者曾提到，Bio-Oss骨粉颗粒降解吸收过程非常缓慢。Arau’jo等^[22]动物实验结果表明，在12个月时组织学切片观察，Bio-Oss骨粉颗粒仍部分存在，呈现为不活跃的填充物。Piattelli等^[23]临床试验结果显示，在行上颌窦提升术后4年，Bio-Oss骨粉颗粒仍存在于植骨区中，但随着时间的推移，Bio-Oss骨颗粒的数量呈逐渐减少趋势。这就说明，单纯植入Bio-Oss骨粉颗粒，其自然的吸收降解很漫长，结合本实验结果，可发现在Bio-Gide膜屏障及富血小板血浆的作用下，保证良好的血供以及活性成分的聚集，Bio-Oss骨颗粒的吸收降解进程加快，与新骨形成相适应。

本实验结果表明，在兔牙槽骨缺损修复中，富血小板血浆复合Bio-Oss/Bio-Gide比Bio-Oss/Bio-Gide具有更好

的成骨效果，说明富血小板血浆可促进新骨的形成以及Bio-Oss骨粉的降解吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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