脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5132-5139.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.009

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脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用及机制

王黎明¹，王立华²，李铭¹，王倩云¹，杨洁¹，刘广洋²，丛秀丽²，刘拥军²

1解放军323医院生物诊疗中心，陕西省西安市 710054；2和泽干细胞转化再生医学研究中心，天津市 300381

收稿日期:2014-07-08 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 刘拥军，博士，教授，和泽干细胞转化再生医学研究中心，天津市 300381
作者简介:王黎明，女，1954年生，山东省淄博市人，汉族，硕士，主任医师，主要从事血液病学、风湿免疫病、再生医学研究。
基金资助:
军区医药卫生计划课题(CLZ12GA23)

Effects and mechanisms of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the thymus development in nude mice

Wang Li-ming¹, Wang Li-hua², Li Ming¹, Wang Qian-yun¹, Yang Jie¹, Liu Guang-yang², Cong Xiu-li²,Liu Yong-jun²

1Cell Therapy Center, the 323 Hospital of Chinese PLA, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China; 2Alliancells Institute of Stem Cells and Translational Regenerative Medicine, Tianjin 300381, China

Received:2014-07-08 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Liu Yong-jun, M.D., Professor, Alliancells Institute of Stem Cells and Translational Regenerative Medicine, Tianjin 300381, China
About author:Wang Li-ming, Master, Chief physician, Cell Therapy Center, the 323 Hospital of Chinese PLA, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Military Medicine and Health Project, No. CLZ12GA23

摘要/Abstract

摘要：

背景：自身免疫性疾病的传统治疗方法很难有效解决患者免疫耐受机制缺失的问题。间充质干细胞具有再生修复实质组织器官和免疫调节的生物学特性。
目的：探讨人脐带源间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的影响及作用机制。
方法：采用腹腔注射的方式向Foxn1-/-的BABL/c裸鼠体内注射人脐带源间充质干细胞，2×106/只，分析治疗后裸鼠胸腺残基的组织结构变化、胸腺上皮细胞的分布及成熟度，以及发育后的胸腺成熟淋巴细胞输出功能，并探讨人脐带源间充质干细胞发挥治疗作用的机制。
结果与结论：胸腺残基出现了清晰的皮髓质结构，胸腺上皮细胞数量增加并且胸腺输出功能增强，外周血中调节性T细胞增多。其作用机制可能是由于人脐带源间充质干细胞能够定植在胸腺组织内并且表达多种促进胸腺发育的细胞因子，尤其是对胸腺发育非常重要的角质形成细胞生长因子。结果表明人脐带源间充质干细胞能够为裸鼠胸腺的结构发育和功能成熟提供合适的微环境，促进裸鼠胸腺残基的发育和功能成熟，为间充质干细胞治疗免疫性疾病的作用机制提出了新的理论观点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 胸腺发育, 脐带间充质干细胞, 调节性T细胞, 角质形成细胞生长因子

Abstract:

BACKGROUND: For autoimmune diseases, it is difficult to effectively solve the lack of immunological tolerance in patients by traditional treatments. Mesenchymal stem cells have the biological functions of tissue and organ regeneration and immune regulation.
OBJECTIVE: To explore the effects and mechanisms of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the development of thymus in nude mice.
METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were intraperitoneally injected into BABL/c nude mice at a dose of 2×106 per mouse. We analyzed the maturation and distribution of thymic epithelial cells in the thymus rudiment of nude mice and the thymopoiesis of this newly developed thymus rudiment; furthermore, we explored the therapeutic effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Our data showed well-organized cortex-medulla structure and an obvious improvement in the maturation of thymic epithelial cells in the rudiment. We further demonstrated the improved thymopoiesis and the enhanced export of mature T cells with the T regulatory cells increase in peripheral blood.
Furthermore, we found that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells could be engrafted in the thymus and express many cytokines, especially keratinocyte growth factor which is essential for the thymus development. These findings indicate that a new mechanism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can provide a proper microenvironment for the reconstitution and functional maturation of thymus in nude mice, and elicit another insight in terms of therapeutic efficacy of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in many autoimmune diseases.

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Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cells, thymus gland, T-lymphocytes, regulatory, fibroblast growth factor 7

中图分类号:

R394.2

王黎明，王立华，李铭，王倩云，杨洁，刘广洋，丛秀丽，刘拥军. 脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5132-5139.

Wang Li-ming, Wang Li-hua, Li Ming, Wang Qian-yun, Yang Jie, Liu Guang-yang, Cong Xiu-li,Liu Yong-jun. Effects and mechanisms of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the thymus development in nude mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5132-5139.

图/表（结果） 2

2.1 人脐带源间充质干细胞表型鉴定流式细胞仪检测结果显示，分离培养的间充质干细胞达到国际细胞治疗协会(ISCT)的鉴定标准^[23](图1)。

2.2 人脐带源间充质干细胞能够促进裸鼠胸腺残基体积增大 Foxn1基因变异导致胸腺发育异常，但在裸鼠体内的胸腺部位，仍然存在着胸腺样器官，它由紧密的淋巴样组织组成，周围是一层薄薄的纤维囊和囊下界限不清的成熟的脂肪组织。

为了确定人脐带源间充质干细胞是否能够促进胸腺发育，实验从大小和组织学两个方面来分析不同治疗时间点的治疗组和未治疗组小鼠胸腺的差别。从外观和质量来看，治疗组和未治疗组无显著性差异。但苏木精-伊红染色显示，治疗组小鼠比未治疗组小鼠的正常胸腺组织学结构区域显著性增大。而且，治疗组较未治疗组小鼠的胸腺组织出现了明显的皮髓质交界结构(图2)。

这些数据表明，用人脐带源间充质干细胞治疗6周开始就可见胸腺结构的重塑，并且随着持续反复的治疗，胸腺结构不断向正常胸腺改善。

2.3 人脐带源间充质干细胞治疗促进裸鼠胸腺皮质和髓质结构重建以及胸腺上皮细胞的分化裸鼠的胸腺体积较小，且结构异常，没有明显的皮髓质区域之分，其中的大多数胸腺上皮细胞分化只停留在祖细胞阶段^[24-29]。K8K5分别是成熟的皮质上皮细胞和髓质上皮细胞的标志，可用来评价胸腺上皮细胞的定位和组织特征。在正常胸腺中，髓质上皮细胞(medullary TECs，mTECs)组成K5⁺的髓质区域，周围被K8⁺的皮质所包绕。

本实验中，人脐带源间充质干细胞治疗后6，8，10周的胸腺组织抗角蛋白免疫荧光染色显示，未治疗组裸鼠胸腺上皮细胞散在分布；相反，治疗组胸腺出现清晰的皮质(K5^-K8⁺ TECs)和髓质(K5⁺K8^- TECs)区域。此外，在治疗组胸腺的皮质和髓质区域均出现了紧密的上皮细胞网状结构，皮髓质交界区的结构接近正常胸腺(图3)。这表明人脐带源间充质干细胞能够促进胸腺上皮细胞的分化和增殖，重建裸鼠的胸腺结构。

2.4 人脐带源间充质干细胞增加胸腺生成能力，促进胸腺T细胞的输出研究发现人脐带源间充质干细胞能够明显改善裸鼠胸腺结构的基础上，实验进一步探讨胸腺T细胞的能力是否提高。在正常的胸腺组织，大多数的胸腺细胞是CD4⁺CD8⁺双阳的，而在裸鼠，由于胸腺上皮细胞和胸腺祖细胞缺乏相互作用，CD4⁺CD8⁺T细胞数量极少。应用人脐带源间充质干细胞后，CD4⁺CD8⁺胸腺细胞显著增加，并在髓质区域可见少量成熟的单阳性细胞(图4)。

2.5 人脐带源间充质干细胞增加裸鼠外周血中调节性T细胞数量 Tregs主要产生于胸腺，在成年健康小鼠外周血中，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs占CD4⁺T细胞的5%-10%^[30]，通过抑制CD4⁺效应性T细胞的功能，在自身免疫耐受和免疫平衡中发挥着核心作用^[31]。已有大量数据表明，缺乏CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs与自身免疫性疾病的发生密切相关^[32]。本研究发现，治疗后外周血中Tregs占CD4⁺T细胞的百分比较未治疗组显著增加(从1.95%平均增加到3.89%，图5)。

2.6 人脐带源间充质干细胞表达细胞因子和生长因子研究表明，脐带源间充质干细胞能够在表面黏附分子的介导下^[1]，从血管中迁移到组织中^[33]。

作者用CM-Dil标记人脐带源间充质干细胞来观察腹腔注射后细胞在胸腺组织中的分布，结果表明，人脐带源间充质干细胞能够迁移并且定植到胸腺，主要存在于胸腺组织的边缘，在胸腺组织中心区域也有散在分布。

此外，用real-time PCR检测到人脐带源间充质干细胞能够高表达多种与胸腺发育相关的细胞因子和生长因子，其中包括角质形成细胞生长因子、Ghrelin、白细胞介素15(图6)。

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引言

自身免疫性疾病是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏，损伤自身的组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病，其发病的根本机制是免疫耐受性的终止和破坏。调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)在诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。

间质干细胞存在于胎儿和成人的多种组织中，能够分化为中胚层细胞和其他胚层细胞^[1]。间质干细胞可用于治疗多种疾病，例如移植物抗宿主病^[2]、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎^[3-4]，这些疾病的特点之一就是胸腺功能异常和免疫系统过激^[5-6]。间质干细胞可以通过其抗炎和免疫调节作用来治疗以上疾病^[7]。除此之外，在人脐带源间充质干细胞治疗类风湿性关节炎患者的临床试验中，作者发现，患者外周血中Tregs百分比升高，而Tregs主要产生于胸腺。

胸腺是T细胞发育的中心位置，在适应性免疫系统的发育中发挥着重要的作用，胸腺缺失导致机体免疫功能缺陷^[8]。胸腺上皮细胞的微环境可以支持胸腺细胞的发育^[9]，前者主要由上皮细胞和间质来源的细胞组成^[10]。胸腺上皮细胞发育受Foxn1基因调节^[11]，该基因缺失会诱导个体老化并减少naïve T细胞的产生^[12]。间质细胞可以促进胸腺上皮细胞功能发育并维持上皮结构与功能^[13]。研究表明，功能性胸腺组织的成功重组需要间质组织^[14]。由于Tregs主要产生于胸腺，为了探讨人脐带源间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的重要机制是否是通过调节类风湿性关节炎患者的胸腺功能来实现的，实验选择了胸腺发育异常的裸鼠作为动物模型。Foxn1基因调节胸腺上皮祖细胞的生长和分化，但是不能决定胸腺祖细胞^[11]，Foxn1基因的缺失导致胸腺上皮不能吸引胸腺祖细胞到达胸腺原基，并且使上皮细胞分化停留在祖细胞阶段^[15]。胸腺微环境分为皮质和髓质，决定着胸腺细胞的成熟。Foxn1基因的缺失导致上皮细胞的发育停滞在祖细胞阶段，造成胸腺发育异常。裸鼠是一种缺乏Foxn1基因的T细胞免疫缺陷鼠，但它的胸腺组织部位仍然有淋巴组织样的胸腺原基存在，其中有典型的胸腺淋巴细胞，周围包绕间质细胞和多群上皮细胞^[16]。

此项研究中，首次探讨人脐带源间充质干细胞对基因型免疫缺陷的裸鼠胸腺上皮细胞发育和功能成熟的作用，与其他来源的间充质干细胞相比，脐带源的间充质干细胞有更好的自我更新和多向分化的潜能，并且具有免疫调节的功能^[17]，因此作为此项研究的细胞来源。研究发现，治疗组裸鼠胸腺残基的结构发生重建，胸腺功能增加，表明人脐带源间充质干细胞能够重建和维持胸腺的功能，这对因胸腺发育障碍和功能退化所致疾病的诊治具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年7月至2012年10月在天津血液研究所实验室及和泽干细胞转化再生医学研究中心实验室完成。

材料：

实验动物：雄性3周龄Foxn1^-^/^-的BABL/c裸鼠72只，体质量12-15 g；正常同周龄雄性BABL/c小鼠20只，体质量12-15 g，均购买于军事医学科学院。

脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用实验试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
免疫荧光抗体、流式抗体、流式细胞仪	美国BD公司
免疫荧光显微镜	奥林巴斯公司
冰冻切片机	德国LEICA公司
酶标仪	北京奕瑞祥科技有限公司
PCR仪	瑞士Roche公司

实验方法：

人脐带源间充质干细胞的体外分离、纯化和培养：无菌条件下获得足月妊娠的人脐带，将脐带组织剪碎成 1 mm ×1 mm ×1 mm大小的组织块，按1∶1体积比加入胶原酶Ⅱ消化30 min；向胶原酶-组织块消化体系内加入胰酶，在37 ℃环境中继续消化30 min后，加入体积分数为10%的胎牛血清终止消化；之后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液；2 000 r/min离心 15 min，弃上清，收集细胞，接种于包被后的T75型细胞培养瓶中，加入含体积分数为20%胎牛血清、2 μg/L表皮生长因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、25 mmol/L左旋谷氨酰胺的DMEM/F12完全培养液置于37 ℃，体积分数为5% CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养。观察细胞贴壁生长至80%-90%融合时，以0.25%胰蛋白酶- 0.01%EDTA消化传代，取第4代细胞用于实验。

人脐带源间充质干细胞的免疫表型的检测：待细胞长到90%左右融合时，用含有EDTA的胰酶溶液消化，收集细胞，以2 000 r/min离心5 min，D-Hank’s缓冲液洗涤细胞1次，之后加入小鼠抗人单克隆流式荧光抗体以及同型对照4 μL，充分混匀，4 ℃避光孵育30 min，D-Hank’s缓冲液洗涤细胞1次，以2 000 r/min离心5 min，500 μL的流式细胞仪上样缓冲液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

实验动物分组：雄性3周龄Foxn1^-^/^-的BABL/c裸鼠72只，按照随机数字表随机分为人脐带源间充质干细胞治疗组36只和未治疗组36只。正常同周龄雄性BABL/c小鼠20只作为正常对照。治疗组小鼠腹腔注射人脐带源间充质干细胞注射液0.5 mL，含2×10⁶个细胞，每周2次；未治疗组小鼠腹腔注射人脐带源间充质干细胞注射液的溶剂，0.5 mL/只，每周2次。分别于细胞治疗后6，8，10周3个时间点取材(每个时间点12只)。摘除眼球法取血，颈部脱臼法处死小鼠，解剖，剥离胸腺、脾脏、淋巴结进行检测。

组织病理及免疫荧光染色：新鲜胸腺取出后，用Tissue-Tek OCT胶包埋，置于冰冻切片机(Leica)中，切成厚度为4 μm的冰冻切片。空气中干燥15 min后，用预冷的丙酮固定10 min，通过苏木精-伊红染色进行病理分析。冰冻切片经丙酮固定后，1×PBS洗3遍，每遍5 min，5%牛血清白蛋白封闭非特异结合，之后加入一抗：抗小鼠角蛋白5抗体(Covance Research Products，Berkeley，CA)，抗小鼠角蛋白8抗体(Rolf kemler，Developmental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa，Iowa City，IA)，抗小鼠CD4抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)，抗小鼠CD8抗体(abcam, Cambridge Science Park, Cambridge，MA)；生物素偶联的UEA-1抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，4 ℃孵育过夜。之后用1×PBS洗3遍，每遍5 min，加入相应的二抗常温孵育 30 min。之后用1×PBS洗3遍，每遍5 min，加DAPI染细胞核，Olympus IX51显微镜观察。

流式细胞仪检测：每样检测指标需要1×10⁶的胸腺、脾脏、淋巴结和外周血细胞。用抗小鼠CD16/CD32 (eBioscience，San Diego，CA) 4 ℃封闭15 min后，加入下面的抗体：PE标记的抗小鼠CD4 (BD)，FITC标记的抗小鼠CD8a (BD)，FITC标记的抗小鼠CD4 (BD)，APC标记的抗小鼠CD25 (BD)，PE标记的抗小鼠Foxp3 (eBioscience)，进行流式细胞仪检测。

基因检测：QIGEN DNA提取试剂盒提取脾脏组织DNA，Nano drop 200检测DNA浓度。检测脾脏中TREC circle的相对定量，引物由Invitrogen公司合成和PAGE纯化，引物序列如下^[18]：mRec primer：5’-GGG CAC ACA GCA GCT GTG-3’，Jα primer：5’-GCA GGT TTT TGT AAA GGT GCT CA-3’；mRec-Jα fluorescent probe：5’-FAM-CAC AAG CAC CTG CAC CCT GTG CA- TAMRA-3’；Rapsn 上游引物：5’-ACC CAC CCA TCC TGC AAA T-3’，下游引物：5’-ACC TGT CCG TGC TGC AGA A-3’，探针引物： 5’-FAM-AAC CTC ATC ACT GGC ACC GAG AAC C-TAMRA-3’。反应体系：5× Taqman PCR Master Mix 4 µL，脾脏DNA 1 500 ng，上游引物0.5 µL，下游引物0.5 µL，探针引物1 µL，用水加至总体积20 µL，反应条件95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 1 s，40个循环；4 ℃ 30 s。

按PureLink^TM Micro-to-Midi Total RNA纯化系统说明书提取人脐带源间充质干细胞总RNA，用Oligo dT和dNTP反转录成cDNA后，用普通PCR检测间充质干细胞表达如下因子的水平，引物用Primer 5.0设计，由Invitrogen公司合成和PAGE纯化，具体引物序列为：角质形成细胞生长因子^[19]上游引物：5’-AAG AAC TGC CCT TCC TCA-3’，下游引物：5’-AAG TCC TCC TCT GCC CTC-3’；Ghrelin^[20]上游引物：5’-CCA TGC CCT CCC CAG GGA CC-3’，下游引物： 5’-ATC ACT TGT CGG CTG GGG CCT C-3’；白细胞介素15^[21]上游引物：5’- ATG GGT TCT TGG TCT CAC-3’，下游引物：5’-ACT CAA AGC CAC GGT AAA-3’；白细胞介素7^[22]上游引物：5’-CCC CTT GGG ATG GAT GAA-3’，下游引物：5’- ATG ATG ACC GCA ACT GGA-3’；生长激素上游引物：5’-CCT ACC AGG AGT TTG AAG AA-3’，下游引物：5’-CAG GCT GTT GGC GAA GAC-3’；生长激素受体上游引物：5’-TAG TAT TTC CCA TTT ATC GC-3’，下游引物：5’-TGT TGT CAG GCT GTT GTG-3’。反应体系为： cDNA 2 µL，10 mmol/L dNTP 1 µL，Taq酶1.25 µL，10×buffer 5 µL，上游引物1 µL，下游引物1 µL，25 MgCl₂ 5 µL，H₂O 35 µL，总体积50 µL，反应条件为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，ChemiDoc XRS系统照相。

主要观察指标：①胸腺大体体积及质量。②胸腺的皮髓质结构重建情况。③胸腺的功能。④人脐带源间充质干细胞发挥作用的机制研究。

统计学分析：所得数据均经SPSS 17.0统计分析软件处理。统计结果以x(_)±s表示。各组均数运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本研究表明，应用人脐带源间充质干细胞能够改善裸鼠胸腺残基结构，促进胸腺髓质上皮细胞的成熟，增加胸腺的生成能力，并且增加成熟T细胞向外周输出，人脐带源间充质干细胞可能通过分泌多种促胸腺发育的因子来改善胸腺的微环境。

Foxn1是胚胎期胸腺发育重要的调控者^[34]，对于胚胎期胸腺上皮细胞的初始分化尤其关键^[35]。Foxn1表达下降导致胸腺结构退化，特异性胸腺上皮细胞缺失和T细胞生成减少^[36]，因此，Foxn1的水平对于胸腺表型改变影响较大。正常胸腺老化时，由于Foxn1表达缺失导致成熟胸腺上皮细胞的发育受阻，胸腺细胞总数减少^[12]。本研究选用裸鼠作为动物模型来探讨人脐带源间充质干细胞的T细胞调节作用。尽管裸鼠缺乏Foxn1基因，但胸腺残基中仍然存在一些定向分化为胸腺上皮细胞系的祖细胞^[11]。本研究发现，人脐带源间充质干细胞治疗后，裸鼠原有胸腺残基增大，其皮质和髓质区域发现成熟的胸腺上皮细胞，并且出现了正常的皮髓交界结构和UEA-1⁺MHCII^hi的胸腺上皮细胞，这表明人脐带源间充质干细胞能够促进Foxn1^-^/^-胸腺残基中胸腺上皮祖细胞的功能成熟。

在胸腺细胞的发育过程中，胸腺基质细胞特异的细胞因子表达和相应的受体在胸腺细胞的表达参与了两个细胞群之间的相互作用^[37]。人脐带源间充质干细胞能够表达多种细胞因子和生长因子，例如干细胞生长因子、白细胞介素6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子^[38]、角质形成细胞生长因子、Ghrelin、白细胞介素15和生长激素。角质形成细胞生长因子也称做成纤维细胞生长因子7，可以调节上皮细胞，由于胸腺上皮细胞表达角质形成细胞生长因子的受体FGFR2IIIb^[19]，因此角质形成细胞生长因子也可以调节胸腺上皮细胞的增殖和分化。

研究发现，角质形成细胞生长因子可以改善胸腺上皮细胞的组织架构和功能，从而改善衰老所致的胸腺衰退，而外源性给予角质形成细胞生长因子能够防止胸腺衰老，增加幼年和老年鼠的T细胞生成能力^[39]。同时，间充质干细胞表达的干细胞生长因子、白细胞介素6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等能够促进胸腺细胞的生长和细胞间相互作用，Ghrelin能够增加胸腺的输出能力^[40]，白细胞介素15信号通路能够促进淋巴细胞的增殖^[21]，人脐带源间充质干细胞可能通过表达以上因子而发挥作用。

本实验结果显示，定植在胸腺中的人脐带源间充质干细胞能够原位表达角质形成细胞生长因子，从而改善胸腺功能。由于角质形成细胞生长因子只能作用于未成熟的胸腺上皮细胞祖细胞，因此人脐带源间充质干细胞对胸腺基质的作用只限于能够促进Foxn1^-^/^-胸腺残基的增大，然而，这些胸腺上皮细胞的增殖已足够支持胸腺的生成能力，因此在人脐带源间充质干细胞治疗裸鼠6周后检测到了CD4⁺CD8⁺双阳性细胞的增加和脾脏中Tregs含量增加，这与文献中报道的角质形成细胞生长因子治疗后6周，胸腺向脾脏输出的成熟T细胞增多和正常胸腺的内稳态重建是相一致的^[41]。

此外，还检测到人脐带源间充质干细胞治疗后的裸鼠外周血中Tregs百分比增加，这与胸腺的生成能力增加和T细胞输出增加相一致。人脐带源间充质干细胞已经被应用于治疗多种自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮^[3]和类风湿性关节炎^[4]，这些自身免疫性疾病的共同特点就是胸腺功能障碍导致外周血中Tregs数量降低或者Tregs功能受损^[5-6]。众所周知，Tregs主要由胸腺产生，是诱导自身免疫耐受和防止自身免疫发生的关键因素^[42-43]。在应用人脐带源间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的临床试验中发现，人脐带源间充质干细胞治疗可以显著性增加类风湿性关节炎患者外周血中Tregs水平。结合本论文两部分研究结果，首次提出人脐带源间充质干细胞可能是通过改善类风湿性关节炎患者胸腺功能来发挥治疗作用。

综上所述，人脐带源间充质干细胞能够改善胸腺微环境，改善胸腺功能，促进T细胞发育，可能成为多种自身免疫性疾病和衰老相关的胸腺退化以及胸腺损伤所致疾病的新的治疗手段。

脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的作用及机制

Effects and mechanisms of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the thymus development in nude mice

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