人卵巢组织冷冻保存及其评价方式的研究与进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.025

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5885-5890.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.025

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人卵巢组织冷冻保存及其评价方式的研究与进展

张玲，彭涛，于艳玲

新疆维吾尔自治区妇幼保健院生殖医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

修回日期:2014-06-07 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 于艳玲，主任医师，硕士生导师，新疆维吾尔自治区妇幼保健院生殖医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:张玲，女，1986年生，甘肃省张掖市人，汉族，2012年新疆大学毕业，硕士，主要从事生殖医学的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目(201317105)；乌鲁木齐市科技计划项目(Y121320016)

Cryopreservation of human ovarian tissue and the evaluation methods

Zhang Ling, Peng Tao, Yu Yan-ling

Reproductive Medical Center, Maternal and Child Health Hospital of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-06-07 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Yu Yan-ling, Chief physician, Master’s supervisor, Reproductive Medical Center, Maternal and Child Health Hospital of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Ling, Master, Reproductive Medical Center, Maternal and Child Health Hospital of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
High-Technology Research and Development Program of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 201317105; Science and Technology Program of Urumqi, No. Y121320016

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何保存有生育需求的患者的卵巢功能使其能获得一定的生育能力，具有重要的意义及广阔的应用前景。
目的：综合近年来卵巢组织冷冻的相关研究，对保存及评价方法作以综述，以探讨如何建立最佳的卵巢组织冷冻方案。
方法：由第一作者检索1994年1月至2014年1月PubMed数据及万方数据库相关文献。英文检索词为ovarian tissue，ovarian tissue cryopreservation，freezing factors；中文检索词为卵巢组织，卵巢组织冷冻，冷冻影响因素。纳入与卵巢组织冷冻技术、影响冷冻化效果的因素、冷冻组织复苏及人卵巢组织移植相关的文献59篇进行分析。
结果与结论：目前，卵巢组织冷冻主要分为慢速冷冻、快速冷冻及玻璃化冷冻技术，而不同的患者、组织切片的大小、冷冻保护剂种类、渗透时间及冷冻载体的不同，都会影响到冷冻效果。卵巢组织复苏后，主要通过组织学显微镜下观察卵泡及颗粒细胞的形态并进行计数，观察亚细胞结构的改变评价冻融效果；凋亡信号的检测；免疫组织化学分析检测复苏后增殖及凋亡相关的信息；体外培养检测内分泌水平的变化；基因水平的检测等。近年来，卵巢组织冷冻后的临床应用是将冷冻复苏后的组织进行移植，使患者恢复生殖内分泌功能，或获取成熟的生殖细胞，从而保存女性生育能力。然而，卵巢组织冷冻仍存在一些问题尚需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 移植, 组织构建, 卵巢组织, 卵巢组织冷冻, 冷冻影响因素, 评价, 临床应用

Abstract:

BACKGROUND: How to preserve the fertility and ovarian function in patients with procreation needs has important significance and broad application prospects.
OBJECTIVE: To summarize the recent studies about ovarian tissue cryopreservation, preservation and evaluation methods, and to explore the best solution for ovarian tissue freezing.
METHODS: An online computer-based retrieval of PubMed database and Wanfang database between January 1994 and January 2014 was performed by the first author. The key words were ovarian tissue, ovarian tissue cryopreservation, freezing factors in English and Chinese. Finally 59 literatures on the ovarian tissue cryopreservation technique, influencing factor of cryopreservation, resuscitation, and human ovarian tissue transplantation were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Currently, laboratory methods of ovarian tissue cryopreservation are divided into slow-rate freezing, ultra-rapid cooling and vitrification technology. The freezing effect may vary in different patients, tissue sections, cryoprotectants species, penetration time and frozen carrier. After the recovery, the histological morphology of granulosa cells and follicles was observed. The follicles were counted to evaluate ovarian tissue. Freeze-thaw effects were evaluated by observing the changes of subcellular structures. The apoptotic signals were also detected. Immunohistochemical analysis was applied to detect the proliferation after recovery and apoptosis-related information. Variation in the in vitro culture reflected endocrine levels. Genetic level detection was also performed. In recent years, frozen ovarian tissue is clinically applied for the transplantation, to restore reproductive endocrine function of the patients, or get mature germ cells, thereby preserving female fertility. However, there are still some questions about cryopreservation of ovarian tissue, which need further study.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: ovary, freezing, transplantation

中图分类号:

R318

张玲，彭涛，于艳玲. 人卵巢组织冷冻保存及其评价方式的研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5885-5890.

Zhang Ling, Peng Tao, Yu Yan-ling. Cryopreservation of human ovarian tissue and the evaluation methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5885-5890.

图/表（结果） 1

2.1 卵巢组织冷冻技术卵巢组织冷冻技术即将离体的组织或器官保存在低温中并保持其活性。目前主要使用的卵巢组织冷冻方法主要有慢速冷冻、快速冷冻和玻璃化冷冻。

2.1.1 慢速冷冻 1998年，Oktay等^[8]首次将取出的人卵巢皮质组织在-197 ℃液氮中保存。至此之后有很多报道这样的冷冻方法。2004年Donnez等^[9]、2005年Meirow等^[10]、2006年Demeestere等^[11]以及2010年Serrano等^[12]均报道慢速冷冻卵巢组织，解冻后自体移植，或进行辅助生殖技术获得自然妊娠或活婴分娩。这些研究证实了慢速冷冻法可使卵巢组织保存卵泡质量，并能获得具有生殖潜能的卵巢组织。

2.1.2 快速冷冻 快速冷送通常的方法是将卵巢组织置于含低浓度(1.5 mol/L)的冷冻保护剂中。在液氮蒸汽中放置> 12 h后投人液氮中保存^[13]。目前对于该方法的报道不多。其有效性需进一步研究。

2.1.3 玻璃化冷冻 在20世纪90年代初期，有许多学者将卵巢组织进行玻璃化冷冻，并取得一系列的成功。在1996年出现第1例关于人卵巢组织低温保存的报道^[14]。Wang等^[15]研究表明，玻璃化冷冻较慢速冷冻法可以更好地保存人卵巢组织的间质细胞、胶原束、细胞间隙及始基卵泡。Keros等^[16]报道人卵巢组织玻璃化冷冻后对卵泡的保存效果与慢速冷冻相当，但玻璃化冷冻后卵巢基质保存的结构完整性明显优于慢速冷冻组。玻璃化冷冻法使冷冻过程简化，费用低，效率高，具有巨大的发展潜力^[17-19]。

2.2 影响冷冻化效果的因素 目前还没有对卵巢组织冷冻的统一方案，可能影响卵巢组织冷冻的因素，总结如下。

2.2.1 患者的选择 关于卵巢冻存的适应人群相关文献已进行了一些研究^[20-23]，在卵巢冷冻保存过程中，会损失7%的卵泡，移植后新血供建立前还会丧失60%以上的始基卵泡^[24]，因此，卵巢组织必须存有相当数量才能有良好的冷冻效果，必须考虑患者的疾病及年龄因素。不同种类的卵巢疾病，会造成卵巢组织不同程度的损伤。Catherine等^[25]对卵巢组织冷冻的研究发现，随着患者年龄的增大，其卵巢中始基卵泡和初级卵泡的平均密度在不断下降。而现有文献对于卵巢疾病种类、患者年龄及患者其他因素等对冷冻效果的影响还不是很全面，有待进一步研究论证。

2.2.2 卵巢组织标本的大小 卵巢组织块的厚度可能会影响冷冻保护剂的渗透，从而影响冷冻剂的保护作用。目前文献报道大部分卵巢组织块都处理为厚度约1 mm，Meirow等^[26]将人卵巢组织切至厚度为1 mm左右，得到较好的保存效果。李宇彬等^[27]研究表明，0.5-1.0 mm的厚度，卵巢组织与新鲜组对照始基卵泡正常率没有显著的差异。最近，赵硕^[28]对大块人卵巢组织的冻融进行研究表明，15 mm²×(2.0-3.0) mm的人卵巢组织冷冻复苏后卵泡形态及功能良好，冷冻大块卵巢组织具有可行性。

2.2.3 冷冻保护剂 Amorim等^[29]的研究显示，二甲基亚砜与乙二醇效果最好。严晓南等^[30]将二甲基亚砜与乙二醇联合应用，既促进玻璃化过程，提高冷冻效率，又能减少两者的用量，减轻冷冻保护剂的细胞毒性作用。Sheikhi等^[31]联合二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇作为冷冻保护剂对人卵巢组织进行玻璃化冷冻，得到形态正常卵泡的比率达为92.31%(图1)。

Isachenko等^[32]报道单独用渗透性冷冻保护剂比混合应用蔗糖的冷冻保存效果好。Xiao等^[33]研究发现，联合使用低浓度的二甲基亚砜，乙二醇和蔗糖既可以达到很好的冷冻效果，也降低了冷冻保护剂的毒性。因此，冷冻保护剂的选择及其浓度的确定，以及和冷冻方法的结合，需要进一步实验探讨，才能得到最佳冷送效果的保护剂配比。

2.2.4 渗透平衡时间、温度 Babaei等^[34]将卵巢组织放置到平衡液中15 min，再放置到冷冻保护剂中2 min，取得了很好的冷冻效果。Zhou等^[35]冷冻人卵巢组织时，在平衡液中平衡10 min，后在冷冻保护剂中平衡2 min，取得了良好的冷冻效果。

有学者比较了不同预处理温度对卵巢组织冷冻保存的影响，发现4 ℃处理的卵巢组织，解冻后原始卵泡存活率明显高于在37 ℃处理的卵巢组织^[36]。Amorim 等^[37]认为在室温下渗透平衡较低温下平衡效果好，能缩短渗透平衡的时间，从而减少冷冻保护剂的化学毒性。

2.2.5 冷冻载体 近年来，各国学者为了提高冷冻降温速度尝试了多种新的冷冻方案。Santos等^[38]将卵巢组织直接滴落到在液氮中预冷的固体表面进行玻璃化冷冻。Isachenko等^[39]采用一种无载体的微滴法，直接将含组织块的冷冻保护剂以微滴的形式滴入液氮中进行组织冷冻。黄丽萨等^[40]采用直接覆盖玻璃化法冷冻人卵巢组织，冻融后组织内卵泡有体外生长发育的潜力。Wang等^[15]则提出针浸润玻璃化冷冻法，以直径为0.18 mm的针灸针作为冷冻载体，用针灸针穿刺卵巢组织，直接置入液氮中进行玻璃化冷冻。Xiao等^[33]研究显示采用针浸润玻璃化冷冻法能降低冷冻保护剂所需要的浓度，从而降低了冷冻保护剂的毒性。吕艳^[41]提出用吉他琴弦自制冷冻环能较好的保存卵泡及卵巢间质细胞。以上方法均是将卵巢组织直接与液氮相接触，避免了冷冻载体对降温速度的影响，取得了良好的冷冻效果。

2.3 卵巢冷冻组织复苏后的评价

2.3.1 组织学检查 卵巢组织冻融后其功能的发挥依赖细胞结构的完整性。卵巢组织冻融后经组织染色、透射电镜、免疫荧光显微镜的观察分析，能直接看到细胞及亚细胞结构的变化。比较冻融前后不同阶段卵泡分布比例及其结构的变化，是直接有效的显示卵巢组织细胞结构完整性的指标。有研究显示，冻融后卵巢皮质内70%-90%的始基卵泡可以保留^[42]。最常用的组织染色是苏木精-伊红染色，其操作简单，可以观察卵细胞的各种形态变化。现已有较多文献报道有关光镜下卵巢组织切片计数及观察卵泡的研究，该方法操作简单，指示准确，是使用最广泛的方法。透射电镜可以观察亚细胞结构的变化，彭艳等^[43]研究表明，组织学正常的始基卵泡超微结构中可见线粒体、内质网肿胀等亚细胞损伤。而免疫荧光显微镜则可以通过不同的颜色变化，明显的判定细胞是否存活，李云秀等^[44]利用荧光显微镜分析判断卵巢组织中的细胞存活率。透射电镜下可以看到线粒体、内质网、核膜等的亚细胞损伤。

2.3.2 内分泌水平的变化 卵巢是内分泌器官，卵泡是其基本功能单位。体外培养后内分泌功能的检测是评价器官功能变化的必要方面。近年来对于这方面的研究，主要采用放射性免疫法或电化学发光法监测体外培养的冻融卵巢组织在一段时间内培养液中E2、P、T等内分泌激素浓度的变化，以此来揭示卵巢组织内分泌功能，是卵巢组织功能正常的间接指示。孙文枫等^[45]体外培养人冻融后的卵巢组织块18 d，发现随培养时间的延长，E2分泌水平逐渐升高。李云秀等^[44]培养各卵巢组织，E2分泌水平随着时间逐渐上升，第8天达到最高峰，自第10天开始下降。

2.3.3 细胞凋亡DNA检测 原位凋亡检测是从分子DNA水平检测复苏后细胞内内凋亡信号，可原位特异得显示出凋亡细胞。卵泡中卵母细胞或≥50%的颗粒细胞发生凋亡，可以判断卵泡为凋亡卵泡^[46]。最早Demirci等^[47]和Rimin等^[48]最早通过TUNEL法检测到冻融后卵泡凋亡率增加，提示冻融过程可能造成卵泡凋亡。现TUNEL法被认为是后期卵巢组织移植的重要指标之一。

2.3.4 免疫组织化学分析 卵巢组织冷冻中用到免疫组织化学分析，主要是检测复苏后增殖细胞核抗原的表达，以及凋亡相关的检测。增殖细胞核抗原在细胞的增殖启动上起重要的作用，是可以用来评估卵泡的活性，并且颗粒细胞的增殖通常被认为是原始卵泡活化的早起标志^[49]。凋亡相关蛋白可以诱导启动或抑制细胞的凋亡程序，是间接反映细胞凋亡与否的指标^[50]。赵硕等^[28]对冷冻复苏前后增殖细胞核抗原Ki67及凋亡抑制基因Bcl-2进行检测，对不同冷冻方法做出评估。傅晓艳等^[51]对卵泡中凋亡相关蛋白P53及凋亡抑制基因Bcl-2进行检测，指导乙二醇和丙二醇对卵泡凋亡的影响。

2.3.5 基因水平检测 有关基因水平的检测，文献报道很少，仅黄丽丽等^[52]研究了人冷冻卵巢组织中印迹基因胰岛素样生长因子IGF-2/H19差异性甲基化程度及基因表达的影响。经过低温冻存的原始卵泡不仅要保存其正常形态，还需要维持其原有的印迹基因表观遗传学特征，从而保持某些对卵泡生长发育及以后胚胎质量有重要影响的基因的正常表达，是人卵巢组织冷冻需考虑的安全性问题之一。随着分子生物学技术的不断发展，卵巢组织冷冻中各种基因的检测将会成为新的研究热点。

2.4 冷冻卵巢组织的临床应用 卵巢组织的冻融，目的是为了重建卵巢功能，恢复生育能力。Paul Bert在1863年首先描述了卵巢移植。1895年Robert Tuttle Morris完成了首例人卵巢和子宫移植，以及首例人卵巢移植后成功妊娠。Frank在1898年在输卵管自体移植卵巢薄片，患者成功妊娠。

目前人类卵巢组织移植可分为自体移植和异体移植。

2.4.1 自体移植 自体移植适用于严重的妇科疾病或肿瘤并累及卵巢的患者，在治疗结束后进行自体移植，从而保留了卵巢功能，自体移植根据移植部位可分为原位移植和异位移植。

若子宫和输卵管功能正常，原位移植可恢复生育能力，Demeestere等^[53]报道，进行原位移植，观察到有一个优势卵泡，后得到宫内妊娠。Donnez等^[9]报道，1例淋巴瘤的女性患者在治疗后自体原位移植冷冻的卵巢组织。恢复了生育能力并生产下世界上第一例冷冻卵巢组织移植的婴儿。Meirow等^[54]对1例接受化疗后卵巢早衰的患者原位移植冷冻卵巢组织，该患者也生产了一活婴。

异位移植的部位包括腹部皮下、腹直肌、网膜等。Kim等^[55]报道，1例宫颈癌患者于治疗后将冻存的卵巢组织移植到腹直肌，移植28周后，激素水平恢复正常，恢复了基本的卵巢功能。Oktay等^[56]将人冻融的卵巢组织异位移植于腹部皮下，在取出的20个卵细胞中发育成了一个4-细胞胚胎，但没有妊娠。Wolner-Hansscn等^[57]将冻融的卵巢组织移植人前臂皮下，有2个卵泡发育。研究资料表明，异位移植的冷冻卵巢组织有卵泡发育，但均小于15 mm，可能是因为移植部位与卵巢位置的温度和压力有关。

2.4.2 异体移植 异体移植适用于先天性卵巢发育异常、卵巢切除术后、卵巢早衰等。免疫排斥反应是异体移植面临的最大难题。

2.4.3 异种移植 到目前为止人类卵巢组织冷冻保存的异种移植已经成功建立数种动物模型，但还未有由此而出生的后代，而且证实异种移植的最佳位点是肾被膜下，可能是因为此部位血管较丰富^[58-59]。先后有不同研究者将人卵巢组织冷冻保存后，移植入裸鼠或严重联合免疫缺陷鼠的肾被膜下、皮下或腹腔内，卵巢组织不仅能存活，而且其卵泡可进一步发育并分泌激素。

由于伦理问题的限制，原位、异位移植已成为最有前途的应用途径。

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引言

材料方法

讨论

早在十多年前国外已经有很多中心开展了卵巢组织冷冻保存的服务，并且已经建立详单完善的体制和程序。但是在国内，由于医疗技术及伦理问题的限制，卵巢组织冻融及其相关下游技术的研究目前还处于临床实验研究阶段，用于临床服务还需要更多的研究和探讨。

随着研究的不断深入，人卵巢组织冻融技术会日趋完善，卵巢组织冻融技术一旦成熟，就可以广泛应用于人类辅助生殖临床上。对广大育龄女性保持其生育力及性腺功能具有重要临床价值。这样不仅可以使许多单身女性不必担心由于事业而耽误了最佳生育期，而且可能减缓其衰老的进程。

但是，目前针对卵巢组织冷冻，还有许多尚待解决的问题。需要进一步的研究，以获得最佳的冷冻方案，可以减少冷冻带来的损伤，提高卵巢组织复苏后的卵泡成活率。选择冷冻卵巢组织时，要针对不同患者，不同年龄，甚至不同疾病做更广泛的研究，来确定进行卵巢组织冷冻的适合度。复苏后卵巢组织的结构、功能的评价手段需要更多的尝试，筛选行之有效的方法统一标准，可以为确定冷冻方案提供直接的评价依据。移植后卵巢组织在血管再生过程中造成的缺氧损伤，造成大多数始基卵泡死亡，需要选择最佳的移植方法和移植部位，为卵巢组织功能恢复提供最佳的生长发育条件。探讨卵巢组织移植后卵泡发育、细胞成熟及自然受孕能力恢复的可能性。冷冻保存对人类遗传物质传递的稳定性，对基因的转录表达等可能存在着一定的风险，有待大量临床实践的验证。探索恶性肿瘤患者卵巢组织移植后，肿瘤细胞再生的抑制方法。等等问题尚需进一步研究。

随着科学技术的不断进步，人们对始基卵泡体外成熟及发育机制的研究，不断改进人卵巢组织冷冻方法，卵巢组织冷冻技术一定会日趋完善，并具备广阔的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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人卵巢组织冷冻保存及其评价方式的研究与进展

Cryopreservation of human ovarian tissue and the evaluation methods

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