心肌梗死模型大鼠心功能与血管活性物质释放关键蛋白NSF-siRNA

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何通过有效的干预手段，降低心血管疾病发病率与死亡率，已经成为一个日益迫切的重大公共卫生问题。
目的：探索腺病毒介导的血管活性物质释放关键蛋白NSF-siRNA对心肌梗死模型大鼠心脏功能的影响。
方法：36只成年SD大鼠，经结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。心电图确定模型成功后，分别给予大鼠心脏左室壁梗死区周围局部注射NSF-siRNA腺病毒(实验组)、阴性腺病毒(对照组)及生理盐水(生理盐水组)。2周后通过无创超声心动图测定心脏左室射血分数(LVEF)值；并通过右颈外动脉置管，连接BL-420生物机能实验系统测定左心室舒张末期压(LVEDP)及心室内压力变化率峰值(dp/dtmax)评价心功能；随后取材、连续切片，观察心肌梗死范围。
结果与结论：2周时实验组左室射血分数值与对照组及生理盐水组相比明显增加(P < 0.05)；实验组左室舒张末压与对照组及生理盐水组相比显著降低(P < 0.05)；实验组左室最大压力上升速率与对照组及生理盐水组比较明显增加(P < 0.05)；心肌梗死面积各组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。结果可见梗死局部周围注射腺病毒介导的NSF-siRNA表达载体，能显著改善模型大鼠心肌梗死后2周左室射血分数、左心室舒张末期压、心室内压力变化率峰值3项心功能指标，但对心肌梗死面积无明显影响。

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关键词: 实验动物, 组织构建, 心肌梗死, 心功能, NSF, RNA干扰, 左室舒张末压, 左室射血分数

Abstract:

BACKGROUND: How to reduce the incidence and mortality of cardiovascular diseases is an urgent concern in the field of public health.
OBJECTIVE: To explore the influence of adenovirus-mediated NSF-siRNA release from vesoactive substance on the cardiac function of a rat model of myocardial infarction.
METHODS: A total of 36 adult Sprague-Dawley rats were applied to establish acute myocardial infarction models by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. After the model was determined by electrocardiogram successfully, NSF-siRNA adenovirus (experimental group), negative adenovirus (control group) and normal saline (normal saline group) were injected near the infarct area of the left ventricle of rats respectively. After 2 weeks, the left ventricular ejection fraction (LVEF) was tested with noninvasive ultrasonic cardiogram. Meanwhile, the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and maximum pressure rising speed of left ventricular (dp/dt max) were detected by connecting the right external carotid artery place pipe to the BL-420 biological function experiment system, to evaluate the cardiac function. Subsequently, the rat heart was harvested for serial sections to observe the infarcts range.
RESULTS AND CONCLUSION: After 2 weeks, the LVEF of the experimental group was increased remarkably (P < 0.05), while the LVEDP of the experimental group was decreased evidently compared with the control group and normal saline group (P < 0.05), and the dp/dt max of the experimental group was significantly increased (P < 0.05). Furthermore, there were no significant differences in the infarct area among groups (P > 0.05). The local injection of adenovirus mediated NSF-siRNA expression vector in infarct part can improve the cardiac function indexes, including LEVF, LVEDP and dp/dt max 2 weeks after myocardial infarction, but it has no impact on the myocardial infarction area.

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Key words: myocardial infarction, models, animal, stroke volume, RNA interference

中图分类号:

R318

刘岩，周勇，杨水祥，王真. 心肌梗死模型大鼠心功能与血管活性物质释放关键蛋白NSF-siRNA[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(27): 4287-4292.

Liu Yan, Zhou Yong, Yang Shui-xiang, Wang Zhen. Cardiac function of myocardial infarction rat models and NSF-siRNA, a key protein released from vesoactive substance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(27): 4287-4292.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

N-已基顺丁烯二酰亚胺敏感因子(N-ethylamaleimide- sensitive factor，NSF)是介导内皮细胞中可分泌颗粒韦伯潘力氏小体(Weibel Palade body，WPB)与内皮细胞膜融合而导致胞吐作用的关键蛋白质，介导释放韦伯潘力氏小体内容物^[1-2]。韦伯潘力氏小体内含有P-选择素、血管性血友病因子、内皮素1及白细胞介素8等血管活性物质，这些物质在血管损伤的早期即被释放，可以导致中性白细胞黏附到血管内皮、血小板聚集，并诱发血管痉挛等一系列血管壁的炎症反应，在血栓形成、炎症反应和血管痉挛方面起着至关重要的作用，与动脉粥样硬化、急性冠脉综合征和心肌梗死等的发生发展相关密切^[3-4]。课题组一直注重韦伯潘力氏小体释放的机制和调节释放方面的研究^[5]，前期已经成功克隆出人主动脉内皮细胞NSF基因，构建了针对人主动脉内皮细胞NSF蛋白N端功能区编码基因的重组腺病毒载体Ad-H1-NSF/siRNA，通过DNA测序及病毒滴度测定后转染于人主动脉内皮细胞，用Realtime PCR及Western Blot技术在不同的时间点对NSF-mRNA及NSF蛋白的表达进行测定，结果显示NSF-siRNA能够诱导NSF-mRNA表达下调，降低NSF蛋白合成，从而有效抑制内皮细胞韦伯潘力氏小体的释放^[6]。本实验在前期研究的基础上，建立大鼠心肌梗死模型，在梗死区周围局部注射重组腺病毒载体NSF-siRNA，应用心脏超声和生物机能实验系统测定2周后大鼠心功能，以探索NSF-siRNA对模型大鼠心肌梗死后心功能的影响，为开发小分子RNA药物及防治动脉粥样硬化、急性冠脉综合征和急性心肌梗死提供有价值的资料。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年12月至2013年5月在首都医科大学附属北京世纪坛医院动物实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级SD大鼠36只，雄性，体质量为180-220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为11400700010718，实验动物使用许可证号为SCXK(京)2012-0001。动物在屏障系统环境下，用专用饲料(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)和灭菌水分笼饲养。

实验方法：

Adv-NSF-shRNA的构建和制备：从GeneBank中选取大鼠NSF基因序列(基因收录号：NM_021748.1)，采用siRNA Target Designer-Version1.51设计软件，设计针对NSF基因N-末端区的21 nt寡核苷酸干扰序列(5’-TAG GAC TGG TCG TTG GAA ACA-3’)，并设计siRNA正义链和反义链，以loop(10 nt)相连，称为shRNA(short hairpin RNA)(图1)。合成编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面连接RNA Poly Ⅲ聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 MluⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，可以克隆到siRNA 载体腺病毒SD1219多克隆位点的MluⅠ和Hind Ⅲ酶切位点之间(图2)。腺病毒载体pRNAT-H1.1/Adeno(SD1219)经MluⅠ和 Hind Ⅲ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。与新合成的两端分别带有MluⅠ和Hind Ⅲ酶切位点NSF-shRNA DNA模板使用T₄连接酶进行连接。连接产物转化DH5α感受态细菌，在LB-kana培养基上铺板接种，37 ℃倒置培养过夜。收获细菌，使用上海Shinegene公司的小量质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，并使用MluⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定和测序鉴定后标记冻存。Adv-NSF-shRNA的纯化及鉴定参照文献[7]。将透析纯化后的腺病毒采用TCID50(50% tissue culture infective dose)法进行病毒滴度测定，计算出本次病毒制备的滴度为1.2×10¹³ TU/L (Adv-NSF-shRNA由上海Shinegene公司构建和制备)。

心肌梗死模型建立：参考以往的模型制作方法，结扎冠状动脉前降支制造心肌梗死模型^[8]。将36只SD大鼠称质量，根据体质量将实验鼠排序，随机分为实验组(注射重组腺病毒)、对照组(注射阴性腺病毒)、生理盐水组，每组12 只，同组同笼。1%戊巴比妥钠 4 mL/kg腹腔麻醉，接BL-420生物机能实验系统，记录心电图形(图3)。气管插管，左侧第4、5肋间开胸，开胸后接通HX-300S动物呼吸机，呼吸频率80次/min，呼吸比2∶1，潮气量7-10 mL，根据实验鼠肺复张情况及血氧饱和度情况调节。用8-0无创伤丝线穿过左冠脉前降支，进针深度为0.2-0.4 mm，打结后可见左室前壁及心尖部颜色变白。心电监护可见V1导联ST段抬高为左冠脉前降支结扎成功(图4)，然后将前降支行永久性结扎以建立急性心肌梗死模型。确定造模成功后，实验组取NSF-siRNA腺病毒1.2×10¹² TU/L×200 μL，于实验鼠左室游离壁上、下、左、右4个点局部注射，每点50 μL，阴性对照组及生理盐水组分别给予同等剂量阴性对照腺病毒和生理盐水。给药结束后用0号丝线关闭胸腔，抽净胸腔内残余血液，保持胸腔负压，断开呼吸机，依次缝合肌肉及皮肤。暂留气管插管，防止术后气道堵塞，术后暖光及热水袋保持实验鼠体温，待实验鼠麻醉后苏醒，喂食少量清水并拔出气管插管，术后观察4 h，实验鼠发作心律失常抽搐时给予按压胸腔。术后5 d连续肌注青霉素预防感染。

超声心动图测定心功能：2周后再次称实验鼠质量，1%戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔麻醉，记录心电图形可见V1导联病理性Q波形成(图5)。麻醉后使用超声心动图测定实验鼠左心室射血分数(LVEF)值。

BL-420生物机能实验系统测定左室舒张末期压(LVEDP)及心室内压力变化率峰值(dp/dt_max)评价心功能：将麻醉后大鼠仰卧位固定于鼠板上，右颈外动脉置管，管内注满12 500 U/L的肝素纳生理盐水稀释液，接BL-420生物机能实验系统(图6)，测定实验鼠左室舒张末期压(LVEDP)及心室内压力变化率峰值(dp/dt_max)(图7)，压力换能器与实验鼠左心室位于同一水平面，测定前及测定后均调零，保证实验数据可信。

取材：测定完毕取各组实验鼠心脏反复冰盐水冲洗，剔除表面结缔组织，随后连续切片，在避光现配的2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，恒温(37℃)摇床水浴箱里对心肌组织进行染色20 min，未梗死区染成深红色，梗死区为灰白色(图8)，沿分界线剪下梗死区及全部心脏组织称质量。

主要观察指标：左心射血分数、左室舒张末期压、心室内压力变化率峰值心脏梗死面积。

统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以 x(_)±s表示，先进行方差齐性检验，如不齐则采用变量变换达到齐性，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

据世界卫生组织报告，心血管疾病每年导致1 750万人死亡，其中760万人死于心脏病，570万人死于脑卒中，预计到2020年，这一数字到2020年预计增加50%，全球因心血管疾病死亡人数将达2 500万人。而且死亡人数的80%分布在低中等收入国家，从2000至2020年，心肌梗死将在各种死因中从第5位上升为第1位，心血管疾病的死亡率远高于包括癌症、艾滋病在内的其他疾病，成为人类健康的“第一杀手”。因此，对于数以千万计的全球心血管疾病患者，尤其是心血管疾病高危患者，如何通过有效的干预手段，降低心血管疾病发病率与死亡率，已经成为一个日益迫切的重大公共卫生问题。 RNA干扰(RNAi)是一种序列特异性的转录后基因沉默，长的dsRNA分子导入细胞后在Dicer酶的作用下裂解成siRNA分子，后者高效、特异性地与靶基因mRNA结合，抑制转录后的蛋白翻译，从而达到治疗疾病或研究目的基因功能的作用。RNAi技术是近年来发现和发展起来的新兴的基因阻断手段，它在功能基因组和相关方面的研究中具有许多传统方法无可比拟的特点和优势^[9-13]。

RNAi应用于临床治疗的前提条件是必须构建安全、高效的表达载体，化学合成法人工制备siRNA，然后采用传统的转染方法如Lipofectamine转染、电打孔等将siRNA导入细胞，操作简单快速，但不适宜在人体内进行，且引起的RNA干扰效应往往难以持久。为改善RNA干扰效应，实验选择在细胞内表达siRNA的方法，选用转染效率高的第3代腺病毒载体作为基因转染的载体，将表达NSF-siRNA的腺病毒载体转染细胞，载体在细胞内表达针对NSF的siRNA从而抑制靶基因的表达。第3代腺病毒是新型的复制缺陷型载体，其感染谱广、转染效率高达90%以上、容量大、体外可操作性好，可高效感染分裂和非分裂细胞，且不融合到宿主细胞的基因组内，安全性高，是快速产生重组腺病毒的简单有效的腺病毒载体系统，目前应用广泛^[14-16]。复制缺陷型腺病毒已被美国食品药品管理局批准作为基因治疗载体应用于临床实验。

如前所述，多项实验证明NSF是介导内皮细胞中的可分泌颗粒韦伯潘力氏小体与内皮细胞膜融合而导致胞吐作用的关键蛋白质，在血栓形成、炎症反应和血管痉挛方面起着至关重要的作用。很多学者对NSF的作用及其调控做了大量研究^[17-21]。课题组前期实验结果显示NSF-siRNA能够诱导NSF-mRNA表达下调，降低NSF蛋白合成，从而有效抑制内皮细胞韦伯潘力氏小体的释放。本实验在前期研究基础上，建立大鼠心肌梗死模型，在梗死区周围局部注射重组腺病毒载体NSF-siRNA，应用心脏超声和生物机能实验系统测定2周后大鼠心功能及心梗面积，结果显示实验组与对照组及生理盐水组的左心室射血分数、左心室舒张末期压、左心室内压力变化率峰值3项指标于2周时差异具有显著性意义，此3项值作为心功能指标，实验组大鼠均优于对照组和生理盐水组，其机制可能与心肌梗死后局部注射NSF-siRNA腺病毒，抑制NSF靶基因表达，导致内皮细胞韦伯潘力氏小体的释放减少，局部致血栓及炎症因子等浓度降低，弱化心肌顿抑、心肌冬眠效应，挽救半梗死区心肌细胞的功能有关。这预示着RNAi技术在动脉粥样硬化、急性冠脉综合征等心血管系统疾病的预防和治疗方面具有极大的研究价值及应用前途。

实验结果显示2周时阴性腺病毒对照组的左心室射血分数值高于生理盐水组，另一方面，阴性腺病毒对照组的左心室舒张末期压值高于生理盐水组。一般认为病毒感染后头2周可介导炎症反应，对心肌梗死后心脏功能的影响是不利的。考虑出现此现象可能的原因：①体外超声测量左心室射血分数值时超声探头需避开左胸建立心梗模型时的胸壁切口瘢痕，位置有一定改变，可能存在系统误差，需进行改进。但未显著影响测量结果，即阴性腺病毒对照组与生理盐水组间左心室射血分数值差异无显著性意义。②考虑左心室射血分数反映左心室收缩功能，左心室舒张末期压反映左心室舒张功能，二者可能存在不同步现象。

本实验各组心肌梗死面积差异无显著性意义，考虑与心肌梗死模型制作方法和评估方法有关，因结扎左冠状动脉前降支系急性机械性结扎，短期内无法建立有效的侧支循环，导致无法显著缩小心肌梗死面积。曾有学者采用将前降支结扎40 min后解除结扎的方法以建立急性心肌梗死模型，以贴近缺血再灌注的情况，但本实验组考虑到系开胸后呼吸机支持下手术操作，开胸暴露时间长或二次开胸会导致实验鼠死亡率增加，且对实验无显著影响，故采用永久性结扎前降支的方法以建立急性心肌梗死模型。有学者采用将心室切为薄切片，扫描计算各层面积的方法来计算总的心肌梗死面积，本实验组在实际操作中发现大鼠心室体积小，将其均匀切片操作困难，层厚不易恒定，易导致计算误差，故采用将梗死区剪下称取质量的方法，减小操作难度，但此种方法需精确区分梗死区分界并剥离，也存在测量误差可能，需在以后的实验中进一步寻找更为精确的测量方法。

总之，本实验表明，重组腺病毒载体介导的RNA干扰作用能有效改善心肌梗死大鼠心功能，RNAi有望成为未来心血管疾病治疗的新手段。但RNAi作为一种临床治疗手段，仍有许多问题需要解决，如重组载体的某些成分可能诱发宿主的免疫反应、作用持续时间、理想空壳载体的选择、辅助病毒或质粒的选择、病毒纯化及生物安全性等，这些问题的解决有赖于未来进一步的基础及临床研究。