股骨头坏死实验动物模型：分类与实验应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：迄今没有一种理想的动物模型用于股骨头坏死相关研究，是其研究进展缓慢的一个重要原因。
目的：比较各种方式及各种动物造模的优劣及特点，为股骨头坏死的研究模型选择提供参考。
方法：应用计算机检索2006至2014年PubMed 数据库、EMBASE数据库、万方数据知识服务平台、CNKI中国期刊全文数据库，英文检索词 “Osteonecrosis of the Femoral Head、Animal model、Vivo Experiment、Legg Calve Perthes disease、Osteoarthritis、Collapse of the Femoral Head、Trauma、Corticosteroid、Alcohol、Liquid Nitrogen”；中文检索词“股骨头坏死、动物模型、体内实验、Perthes病、骨性关节炎、股骨头塌陷、创伤、激素、酒精、液氮”，共48篇文献纳入。
结果与结论：创伤性股骨头坏死模型模拟了临床上最常见的股骨头坏死的类型，对于Perthes病的模型建立较为成熟。激素性股骨头坏死的模型适合于病因、病理及综合性研究。物理方式建立的模型，可作为模拟临床外科治疗方法研究的动物模型。理想的动物模型需要在髋关节的解剖学、组织学、生物力学等方面与人类相似，其股骨头坏死的病理、病生及影像学进展能模拟整个人类股骨头坏死的过程，来源容易、性价比高、可重复性好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 股骨头坏死, 动物模型, Perthes病, 骨性关节炎, 股骨头塌陷, 创伤, 激素, 酒精, 液氮

Abstract:

BACKGROUND: So far there is not an ideal animal model for clinical research of osteonecrosis of the femoral head, which hinders its development.
OBJECTIVE: To compare the merits and characteristics of different methods and various animal models, and to provide a reference for selection of models of osteonecrosis of the femoral head.
METHODS: Literature search was performed in databases of PubMed, EMBASE, Wanfang, and China National Knowledge Infrastructure, published from 2006 to 2014 by computers. The key words were “Osteonecrosis of the Femoral Head, Animal model, Vivo Experiment, Legg Calve Perthes disease, Osteoarthritis, Collapse of the Femoral Head, Trauma, Corticosteroid, Alcohol, Liquid Nitrogen” in English and Chinese, respectively. Finally, 48 articles were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Traumatic osteonecrosis of the femoral head models simulates the most common clinical type, which is more effective in Legg Calve Perthes disease. Glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head models is more suitable for etiology, pathology and comprehensive research. Physical osteonecrosis of the femoral head models could be used for evaluating treatment methods, such as surgery. The ideal animal models should be similar with human in anatomy, histology and biomechanics; pathology, pathophysiology, and radiographic progression of osteonecrosis of the femoral head can simulate the whole process of human osteonecrosis of the femoral head, and it is easy to be obtained, cost-effective and good repeatable.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: models, animal, femur head necrosis, femur head

中图分类号:

R318

王懋，张长青. 股骨头坏死实验动物模型：分类与实验应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5879-5884.

Wang Yan-mao, Zhang Chang-qing. Experimental animal models of osteonecrosis of the femoral head: classification and experimental applications[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5879-5884.

图/表（结果） 1

2.1 创伤性股骨头坏死模型 临床上，股骨颈骨折所造成的股骨头缺血是股骨头坏死发病的重要原因之一，对实验动物进行手术，例如结扎股骨颈、切除股骨头圆韧带等，从而阻断股骨头血供模拟临床上的发病过程是创伤性股骨头坏死模型的主要方法。

小猪模型是一个经常被用作骨坏死研究的动物模型。Zhang等^[4]发现在未成熟小猪的解剖结构中，股骨干和近端骨骺间没有血管交通支，为结扎股骨颈造成股骨头缺血坏死提供了理论基础。Aruwajoye等^[5]通过在股骨颈部紧密结扎并切断圆韧带的方法在8只五六周大的Yorkshire小猪单侧未成熟的股骨头上建模，而另一侧作为对照组。术后2周，对其中3只的坏死股骨头进行苏木精-伊红染色和TUNEL标记法，另外5只进行结合定量散射电子显像、纳米压痕技术、微裂纹评估进行检测；组织学结果显示在骨小梁及骨髓区分布有大量的坏死细胞，纳米压痕技术软骨下区微裂纹的密度显著增加。此模型是研究LCPD的经典模型，可用于发病机制及防治措施的探索。Shapiro等^[6]用同样的方法成功地构造了小猪股骨头坏死模型，并且证实了坏死的股骨头会继发性地引起相邻髋臼的畸形，同时为髋臼发育畸形这类至今了解甚少的疾病提供了研究模型。而Kim等^[7]在上述方法造模的同时，对小猪的一侧后肢进行截肢以避免负重，结果发现局部的避免负重可以减少坏死股骨头的畸形，并促进血管的再生及骨骺中血栓的吸收，对临床的治疗有一定的参考意义。

有学者用3个月大的新西兰兔造模^[8]，手术切除髋关节囊，完全分离环状韧带及软组织，切断股骨颈基底部，用不可吸收线将分离的股骨头固定在髋臼上以模拟股骨头坏死早期临床阶段，通过CT、MRI及组织学方法发现骺板两侧有坏死斑的分布，而软骨保存，这与人类早期股骨头坏死相似。Hofstaetter等^[9]使用成年的新西兰兔建造股骨头坏死，实验者同时破坏了股骨头的髓内供血及髓外供血：髓内向股骨颈钻孔到达髓腔，髓外环形损伤股骨颈的骨膜的同时结扎圆韧带。术后使用影像学及组织学的方法进行评价，6个月未发现股骨头塌陷，12个月只有13.3%的动物出现了股骨头塌陷，并且只有软骨下骨的骨折，股骨头大体形态并没有显著改变，12个月的造模周期也比较难以接受。

范猛等^[10]用手术方式将SD大鼠的髋关节脱位，切断圆韧带，并破坏股骨颈近端骨膜上的血供，通过影像学及多个组织学方法证实了股骨头出现塌陷，骨小梁结构改变，破骨细胞明显活跃，成功建造了大鼠创伤性股骨头坏死模型。Gao等^[11]通过低速钻头对狗的股骨颈造成Garden IV型骨折，从术后2个月的X射片上观察到未经治疗的股骨颈骨折造成了典型的股骨头坏死。Hang等^[12]使用手术方式对狗造成股骨颈骨折及髋关节脱位，并通过3枚克氏针进行内固定的方式建立了股骨头坏死的动物模型。术后4周X射线显示骨折愈合，骨密度均匀，未出现硬化带及新月征或者塌陷；但苏木精-伊红染色显示有坏死骨小梁并伴微结构的改变。这种方法模拟了临床上常见的股骨颈骨折手术后出现股骨头坏死的过程，曾有学者做过类似研究，但结果不一，重复性较差。

创伤性股骨头坏死动物模型在LCPD的造模上具有重要作用，但对于成人的股骨头坏死，其造模操作复杂、周期长、重复性差、成功率低等缺点较为明显，并不是理想的股骨头坏死模型。

2.2 激素性股骨头坏死的模型 当今，许多疾病，例如系统性红斑狼疮、肾病综合征、支气管哮喘等都需要长期大量的服用激素进行治疗，但其带来的并发症如股骨头坏死等同样是显而易见的。Tong等^[13]通过基因芯片技术发现激素性股骨头坏死小鼠有多种基因的表达发生了显著变化，这些改变的基因包括：血管形成基因、凋亡基因、信号转导基因、氧化应激相关基因等类型，因此可以得出结论是有多种基因参与到了激素性股骨头坏死形成的过程中。

2.2.1 单纯激素性股骨头坏死模型 大剂量及长时间使用糖皮质激素是引起股骨头坏死的一个高危因素，因此国内外有学者给予兔注射甲基强的松龙建模。Yamaguchi等^[14]对30只日本白兔单次肌肉注射20 mg/kg的甲强龙，注射后3周发现股骨及肱骨干骺端有73.3%的兔发生了骨坏死，动物死亡率为0%；Iwakiri等^[15]运用相同的方法通过影像学及组织学方法发现有83%的股骨头坏死率。而Kuribayashi等^[16]则表示4周股骨头坏死率为70%，但动物死亡率为20%。在兔的激素性骨坏死模型中，骨坏死的病灶还会出现在肱骨近端等其余长骨处，不仅仅局限于股骨头，而其股骨头坏死多为早期表现，这些兔的模型均不是理想的股骨头坏死实验动物模型，但可以为股骨头坏死的发病机制研究作为参考。

Nozaki等^[17]对自发性高血压脑卒中大鼠运用甲基强的松龙皮下注射(1 000 mg/60 kg类似于人类激素冲击疗法的剂量)，组织学检测股骨头坏死的发生率要显著大于对照组(P < 0.001)。Tian等^[18]对SD大鼠连续8周注射甲基强的松龙(20 mg/kg, 1次/周)，也成功构建了大鼠的股骨头坏死模型，并证实了激素引导的股骨头坏死模型中，Toll样受体4信号通路(TLR4 signaling pathway)干扰了正常的免疫反应，从而进一步说明了免疫反应的破坏在股骨头坏死中扮演了重要的角色。大鼠有90%的基因与人类一致，喂养时占地面积小，较为经济，而且从解剖学上看来，大鼠的股骨头也同样具有颈干角和前倾角，在生物力学方面与人类相似。但大鼠的股骨头坏死激素模型也有着其局限性：造模周期较长，股骨头形态较难形成塌陷等等。

Erken等^[19]通过对25只Leghorn鸡每周肌肉注射 3 mg/kg甲基强的松龙建立了的股骨头坏死模型，造模的14周过程中有48%的动物死亡，组织学发现了软骨下骨小梁的破坏，但未出现股骨头的塌陷(图1)。鸡与人类同为双足行走动物，股骨头的生物力学相近，这是相较于其他四足行走动物的优势，其股骨头坏死的病理病生过程与人类也相似。但动物死亡率极高，坏死大体表现不典型，基因与人类相差甚远，这些因素造成了鸡作为股骨头坏死模型运用较少的原因。

2.2.2 激素联合内毒素建立股骨头坏死模型 Qin等^[20]建立兔激素型股骨头坏死模型的方式被国内外众多学者所推崇和认可，其方式为静脉注射1次低剂量的内毒素(脂多糖10 μg/kg，多为大肠杆菌型)，之后连续3 d每天肌肉注射1次高剂量的甲基强的松龙(20 mg/kg)。给药6周后，93%的模型兔出现股骨头坏死，其中有25%的病灶集中在干骺端，实验动物死亡率为0%。这种造模方式具有成功率高、死亡率低、造模方式简便等优点，是目前公认的较为理想的激素性股骨头坏死模型。Wu等^[21-22]在Qin等的造模方式上增加了1次低剂量内毒素(脂多糖10 μg/ kg)，但其造模结果却有所下降：股骨头坏死的发生率降低了3%，死亡率上升了6.2%。有学者运用大肠杆菌内毒素联合甲强龙构建兔的股骨头坏死模型^[23]，间隔24 h给予2次内毒素(10 μg/kg)后间隔 24 h给予3次更高剂量的甲基强的松龙(40 mg/kg)，6周后MRI发现双侧股骨头骨髓腔出现脂肪沉积，组织学表面骨小梁变得稀少的同时空腔增多。

Guan等^[24]使用日本白兔作为动物模型，对比注射内毒素(40 μg/kg)后再注射泼尼松(20 mg/kg)，和单独注射泼尼松(20 mg/kg)的方法，3周后发现内毒素组的股骨头坏死率更高，原因是由于内毒素导致血液处于高凝状态，股骨头内血管更容易有血栓形成。同样有学者通过联合使用内毒素及泼尼松对小鼠造模^[25]，结果发现脂多糖导致小鼠的体质量明显下降的同时其脾脏的质量却明显上升，并且坏死股骨头中肿瘤坏死因子α明显增加，说明了脂多糖在股骨头坏死造模中所起到的作用与肿瘤坏死因子α有着密切的联系。

鸸鹋不同于犬、兔，是一种双足行走动物，髋部生物力学与人类相近，是世界上第二大的鸟类，体高150-185 cm，体质量30-45 kg，因而鸸鹋很可能成为理想的股骨头坏死模型。Zheng等^[26]对鸸鹋序贯注射内毒素及甲强龙，同时给予奥美拉唑保护胃黏膜、阿莫西林预防系统性感染，2周后MRI提示股骨近端出现严重水肿，血液中中性粒细胞、总胆固醇、低密度脂蛋白显著增高，12周后有鸸鹋开始出现不对称跛行；24周后处死动物，Micro-CT显示软骨下骨小梁结构退化，组织学则显示在塌陷的股骨头区域，脂肪细胞大量沉积增生、软骨下骨板及软骨层变薄、成骨细胞及血管分布减少。该实验的研究人员认为，内毒素及甲强龙的序贯使用是建立激素性鸸鹋股骨头坏死模型安全、有效的方法，模拟了从软骨退化到股骨头塌陷的临床病理过程，可以作为预防激素性股骨头坏死的临床前期研究的动物模型。

2.2.3 激素联合其他方式建立股骨头坏死模型 Wang等^[27]间隔3周分别使用10 mL/kg和6 mL/kg的马血清静脉注射在兔模型中，2周后连续3 d进行甲基强的松龙的腹腔注射(45 mg/kg)，MRI结果显示有37.5%(15/40)股骨头坏死出现率并且有12.5%(5/40)的死亡率。同样有学者用马血清联合甲基强的松龙建造兔的股骨头坏死模型^[28]，用药后发现血液中总胆固醇及三酰甘油大量升高，导致了脂代谢紊乱，同时在股骨头坏死区11β-HSD蛋白高表达。Zhao等^[29]对40只成年日本白兔进行激素型股骨头坏死造模研究，发现对于注射甲强龙前给予2周高胆固醇饮食的成年白兔，发生股骨头坏死的概率并未增加，反而是显著降低，这与之前许多学者所提出的设想完全相反，胆固醇联合激素建造股骨头坏死模型的方式还有待进一步证实。

单纯使用激素造模，会造成坏死不仅仅局限于股骨头，并且造模剂量难以标准化，造模时间较长，动物有一定的死亡率等等问题都需要得到解决，李瑞琦等^[30]在兔的激素性股骨头坏死造模过程中，发现庆大霉素和兰索拉唑的联合使用可以提高动物的生存率。马血清或内毒素均能起到激活免疫反应的作用，联合糖皮质激素模拟了临床上激素性股骨头坏死的发生发展的过程，具有成功率高、造模时间短、操作简便等优点，但马血清及内毒素其本身对于股骨头坏死模型也会产生一定影响，均会使激素促成股骨头坏死的发病原因、病理生理过程、免疫学、细胞分子等等的一些监测指标发生改变。内毒素联合甲强龙已经成为激素型股骨头坏死造模的经典方式，但内毒素本身对造模的影响使得该造模方式多用于对于股骨头坏死治疗方式的研究，而很难用于发病机制的研究。

2.3 酒精性股骨头坏死的动物模型 嗜酒引起的股骨头坏死在国内很常见，因此建立良好的酒精性股骨头坏死动物模型十分重要。

Okazaki等^[31]利用Lieber-DeCarli酒精液体饲料(包含5%乙醇)饲养大鼠，发现饲养1周后便有部分大鼠出现了股骨头坏死(3/8)，而人类酒精性股骨头坏死则需要数月乃至多年的嗜酒史，造成上述区别的原因可能是人类股骨头坏死需要发展很长的时间才会到软骨塌陷的阶段并出现相应的症状^[32]。Ikemura等^[33]通过15%乙醇灌胃的方式对兔进行造模，分为低剂量组[15 mg/(kg•d)]和高剂量组[30 mg/(kg•d)]，同时监测骨髓脂肪细胞体积和血脂水平的变化情况，结果显示乙醇会导致兔的骨髓脂肪代谢发生紊乱，并且与乙醇浓度正相关。

Zhu等^[34]对羊进行乙醇局部注射，12周后股骨头外形出现塌陷，25周髋关节间隙变窄，但其造模时间过长，且股骨头坏死不典型。Feitosa等^[35]也通过同样的方式制备了羊的股骨头坏死模型。陈东等^[36]在X射线透视下从股骨大转子处钻孔扩髓，将无水乙醇注射至股骨头中心，2周后通过MRI证实所有股骨头均发生了坏死。有学者发明了一种新型的导航模具^[37]，能够精确地将无水乙醇注射到犬的股骨头上内侧关节面下方5 mm处，构建标准的关节下区域的股骨头坏死，并且通过对手术器械规格的控制，尽可能的减少乙醇的漏出，从而降低周围软组织的损伤，这种新颖的造模方式为广大学者提供一种新的思路及方向。

灌胃或者饲养乙醇尽管模仿了人类嗜酒的过程，但动物的股骨头坏死率不高且均为股骨头坏死早期表现，而局部注射乙醇诱发的股骨头坏死虽然有一定的成功率，但其发病过程是对股骨头的局部破坏，并不能解释临床上的病理生理过程。因此通过动物实验解释酒精性股骨头坏死仍存在一定难度。

2.4 物理方式建立的股骨头坏死模型 液氮冷冻股骨头坏死因其具有造模周期短、动物死亡率低的优点而成为较常采用的股骨头坏死制模方法^[38]。该方法会造成血管痉挛、血管内凝血、血管内皮细胞损伤、血管通透性增加，从而导致股骨头坏死。但液氮法仅仅只能造成股骨头坏死，对于其发病机制却是毫无帮助。

Velez等^[39]对15只成年羊首先进行血管结扎，然后运用4.5 mm的钻头在股骨头上建立一个通道，利用液氮手枪连接一枚2 mm的冷冻探针将液氮通过影像增强器在术中准确地打入股骨头的前上区，并冷冻9 min，继而使用50 ℃的盐水冲洗，如此反复进行3遍。术后6周通过MRI及组织学检测，15只股骨头均发生了典型的早期股骨头坏死的表现，而没有股骨头的塌陷或者关节间隙的变窄，并且未发生骨折或者感染等较严重的并发症。Jin等^[40]对12只成年比格犬建模，切断圆韧带使髋关节脱位后，用干纱布保护股骨头周围组织，然后通过一个特定的漏斗将100-150 mL液氮注入冷冻3 min，再用37 ℃盐水复暖，术后8周其股骨头出现了塌陷形成了蘑菇状。该实验中，尽管狗是四足动物，并且股骨头的损伤机制与人类也大不相同，但其建模周期较短，术后不会残余化学物质，对股骨头造成了瞬间的损伤却又能够被逐渐的修复，十分适合作为股骨头坏死的血管修复和血管生成的模型。国内也有学者采用类似的方法在兔上建模，取得了类似的结果^[41]。

Fan等^[42]发明了一种冷热交替装置(Alternating Freezing and Heating Insult)来建立物理性的鸸鹋股骨头坏死模型，将液氮的注入及射频加热交替进行：9 min的液氮之后进行5 min的射频加热，循环2次。术后6周有鸸鹋出现跛行，16周后全部出现(共20只)；该研究组通过MRI记录了由水肿到术后12周出现股骨头塌陷以及髋关节半脱位的变化过程，有的鸸鹋在术后8周还出现了类似人类股骨头坏死的“双线征”；Micro-CT和组织学技术也呈现了类似于人类股骨头坏死的病理过程。这种连续的全程记录的手段可以测试潜在的治疗方法。Goetz等^[43]同样通过24只鸸鹋进行了冷损伤过程中不同参数(温度、冷冻时间、解冻时间、循环次数等)影响股骨头坏死造模的研究，结果发现温度对于股骨头坏死面积的影响远远大于其他的参数。迄今为止，鸸鹋的股骨头坏死模型，是一种能够在股骨头坏死全程都能监测手术干预效果的理想模型，但其成本极高，来源有限，另外鸸鹋(又名澳洲鸵鸟)为禽类的天然局限性，使其应用受到了限制。

2.5 其他方式建立的股骨头坏死模型 除了上述较为常见的股骨头坏死动物模型以外，很多学者还发现自发性高血压大鼠经常可以出现骨坏死^[44]。Gao等^[45]通过在兔的髋关节周围注射血管内皮生长因子受体2抗体，显著地抑制了股骨头的血管密度，模拟了股骨头缺血性坏死的过程，通过组织学及影像学证实了这是一种简单、高效的股骨头坏死动物模型的构造方法，并且在一定程度上揭示了股骨头坏死的病变特征。Long等^[46]利用高强度的超声对狗的股骨骨髓造成急性热损伤而导致股骨头坏死，预测高强度超声是一种较好的无创构建股骨头坏死模型的新方式。另外有学者通过大气压的改变、微波加热等方式同样成功建造了股骨头坏死模型^[47-48]，但相关报道较少，需要进一步重复证实。

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