γ型干扰素增强脂肪干细胞介导的免疫抑制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5120-5125.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.007

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γ型干扰素增强脂肪干细胞介导的免疫抑制

依里牙尔•依里哈木¹，王云海¹，王理¹，许新才¹，艾木拉古丽•阿布拉²，张文斌¹

1新疆医科大学第一附属医院胃肠外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2新疆师范大学生命科学学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2014-07-09 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 张文斌，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院胃肠外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:依里牙尔?依里哈木，男，1984年生，新疆维吾尔自治区人，新疆医科大学在读硕士，医师，主要从事消化道肿瘤研究。
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院组织工程专项项目(201022GC02)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2014211C036)；国家临床重点专科-普通外科专业建设项目

Interferon-gamma enhances immunosuppression mediated by adipose-derived stem cells

Yiliyaer Yilihamu¹, Wang Yun-hai¹, Wang Li¹, Xu Xin-cai¹, Aimulaguli Abula², Zhang Wen-bin¹

1Department of Gastrointestinal Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2School of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-07-09 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Zhang Wen-bin, M.D., Associate chief physician, Department of Gastrointestinal Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yiliyaer Yilihamu, Studying for master’s degree, Physician, Department of Gastrointestinal Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Tissue Engineering Special Fund of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 201022GC02; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014211C036; the National Key Clinical Specialty: the Project of General Surgery

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞可以向成骨细胞和软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和神经细胞等分化。脂肪源性干细胞与间充质干细胞不但具有非常近似的生物学性质，而且在细胞表面标志谱的表达方面也十分接近。
目的：探索脂肪源性干细胞表面白细胞抗原Ⅱ类分子的表达以及其免疫原性和免疫调节作用，并探讨其具体机制是通过什么途径诱导的。
方法：分离培养脂肪源性干细胞，并用γ型干扰素刺激，然后用流式细胞术检测其表面免疫分子白细胞抗原Ⅱ的表达，实时荧光定量PCR和Western bolt分别检测吲哚胺-2，3-双加氧酶基因和蛋白的表达。脂肪源性干细胞单向刺激淋巴细胞，观察细胞增殖情况。淋巴细胞用植物血凝素刺激后，加入1×102-1×105脂肪源性干细胞，观察淋巴细胞增殖情况；同时，1×102-1×105脂肪源性干细胞作为“第三者”细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中，同样观察淋巴细胞增殖情况。
结果与结论：脂肪干细胞低表达白细胞抗原Ⅱ和吲哚胺-2，3-双加氧酶，但在γ型干扰素刺激后，白细胞抗原Ⅱ和吲哚胺-2，3-双加氧酶表达均明显上调。脂肪源性干细胞不能刺激淋巴细胞增殖，但能抑制植物血凝素或异体淋巴细胞导致的淋巴细胞增殖，且脂肪源性干细胞与混合淋巴细胞共培养的上清中检测到大量γ型干扰素的表达。提示脂肪干细胞具有低免疫原性，同时可在体外抑制淋巴细胞增殖反应，添加外源性γ型干扰素有助于脂肪源性干细胞发挥免疫抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 免疫抑制, 脂肪源性干细胞, 吲哚胺-2, 3-双加氧酶, 植物血凝素, 白细胞抗原Ⅱ, 淋巴细胞增殖, 混合淋巴细胞反应, γ型干扰素, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Adipose stem cells can differentiate into bone cells, cartilage cells, smooth muscle cells, myocardial cells and nerve cells. Adipose-derived stem cells and mesenchymal stem cells have very similar biological properties, and they are also very close in terms of cell surface marker expression profile.
OBJECTIVE: To investigate the expression of human leukocyte antigen II in adipose-derived stem cells and its immunogenicity and immunomodulatory effect, and to explore the specific mechanism.
METHODS: After isolation and culture, the adipose-derived stem cells were stimulated with interferon-γ, and the expression of human leukocyte antigen II was detected by flow cytometry, the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase was determined by real-time PCR and western blot. Adipose-derived stem cells were used to stimulate lymphocytes, and the cell proliferation was observed. The lymphocytes were stimulated with
phytohemagglutinin, and then 1×102-1×105 adipose-derived stem cells were added to inhibit the proliferation; meanwhile, adipose-derived stem cells, a third party, at a dose of 1×102-1×105 were added to the ongoing two-way mixed lymphocyte reaction, and the cell number was calculated as count per minute.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of human leukocyte antigen II and indoleamine 2,3-dioxygenase was low in adipose-derived stem cells, but up-regulated with stimulation of interferon-γ. Adipose-derived stem cells could not stimulate lymphocyte proliferation, but could inhibit lymphocyte proliferation induced by phytohemagglutinin or allogeneic lymphocytes, and interferon-γ was highly expressed in the supernatant of co-culture of adipose-derived stem cells and mixed lymphocytes. These results indicate that the adipose-derived stem cells have low immunogenicity and can inhibit cell proliferation of lymphocytes in vitro, and the addition of exogenous interferon-γ can enhance the immunosuppressive effects of adipose-derived stem cells.

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Key words: adipocytes, lymphocytes, immune tolerance, interferon-gamma, phytohemagglutinins

中图分类号:

R394.2

依里牙尔•依里哈木，王云海，王理，许新才，艾木拉古丽•阿布拉，张文斌. γ型干扰素增强脂肪干细胞介导的免疫抑制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5120-5125.

Yiliyaer Yilihamu, Wang Yun-hai, Wang Li, Xu Xin-cai, Aimulaguli Abula, Zhang Wen-bin. Interferon-gamma enhances immunosuppression mediated by adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5120-5125.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪源性干细胞表面白细胞抗原Ⅱ的表达流式细胞仪检测结果显示白细胞抗原Ⅱ在脂肪源性干细胞表面阳性表达较弱，但在γ型干扰素刺激48 h后，白细胞抗原Ⅱ类分子表达明显上调(图1)，说明脂肪干细胞免疫原性低，经γ型干扰素诱导后，白细胞抗原Ⅱ表达增强，免疫抑制能力可能增强。

2.2 经γ型干扰素诱导后脂肪源性干细胞中吲哚胺-2，3-双加氧酶表达研究表明人间充质干细胞的免疫抑制作用是通过吲哚胺-2，3-双加氧酶介导的^[4]，因此，为观察脂肪源性干细胞是否也通过吲哚胺-2，3-双加氧酶介导免疫抑制作用，将脂肪源性干细胞用γ型干扰素处理后，实时PCR及Western blot法分别检测其吲哚胺-2，3-双加氧酶基因和蛋白的表达。

实时PCR结果显示，脂肪源性干细胞低表达吲哚胺-2，3-双加氧酶基因，但在用γ型干扰素处理后，吲哚胺-2，3-双加氧酶基因表达明显上调，是未处理时的(2.86±0.32)倍(图2 A)。

Western blot结果显示脂肪源性干细胞低表达吲哚胺-2，3-双加氧酶蛋白，同时在γ型干扰素诱导后吲哚胺-2，3-双加氧酶蛋白表达增加(图2 B)。

2.3 脂肪源性干细胞单向刺激淋巴细胞增殖反应根据测量的CPM值，可见未经处理的脂肪源性干细胞并不能刺激淋巴细胞增殖(1 652±189) CPM；同样，当脂肪源性干细胞经γ型干扰素处理后，淋巴细胞也未见明显增殖(1 735±201) CPM，两者差异无显著性意义(P > 0.05)，说明无论脂肪源性干细胞是否高表达白细胞抗原Ⅱ，脂肪源性干细胞均不会刺激异体淋巴细胞增殖，间接证明脂肪源性干细胞具有低免疫原性。

但在对照组中，加入异体淋巴细胞，淋巴细胞有明显增殖(52 886±3 862)CPM，与经干扰素处理的细胞的差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 脂肪源性干细胞对非特异性淋巴细胞反应的作用当淋巴细胞用植物血凝素刺激后，会出现明显增殖，加入脂肪源性干细胞后，除1×10²组脂肪源性干细胞外，其余浓度的细胞均可以明显抑制淋巴细胞的增殖(P < 0.05)；但当脂肪干细胞用多聚甲醛固定失活后，所有浓度的抑制作用均消失(图3A)。

2.5 脂肪源性干细胞对混合淋巴细胞反应的作用为了观察脂肪源性干细胞能否抑制异体淋巴细胞刺激导致的淋巴细胞增殖，在双向混合淋巴细胞培养中加入脂肪源性干细胞，作为第三者细胞。

共培养7 d后可见，除1×10²组外，1×10³-1×10⁵数量级的脂肪源性干细胞均使淋巴细胞的增殖得到明显抑制。脂肪源性干细胞以多聚甲醛作用失活后，所有浓度的抑制作用均消失(图3B)。

流式细胞术检测到具有活性脂肪源性干细胞组的上清液中有大量γ型干扰素(21.354±1.78) μg/L，而失活脂肪源性干细胞组的上清液中γ型干扰素含量较少，几乎检测不到，证明脂肪源性干细胞在抑制淋巴细胞增殖过程中，会释放大量的γ型干扰素，从而促使吲哚胺-2，3-双加氧酶表达，发挥免疫抑制作用。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年2月在新疆医科大学第一附属医院完成。

材料：

γ型干扰素介导脂肪干细胞实验使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Ⅰ型胶原酶，胰蛋白酶	Sigma，美国
FITC标记的鼠抗人白细胞抗原Ⅱ抗体	Santa Cruz，美国
Trizol试剂盒	Takara公司
上样缓冲液，SDS-聚丙烯酰胺凝胶	Bio-rad公司，美国
流式细胞仪	Beckman Coulter，美国
300SL自动TDCR液闪计数仪	东乐自然基因生命科学公司

脂肪组织及外周血来源：选取于新疆医科大学第一附属医院整形外科行抽脂的女性健康志愿者5名，年龄20-30岁，取其脂肪组织及外周血。所有患者对治疗及试验方案知情同意并得到新疆医科大学第一附属医院伦理学委员会批准。

方法：

脂肪源性干细胞分离和培养：脂肪抽吸后取10 mL用PBS反复冲洗，然后剪碎，置于2倍体积的0.1%的Ⅰ型胶原酶中，37 ℃消化1 h，1 200×g离心10 min分离脂肪源性干细胞，之后弃去上层组织，将沉淀的细胞接种于培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM-L培养基，置于含体积分数5%CO₂，37 ℃孵箱中培养。待细胞融合至80%-90%时，细胞传代，本实验所用脂肪源性干细胞为第2代至第6代细胞。

流式细胞仪检测白细胞抗原表达：脂肪源性干细胞融合到90%时，添加50 μg/L γ型干扰素孵育48 h，然后γ型干扰素处理或未处理过的脂肪源性干细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，3×10⁶个细胞用流式缓冲液洗涤2遍，然后重悬，接着加入FITC标记的鼠抗人白细胞抗原Ⅱ抗体， 4 ℃避光孵育60 min，然后用流式缓冲液洗涤，重悬，细胞加入玻璃管中后上流式细胞仪检测。

实时PCR检测细胞中吲哚胺-2，3-双加氧酶基因的表达：脂肪源性干细胞中添加50 μg/L γ型干扰素孵育48 h，然后用胰酶消化收集细胞，PBS冲洗，Trizol法提取细胞总RNA，反转录为cDNA；采用未用γ型干扰素处理的细胞做对照。

吲哚胺-2，3-双加氧酶引物设计如下：正义链：5’-ATC CTA ATA AGC CCC TGA C-3’，反义链：5’-CCT TCA TAC ACC AGA CCG T-3’；内参基因β-actin引物如下：正义链：5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’，反义链：5’-CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C-3’。实时PCR反应体系为25 μL，反应条件为：95 ℃变性5 min，然后循环41次(95 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；70 ℃延伸30 s，82 ℃采集荧光信号，最后于70 ℃放置10 min。记录Ct值，吲哚胺-2，3-双加氧酶相对表达量用公式2^-^ΔΔCt计算。

Western blot检测细胞中吲哚胺-2，3-双加氧酶蛋白的表达：50 μg/L γ型干扰素处理过或未处理过的脂肪源性干细胞用蛋白裂解液提取总蛋白，接着采用上样缓冲液抽提蛋白样品，然后用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，蛋白电转到硝酸纤维素薄膜上，然后用封闭液封闭1 h，孵育鼠抗人吲哚胺-2，3-双加氧酶或β-actin的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗，最后超敏化学发光物进行检测。

脂肪源性干细胞刺激淋巴细胞反应：外周血密度梯度离心分离单个核细胞，细胞培养于RPMI 1640培养基中， 1×10⁵接种于96孔板中。

未经过任何处理的1×10⁵脂肪源性干细胞加入淋巴细胞中共培养7 d；在实验组中，脂肪源性干细胞用50 μg/L γ型干扰素处理48 h后，同样的细胞数量添加到淋巴细胞中共培养7 d；对照组加入相同数量的异体淋巴细胞。第7天时，加入氚标记胸腺嘧啶核苷，放置于37 ℃，体积分数为5% CO₂孵箱中培养。收集样品于玻璃纤维滤纸上，烤干后，用液闪计数仪计数。增殖水平用每分钟计数(CPM)值表示。

脂肪源性干细胞抑制植物血凝素刺激淋巴细胞增殖反应：1×10⁵外周血淋巴细胞接种于96孔板，加入2 mg/L植物血凝素，1×10²-1×10⁵脂肪源性干细胞加入淋巴细胞中共培养7 d，同样测CPM值表示淋巴细胞的增殖，同时采用5 g/L多聚甲醛固定失活的脂肪源性干细胞为对照组。

脂肪源性干细胞对混合淋巴细胞反应的作用：外周血淋巴细胞制备方法同前，1×10⁵反应细胞(淋巴细胞)和刺激细胞(异体淋巴细胞)同时接种于96孔板，然后加入1×10²- 1×10⁵“第三者”细胞——脂肪源性干细胞，与混合淋巴细胞共培养7 d，同样测定CPM值，观察其对淋巴细胞增殖抑制情况。共培养7 d后，收集培养液上清，用流式细胞仪检测γ型干扰素的浓度，抗体为FITC标记的γ型干扰素鼠抗人单克隆抗体。

主要观察指标：Western blot法和RT-PCR测定实验脂肪源性干细胞表面在有无γ型干扰素刺激时白细胞抗原Ⅱ、吲哚胺-2，3-双加氧酶基因和蛋白的表达情况。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，并用单因素方差分析和t 检验进行组间比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞的分类有很多分法，常用的方法有2种，第一是根据干细胞的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞^[27]。其中胚胎干细胞的发育等级较高，也叫作全能干细胞，具有增殖分化向全部组织和器官的能力，但其数量非常有限，且不易于获取^[28]。成体干细胞的发育等级较低，为多潜能或单能干细胞，具有特异性，可以在某些情况下迁移到受损的组织，经过细胞分裂产生子细胞，继续分化从而代替死去的细胞，修复受损组织^[29]。胚胎干细胞虽然有潜在的分化能力，能够应用到组织工程中修复受损的器官或组织，但其存在伦理学问题；而成体干细胞却没有伦理学问题，并且具有和胚胎干细胞相同的功能，为组织工程提供了新的种子细胞。

其中，脂肪干细胞来源丰富，取材便利，是一种理想的成体干细胞^[30-33]。本次实验检测了脂肪干细胞白细胞抗原Ⅱ的表达，发现其本底表达水平很低，但在用γ型干扰素刺激后，其表达水平明显增加，说明γ型干扰素参与了脂肪干细胞的免疫调节作用。同时，实验检测了脂肪源性干细胞表达吲哚胺-2，3-双加氧酶基因情况，发现脂肪源性干细胞低表达吲哚胺-2，3-双加氧酶基因和蛋白，但经γ型干扰素诱导后，吲哚胺-2，3-双加氧酶基因水平和蛋白水平均表达明显上调，说明脂肪源性干细胞发挥免疫调节作用是通过吲哚胺-2，3-双加氧酶介导的，这和之前的研究结果相似^[34-37]。

已有研究表明，骨髓间充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应，但脂肪源性干细胞是否具有相似作用目前还不清楚。因此，实验体外分离培养脂肪源性干细胞，然后分别用其单向刺激淋巴细胞，抑制植物血凝素导致的淋巴细胞增殖以及抑制混合淋巴细胞反应增殖。实验结果发现脂肪源性干细胞不能刺激淋巴细胞增殖，同样，经γ型干扰素处理的脂肪源性干细胞也不能刺激淋巴细胞增殖，表明无论脂肪源性干细胞是否表达白细胞抗原Ⅱ，均有低的免疫原性，可用于移植治疗各种疾病。混合淋巴细胞培养，是指两个无关个体、功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于白细胞抗原Ⅱ类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增值。脂肪源性干细胞能够抑制植物血凝素或异体淋巴细胞引起的淋巴细胞增殖，但当脂肪源性干细胞用多聚甲醛固定失活后，这种抑制作用完全消失，证明脂肪干细胞同骨髓间充质干细胞一样，除了具有低免疫原性，还有免疫抑制作用^[38]。在脂肪源性干细胞和混合淋巴细胞反应共培养的上清中，检测到了大量γ型干扰素，表明这种免疫抑制作用是通过γ型干扰素激活吲哚胺-2，3-双加氧酶发挥的。之前的研究表明，成熟脂肪细胞能调节幼稚淋巴前体细胞的增殖，这种作用是通过脂肪细胞分泌的Leptin、前列腺素等特异性细胞因子作用的^[39-40]，从而调节淋巴-造血系统生成；同时，成熟脂肪细胞通过分泌脂联素可选择性抑制B淋巴细胞的前体细胞^[41]。实验发现作脂肪干细胞能在体外抑制成熟的淋巴细胞增殖反应，其作用依赖于脂肪干细胞分泌的γ型干扰素，但是否还有其他细胞因子发挥作用还有待进一步研究。实验表明脂肪干细胞具有与骨髓间充质干细胞相近的低免疫原性，同时还具有一定的免疫抑制作用，添加外源性γ型干扰素有助于脂肪源性干细胞发挥免疫抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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Interferon-gamma enhances immunosuppression mediated by adipose-derived stem cells

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[2]	徐聪, 赵赫, 孙岩. 生物材料导管修复面神经损伤与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1089-1095.
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[4]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[5]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[6]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[7]	崔连旭, 江文康, 陆大鸿, 许峻荣, 刘小翠, 王丙云. 临床级人脐带间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠神经功能的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 835-839.
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[11]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[12]	郝柳芳, 段红梅, 王子珏, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 转基因小鼠脊髓损伤后室管膜细胞的时空动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 883-889.
[13]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
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