血管性痴呆模型大鼠接受沙棘总黄酮后血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明沙棘所含沙棘总黄酮对免疫系统的多环节都具有不同程度的调节能力，但有关沙棘总黄酮对血管性痴呆炎症因子影响的研究还鲜有报道。
目的：观察沙棘总黄酮对血管性痴呆模型大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平的影响，探讨其对血管性痴呆的干预机制。
方法：取Wistar大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、对照组、沙棘总黄酮高剂量组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮低剂量组，后5组采用改进的“血管阻断法”建立血管性痴呆模型，假手术组仅切开分离双侧颈总动脉而不结扎。造模后1 d，对照组灌胃给予银杏提取物48 mg/(kg•d)，沙棘总黄酮高、中、低剂量组分别灌胃给予沙棘总黄酮200，100，50 mg/(kg•d)，模型组与假手术组灌胃给予等量生理盐水，连续灌胃30 d后进行Morris水迷宫行为学测试，并检测血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平。
结果与结论：与假手术组比较，模型组大鼠学习记忆能力下降，血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平增加(P < 0.05)；经银杏叶提取物、沙棘总黄酮干预后，大鼠学习记忆能力得到改善，血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平下降(P < 0.05)。表明沙棘总黄酮能减少血管性痴呆模型大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平，这可能是其干预血管性痴呆的主要作用机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 沙棘总黄酮, 血管性痴呆, 修复重建, 移植, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素1β

Abstract:

BACKGROUND: Total flavonoids of hippophae have different degrees of regulation effect on the immune system. However, there is no available evidence addressing the effect of total flavonoids of hippophae on vascular dementia inflammatory factor.
OBJECTIVE: To observe the effect of total flavonoids of hippophae on serum tumor necrosis factor-α and interleukin-1β levels in a rat model of vascular dementia, and to discuss its interventional mechanism for vascular dementia.
METHODS: A total of 72 Wistar rats were randomly divided into six groups: sham operation, model, control, high-dose, medium-dose, and low-dose of total flavonoids of hippophae groups. Except for the sham operation group, rats in the other five groups were applied to establish vascular dementia models using the improved “vascular occlusion” method. Sham operation group was only subjected to the isolation of bilateral common carotid artery, without ligation. At 1 day after modeling, rats in control group was intragastrically given Ginkgo biloba extracts 48 mg/kg•d, while rats in total flavonoids of hippophae groups were given 200, 100, 50 mg/kg•d of total flavonoids of hippophae. Model group and sham operation group received equal volume of saline. After 30 days of administration, rats were detected in Morris water maze. Serum tumor necrosis factor-α and interleukin-1β levels of rats in different groups were detected after intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with sham operation group, the vascular dementia model rats had a disordered learning and memory ability, and increased levels of serum tumor necrosis factor-α and interleukin-1β (P < 0.05). After intervention of Ginkgo biloba extracts and total flavonoids of hippophae, the learning and memory abilities were improved, and serum tumor necrosis factor-α and interleukin-1β levels were decreased (P < 0.05). Total flavonoids of hippophae can reduce serum tumor necrosis factor-α and interleukin-1β levels in vascular dementia rats. This may be the main mechanism of treating vascular dementia.

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Key words: hippophae, flavones, dementia, vascular

中图分类号:

R318

乔晓鸣，任世存. 血管性痴呆模型大鼠接受沙棘总黄酮后血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5819-5824.

Qiao Xiao-ming, Ren Shi-cun. Expression of serum tumor necrosis factor-аlpha and interleukin-1beta in a vascular dementia rat model undergoing total flavonoids of hippophae[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5819-5824.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 造模过程中对照组和沙棘总黄酮中剂量组各死亡1只，沙棘总黄酮高剂量组死亡2只，其余各组无死亡，最终进入结果分析的大鼠为68只。

2.2 血管性痴呆模型动物行为学检查结果 血管阻断后实验动物出现体温降低，短暂惊厥，呼吸缓慢，翻正反射消失。动物苏醒后眼睑下垂，眼裂缩窄，活动减少，共济失调。

2.3 血管性痴呆模型动物脑组织切片病理学观察 选取模型组手术前后大鼠脑海马组织进行观察，造模后3周显示出部分神经细胞大小不一，细胞皱缩、变形，胞浆嗜酸性增强，核染色质致密浓缩、边集，核固缩，神经元周围存在空白区，有散在凋亡的神经细胞，毛细血管周围存在空白区(图1)。

2.4 沙棘总黄酮对血管性痴呆模型大鼠Morris水迷宫学习记忆的影响

沙棘总黄酮对血管性痴呆模型大鼠逃避潜伏期的影响：在1-4 d各组大鼠平均逃避潜伏期均逐渐缩短，模型组、对照组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮低剂量组、沙棘总黄酮高剂量组大鼠平均逃避潜伏期较假手术组明显延长 (P < 0.05)；对照组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮低剂量组、沙棘总黄酮高剂量组大鼠平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P < 0.05)；沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮低剂量组大鼠平均逃避潜伏期较对照组延长(P < 0.05)，见表1。

沙棘总黄酮对血管性痴呆模型大鼠空间探索实验的影响：假手术组、模型组、对照组、沙棘总黄酮低剂量组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮高剂量组大鼠穿越原始平台位置次数分别为(9.79±1.28)，(3.46±1.89)，(6.28±1.42)，(3.79±1.22)，(5.43±1.45)，(6.45±1.68)次/min。

其余5组大鼠穿越原始平台位置次数较假手术组少 (P < 0.05)；对照组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮高剂量组大鼠穿越原始平台位置次数较模型组多(P < 0.05)，提示模型组穿越原始平台位置次数减少有明显的定位记忆障碍。沙棘总黄酮低剂量组、沙棘总黄酮中剂量组大鼠穿越原始平台位置次数较对照组少(P < 0.05)。

2.5 沙棘总黄酮对血管性痴呆模型大鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平的影响 模型组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β含量明显高于假手术组(P < 0.05)，经银杏叶提取物和沙棘总黄酮干预后，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β含量降低(P < 0.05)；对照组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β含量与沙棘总黄酮中、高剂量组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；对照组、沙棘总黄酮中剂量组、沙棘总黄酮高剂量组白细胞介素1β含量与沙棘总黄酮低剂量组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；沙棘总黄酮3组之间肿瘤坏死因子α含量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，沙棘总黄酮中、高剂量组白细胞介素1β含量与沙棘总黄酮低剂量组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

血管性痴呆是由于脑血管疾病和脑血管的病理改变，引起缺血、缺血缺氧性或出血性脑组织病变导致的认知功能障碍^[1-2]，已成为继阿尔茨海默病后第二种常见的痴呆类型^[3-5]。血管性痴呆严重影响患者的生活质量，临床上以认知、记忆、语言运用和视空间技能损害为主，给社会和家庭带来沉重的负担^[6-7]，中国≥55岁人群血管性痴呆患病率为0.8%，≥60岁人群血管性痴呆患病率为0.9%，血管性痴呆占痴呆的构成比为30.6%^[8]。

缺血性血管性痴呆是血管性痴呆原因中的最主要形式^[9]，血管性痴呆的发病机制尚不明确，但发病机制中的主要问题是脑血管损害脑组织与认知功能障碍之间的相互联系^[10-11]。

基于此，本实验采用“血管阻断模型法(2-VO)”复制血管性痴呆大鼠模型，观察大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平变化，探讨炎症因子与血管性痴呆发病的相关性，并采用沙棘总黄酮干预治疗，观察沙棘总黄酮对血管性痴呆大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平及认知功能的影响。

大鼠目前是制备血管性痴呆模型最适宜的动物^[12]。对于大鼠血管性痴呆模型的制作，通常采用两血管阻断法，即将大鼠双侧颈总动脉永久结扎，造成一种慢性脑低灌注状态，这种慢性低灌注是引起血管性痴呆可靠的大鼠模型^[13]，已被广泛应用于血管性痴呆研究中，其所致的病理改变主要是慢性全脑缺血，海马对于缺血非常敏感，损伤后可引起记忆学习功能等下降。传统两血管阻断法也能够较好地复制血管性痴呆动物模型，但术后由于应激性脑缺血动物死亡率较高，因此应对传统两血管阻断法模型进行改进。

改进的“血管阻断模型(2-VO)”可有效降低大鼠死亡率，并且与传统法造模组的大鼠海马区神经元有相似程度的明显变性、坏死和凋亡^[14]。血管性痴呆在中医学中属于“呆病”“善忘”“文痴”“颠疾”等范畴，历代医家对该病都有描述。近年来，单味中药有效成分对血管性痴呆治疗的研究与应用进一步深入，文献报道使用银杏叶提取物可改变血管性痴呆患者认知测验得分^[15-16]。

沙棘是胡颓子科沙棘属多种植物的干燥成熟果实，是一种富含生物活性的天然植物，被誉为“天然维生素”和“天然食品库”，1977年列入中国药典，卫生部将其列为药食同源新资源。沙棘所含沙棘总黄酮在保护心血管系统，清除体内自由基，延缓衰老，增强免疫和抗肿瘤等方面发挥重要作用^[17-20]。

涉及血管性痴呆发病机制的因素很多，炎症机制作为其发病机制之一越来越受到重视^[21]，但有关沙棘总黄酮对血管性痴呆炎症因子影响的研究还鲜有报道。实验就血管性痴呆模型大鼠接受沙棘总黄酮后血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平的表达进行阐述。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009年6至12月在青海大学医学院动物实验中心完成。

材料：①实验动物：16-18周龄普通级Wistar大鼠74只，体质量(350±20) g，雌雄各半，由兰州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(甘)200090007。②药品、试剂和仪器：沙棘总黄酮(青海康普生物科技股份有限公司，批号：20090220)；银杏提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaves，EGb德国威玛舒培博士药厂，证号H20090296)；大鼠白细胞介素1β ELISA Kit(产品编号：EKO393规格96T，武汉博士得生物工程有限公司)；大鼠肿瘤坏死因子α ELISA Kit(ELISA试剂盒，Invitrogen，USA)；Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

实验方法：

动物分组：将74只Wistar大鼠按照随机数字表随机分为6组，即假手术组(n=12)、模型组(n=14)、对照组(n=12)、沙棘总黄酮高剂量组(n=12)、沙棘总黄酮中剂量组(n=12)、沙棘总黄酮低剂量组(n=12)。除假手术组外，其余各组均制作血管性痴呆模型，并于造模后1 d开始灌胃给药，参考人与实验动物的体表面积折算法，沙棘总黄酮高、中、低剂量组分别给予200，100，50 mg/(kg•d) 灌胃，对照组给予银杏提取物48 mg/(kg•d) 灌胃，模型组和假手术组给予等量的生理盐水灌胃，1次/d，连续30 d。

血管性痴呆模型制作：根据预实验中的数据和大鼠死亡率，采用改进的血管阻断法进行造模^[22-23]。大鼠术前12 h禁食，4 h 禁水，用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，保证其手术期间有自主呼吸，将其仰卧固定于手术台上，颈部去毛，碘伏常规消毒，颈正中切口，钝性分离颈部肌肉组织，分离出一侧颈总动脉，避免损伤颈部交感神经和迷走神经，用1号手术线分别从近端和远端双重结扎颈总动脉，以确保阻断颈总动脉血流。该侧结扎后间隔1周，行第2次手术结扎另一侧颈总动脉。术后所有大鼠都肌注青霉素针，20×10⁴U/d，连续3 d，防止感染，并把大鼠放置条件适宜动物房饲养，假手术组切开分离双侧颈总动脉而不结扎。造模过程中死亡的大鼠均剔除。

光镜苏木精-伊红染色：选取2只模型组动物术前及造模后3周大鼠脑海马组织进行观察。

大鼠行为学测试：30 d后进行水迷宫实验。Morris水迷宫直径130 cm，深50 cm，水深30 cm，水温(26±2) ℃，人为在池壁上取4个等距离点，分水池为4个象限，任选一象限在其中央放置平台。①定位航行实验：将大鼠面向池壁并随机从不同的象限中点放入水中，开始计时实验大鼠从入水至爬上平台所需要的时间(s)，即逃避潜伏期，以120 s为限，超过120 s仍然没有找到平台的实验大鼠，记录为120 s，测试1次后休息1 min，再重复上面的实验，实验连续4 d。逃避潜伏期最后取均值。②空间探索实验：在逃避潜伏期实验结束后第2天进行空间探索实验，方法如下：撤除平台，将大鼠放入水池中，记录大鼠在60 s内穿越平台所在区域的次数。

检测血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平：Morris水迷宫结束后实验大鼠腹主动脉取血，停置30 min离心，取上清放置-20 ℃冰箱内冻存待测。严格按试剂盒说明用ELISA法分别测得肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平。

肿瘤坏死因子α的测定：①准备：从4 ℃冰箱拿出试剂盒，室温下平衡1 h。从-20 ℃冰箱拿出血清样本，置于4 ℃解冻。准备好0.01 mol/L PBS与已消毒纯水。配制洗涤液：从试剂盒中拿出洗涤用试剂，以1∶20体积比加入消毒纯水。②加样：按照100 μL/孔依次加入标准品(质量浓度分别为0，50，100，250，500，1 000 ng/L，每个质量浓度做4个重复对照)、待测血清(每组设8个重复对照)、空白对照孔(不加血清样品，加0.01 mol/L PBS，4个重复对照)。③酶标：加入50 μL酶标抗体(enzyme conjugate reagent, goat anti-rat TNF-α)，轻轻晃动15 s，37 ℃孵育1 h。④洗涤：吸走上清液，300 μL/孔依次加入洗涤液，静置30 s，吸弃洗涤液，滤纸上扣板清除洗涤余液，重复洗涤5次。⑤显色：每孔加底物溶液100 μL显色(A与B以1∶1混合)，轻轻晃匀5 s，37 ℃孵育15 min。⑥终止：每孔加终止液50 μL，轻轻晃动30 s，直至蓝色全部变为黄色。⑦结果判定：以空白孔校零，30 min内酶标仪450 nm处测定A值。

白细胞介素1β的测定：肿瘤坏死因子α检测第3步酶标时加入50 μL酶标抗体(enzyme conjugate reagent, goat anti-rat IL-1β)，其余步骤同于肿瘤坏死因子α的测定。

主要观察指标：①观察大鼠平均逃避潜伏期。②记录大鼠空间探索实验中穿越平台次数。③血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，结果以x(_)±s表达，1-4 d数据采用重复测量方差分析，第5天的数据采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

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讨论

脑缺血诱发行为学障碍是目前研究血管性痴呆最常用也是经典的动物模型^[24]。脑血流灌注不足不仅与血管性痴呆的发生有关^[25-28]，而且其程度也被作为预测血管性痴呆发生轻度认知障碍时病情进展的指标^[29-30]。慢性脑血流灌注不足可引起认知和记忆障碍等临床表现^[31]。

目前研究血管性痴呆的实验动物多采用大鼠。大鼠为哺乳类动物，其神经系统(尤其是大脑) 和感觉器官都高度发达，能准确感知条件的变化并迅速作出反应，且大鼠脑血管分布与人类酷似，其繁殖快，数量大，易饲养，作为实验材料来源容易，因此在研究中被广泛使用。文献报道大鼠是建立脑缺血模型最适宜的动物^[32-33]。

本实验采用改进的血管阻断方法制作血管性痴呆模型，造模方法可导致进行性和长期性的学习、记忆功能障碍^[12^，^34-35]。通过术后大鼠苏醒后出现眼睑下垂，眼裂变小，以及Morris水迷宫实验证明模型组大鼠的空间分辨能力下降，学习、记忆功能明显受损，说明血管阻断法制备的血管性痴呆模型成功^[36]。

Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力，血管性痴呆大鼠空间作业的认知能力下降，出现明显的学习记忆障碍，表现为分辨的准确性降低。而水迷宫实验可用于检测空间学习记忆行为，包括定位航行实验和空间探索实验，前者反映的是一种空间长期记忆能力，后者反映大鼠的学习进度。

在定向航行逃避潜伏期实验中，在1-4 d各组大鼠平均逃避潜伏期均逐渐缩短，各组大鼠定向航行逃避潜伏期均高于假手术组，对照组、各实验组大鼠定向航行逃避潜伏期低于模型组，模型组大鼠潜伏期明显延长，表明实验造模成功。事实上，观察发现术后3周模型大鼠已出现显著的学习记忆能力损害，表明模型大鼠空间学习记忆能力较差。经过对照组和实验组药物干预，银杏叶提取物和沙棘总黄酮各剂量组均能明显缩短潜伏期，改善实验大鼠的定位航行能力，即空间长期记忆能力。沙棘总黄酮高剂量组与对照组相比没有显著差异，但都优于沙棘总黄酮低、中剂量组。

在空间探索实验中，各组穿台次数均低于假手术组；对照组、沙棘总黄酮中、高剂量组穿台次数均高于模型组，说明模型组有明显的定位记忆障碍，对照组和沙棘总黄酮中、高剂量组能改善模型大鼠的空间记忆力，3组间比较无明显差别，但3组的穿越平台次数记忆成绩仍低于假手术组。沙棘总黄酮低剂量对模型大鼠的空间记忆力改善作用不明显，表现为该组大鼠穿越原始平台位置次数与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，这也说明沙棘总黄酮改善模型大鼠空间记忆的作用呈一定的剂量依赖性，与剂量呈正相关。

本实验采用血管阻断法对大鼠造成一种慢性脑低灌注状态，从而对脑组织中海马等易损区域造成缺血缺氧性损害^[31^，^37]，表现为部分神经细胞大小不一，细胞皱缩、变形，胞浆嗜酸性增强，核固缩，神经元周围存在空白区，有散在凋亡的神经细胞，毛细血管周围存在空白区。文献报道大鼠血管阻断后2.5 h海马区的脑血流量下降为正常的51.2%^[38]，1 d后大鼠海马区的脑血流量下降最明显^[39]，此后海马脑血流量逐渐恢复但仍无法达到正常水平^[40]。脑血流低灌注3周内会出现出现以急性缺血为主的神经元损伤^[41]，表现为坏死^[31]，这与本实验在术后3周模型大鼠已出现显著的学习记忆能力损害相一致，到后期，神经元改变以凋亡为主^[31]。

脑缺血损伤炎症反应中早期出现的细胞因子是肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β。各组血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β表达水平与相应大鼠学习记忆能力相关，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平越高，其对应的大鼠学习记忆能力越差，说明肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和血管性痴呆密切相关。

免疫炎性反应作为血管性痴呆发病机制之一越来越受到众多学者的重视。脑缺血或再灌注时，内皮细胞、神经元等被激活，释放炎性因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β引发炎症反应，与炎性代谢产物促使白细胞迁移至损伤部位，导致血管再闭塞，引起神经元损伤，神经元损伤后直接危害中枢神经系统，进而使机体的学习、记忆功能减退或者间接引发脑血管疾病致血管性痴呆的发生。

肿瘤坏死因子α是一种前炎因子，是炎症级联的启动者，可引发继发性损伤且具有神经毒样作用^[42]，其来源是多途径的。白细胞介素1β作为炎症调节因子可诱发白细胞在微血管中的黏附、聚集。肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β不仅能诱发炎症反应，还能刺激其他细胞因子的释放，造成神经元等组织器官损伤^[43]，使机体的学习、记忆功能减退，导致血管性痴呆，这也是模型大鼠出现行为学改变的重要原因。缺血缺氧还可导致细胞内钙超载^[44]，直接损伤神经细胞并最终启动细胞凋亡。沙棘总黄酮具有抑制缺氧损伤、抑制钙超载作用^[45]。本实验表明沙棘总黄酮能够有效抑制血管性痴呆模型大鼠血清炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达(P < 0.05)，使大鼠学习记忆能力好转(P < 0.05)。虽然血管性痴呆是一个复杂的病理过程，但通过近年来的研究提示，免疫炎性反应是血管性痴呆的主要病理特征之一，肿瘤坏死因子α又与免疫炎性反应密切相关，因此，肿瘤坏死因子α对于血管性痴呆具有特异性。抑制炎症是治疗血管性痴呆的主要策略^[46]，降低血浆中肿瘤坏死因子α浓度起到防止血管、心肌重构的作用^[47]。沙棘总黄酮各组能降低血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平，提示沙棘总黄酮有抵抗体内炎症反应的作用，是其抗血管性痴呆的机制之一，沙棘总黄酮对血管性痴呆的防治是以上机制中多靶点作用的结果。

在慢性脑血流灌注不足早期海马的神经元损伤是可逆的，这可能与血管阻断术后大脑侧支循环的建立和海马脑血流供应的恢复有关^[48]。目前，没有已知的化合物被批准用于预防和治疗血管性痴呆^[49]。血管性痴呆存在很大的异质性，加上早期脑血管病引起的一系列级联反应造成的神经损伤，使血管性痴呆的发展变得更为复杂，因此，血管性痴呆的治疗应该是多靶点的^[7]。沙棘总黄酮作为一种潜在的脑保护剂，仍需进行多中心、大样本、随机对照的前瞻性研究。