去卵巢骨质疏松模型大鼠小肠钙结合蛋白mRNA表达与菟丝子黄酮的干预

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (27): 4271-4276.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.002

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去卵巢骨质疏松模型大鼠小肠钙结合蛋白mRNA表达与菟丝子黄酮的干预

李小林¹，武密山²，朱紫薇³，邓勇存³，叶圆圆³，赵素芝⁴，任立中⁵，李彬⁶

¹河北医科大学第二医院，河北省石家庄市 050000； ²河北中医学院基础医学院方剂学教研室，河北省石家庄市 050200；³河北中医学院2011级中医学专业，河北省石家庄市 050091；⁴石家庄市桥东区胜北社区卫生服务中心，河北省石家庄市 050041；⁵河北医科大学第一医院骨科，河北省石家庄市 050031；⁶河北医科大学生物化学教研室，河北省石家庄市 050017

出版日期:2014-06-30 发布日期:2014-06-30
通讯作者: 武密山，博士，教授，硕士生导师，河北中医学院基础医学院方剂学教研室，河北省石家庄市 050200
作者简介:李小林，女，1957年生， 2003年河北医科大学毕业，副主任医师，主要从事中药治疗风湿骨病作用机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81073074，30472200)；河北省自然科学基金项目(H 2013206005)；河北省留学人员科技活动项目择优资助项目(200828)；河北省大学生创新创业训练计划项目(201310089062)

Effects of flavonoids from Cuscuta chinensis on intestinal calcium-binding protein mRNA expression in ovariectomized osteoporosis model rats

Li Xiao-lin¹, Wu Mi-shan², Zhu Zi-wei³, Deng Yong-cun³, Ye Yuan-yuan³, Zhao Su-zhi⁴, Ren Li-zhong⁵, Li Bin⁶

¹Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China;² Department of Prescriptions, Basic Medicine College, Hebei University of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China; ³Department of 2011 Grade of Traditional Chinese Medicine, Hebei University of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, Hebei Province, China; ⁴Qiaodong District Shengbei Community Health Center of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050041, Hebei Province, China;⁵ Department of Orthopedics, First Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; ⁶ Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China

Online:2014-06-30 Published:2014-06-30
Contact: Wu Mi-shan, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Prescriptions, Basic Medicine College, Hebei University of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China
About author:Li Xiao-lin, Associate chief physician, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81073074, 30472200; the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. H 2013206005; the Science and Technology Activities Funded Project for Overseas Students of Hebei Province, No. 200828; the Students’ Innovation Venture Training Program of Hebei Province, No. 201310089062

摘要/Abstract

摘要：

背景：菟丝子是旋花科植物菟丝子Cuscutachinensis Lam.的成熟种子，为温补肾阳的要药，前期研究表明，由菟丝子组成的补肾复方在抑制骨量丢失，改善骨密度方面有明显疗效。
目的：探讨菟丝子黄酮对去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨骨密度、血清和肾脏1，25-二羟基维生素D3(1，25(OH)₂ D₃)含量、小肠钙结合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表达的影响。
方法：72只SD雌性大鼠，随机数字表法均分为6组(n=12)：假手术组、模型组、维生素 D3组和菟丝子黄酮小、中、大剂量组。假手术组仅行假手术，其余5组分别行卵巢切除，1周后分别灌胃给予维生素D3 (2 mg/kg)以及小、中、大剂量菟丝子黄酮连续给药3个月。腹主动脉取血，分离血清，取出肾脏，采用酶联免疫吸附法检测 1，25(OH)₂D₃含量。之后处死动物，取出股骨，测定骨密度；取出第2腰椎，采用实时荧光反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)测定腰椎和肾脏组织维生素D受体mRNA表达。取出小肠，采用RT-PCR测定小肠CaBp-D9K mRNA表达。
结果与结论：与假手术组相比，模型组股骨骨密度、血清和肾脏 1，25(OH)₂ D₃、腰椎组织维生素D受体mRNA、小肠CaBp-D9K mRNA表达均下降。与模型组比较，菟丝子黄酮中、大剂量组和维生素D3组均可使股骨骨密度、血清和肾脏1，25(OH)₂ D₃、腰椎组织维生素D受体mRNA、小肠CaBp-D9K mRNA表达增加。菟丝子黄酮能够显著提高去卵巢大鼠股骨骨密度、血清和肾脏1，25(OH)₂ D₃、腰椎组织维生素D受体mRNA、小肠CaBp-D9K mRNA表达，促进肠钙吸收与成骨细胞活性，增强骨质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 骨质疏松症, 菟丝子黄酮, 骨密度；1, 25-二羟基维生素D3, 钙结合蛋白, 大鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cuscuta chinensis is a mature seed of Cuscutachinensis Lam., can warm kidney. Previous studies demonstrated that kidney compound composed of Cuscuta chinensis could apparently inhibit bone loss and improve bone density.
OBJECTIVE: To explore the influence of flavonoids from Cuscuta chinensis on bone mineral density of femur, 1,25(OH)2D3 levels of serum and kidney, the expression of small intestine CaBp-D9K mRNA in model rats with ovariectomized osteoporosis.
METHODS: A total of 72 Sprague-Dawley female rats were equally and randomly divided into six groups (n=12): sham surgery group, model group, vitamin D3 group and low-, moderate- and high-dose flavonoids groups. The sham surgery group only received sham operation and the other five groups were ovariectomized respectively. One week after ovariectomy, the rats were given flavonoids from low-, moderate- and high-dose Cuscuta chinensis and vitamin D3 (2 mg/kg) by intragastric administration for 3 consecutive months. Blood was obtained from the abdominal aorta. Serum was isolated. The kidney was obtained. Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine 1,25(OH)2D3 contents of renal and serum. Rats were sacrificed at the end of experiment. The thighbone was taken out to determine bone mineral density. The second lumbar vertebra was taken out to measure the expression of lumbar vertebra and renal vitamin D receptor mRNA using real-time fluorescent reverse transcription-polymerase chain reaction. The small intestine was taken out to measure the expression of small intestine CaBp-D9K mRNA using real-time fluorescent reverse transcription-polymerase chain reaction.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, bone mineral density of femur, and
1,25(OH)2D3 levels of serum and kidney and the expression of lumbar vertebra vitamin D receptor mRNA significantly decreased in model group, and the expression of small intestine CaBp-D9K mRNA significantly decreased in model group. Compared with the model group, bone mineral density of femur, and 1,25(OH)2D3 levels of serum and kidney, and the expression of the second lumbar vertebra vitamin D receptor mRNA, and the expression of small intestine CaBp-D9K mRNA were increased in moderate- and high-dose flavonoids groups and vitamin D3 group. Results indicated that flavonoids from Cuscuta chinensis could significantly raise bone mineral density of femur, and 1,25(OH)2D3 levels of serum and kidney and the expression of lumbar vertebra vitamin D receptor mRNA and the expression of small intestine CaBp-D9K mRNA, accelerate intestinal calcium absorption and osteoblast activity, and reinforce quality of the bone.

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Key words: osteoporosis, bone density, flavones, calcium-binding proteins, osteoblasts

中图分类号:

R318

李小林，武密山，朱紫薇，邓勇存，叶圆圆，赵素芝，任立中，李彬. 去卵巢骨质疏松模型大鼠小肠钙结合蛋白mRNA表达与菟丝子黄酮的干预[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(27): 4271-4276.

Li Xiao-lin1, Li Xiao-lin, Wu Mi-shan, Zhu Zi-wei, Deng Yong-cun, Ye Yuan-yuan, Zhao Su-zhi, Ren Li-zhong, Li Bin. Effects of flavonoids from Cuscuta chinensis on intestinal calcium-binding protein mRNA expression in ovariectomized osteoporosis model rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(27): 4271-4276.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收之间的平衡是维持骨组织不断更新，保持骨质量的基本过程，此平衡一旦被打破即可导致各种代谢性骨病。骨质疏松症是以骨量减少、骨组织显微结构退化，如松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄等为特征，以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身骨病。1，25-二羟维生素D₃ [1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25(OH)₂D₃]是维生素D₃的活性代谢产物，通过与维生素D受体结合发挥生物学效应。1，25-(OH)₂D₃与维生素D受体结合可调控钙结合蛋白(calcium-binding protein，CaBP)基因的转录^[1]。CaBP-D9K是钙结合蛋白家族的一员，与胞内游离Ca²⁺有高度亲和力，可介导调节Ca²⁺参与的多种生理功能^[2]。

菟丝子是旋花科植物菟丝子Cuscutachinensis Lam. 的成熟种子，为温补肾阳的要药，前期研究表明，由菟丝子组成的补肾复方在抑制骨量丢失，改善骨密度方面有明显疗效^[5]。2010年《中国药典》指定菟丝子黄酮(flavonoids from cuscuta chinensis)为菟丝子的含量测定标准，目前菟丝子黄酮对整体动物1，25(OH)₂D₃含量和维生素D受体mRNA表达的研究国内外较少，深入研究菟丝子黄酮对整体动物肾脏1，25(OH)₂D₃含量、腰椎维生素D受体mRNA表达的影响，可从器官水平揭示菟丝子黄酮对骨代谢病调节的机制，对于研究菟丝子黄酮抗骨质疏松作用机制有重要意义。

实验采取切除卵巢建立骨质疏松大鼠模型，观察菟丝子黄酮对大鼠股骨骨密度、血清和肾脏1，25(OH)₂D₃含量、腰椎维生素D受体mRNA表达、小肠钙结合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表达的影响，探讨菟丝子黄酮防治去卵巢骨质疏松大鼠骨丢失和骨质量下降的作用机制。

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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年4月在河北医科大学中西医结合基础实验室完成。

材料：

实验动物：健康雌性SD大鼠共72只，3月龄，体质量(265±15) g，SPF级，实验动物由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

药物来源：菟丝子药材经河北医科大学中药鉴定教研室鉴定为菟丝子Cuscutachinensis Lam.的成熟种子，经溶剂提取，聚酰胺柱色谱分离得黄酮提取物，聚酰胺薄层色谱表明含有槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和槲皮素- 3-O-β-半乳糖-7-O-β-葡萄糖4个组分，与文献报道一致^[6]；以芦丁为标准对照品，比色法测定黄酮质量分数为40%-45%。实验中配成10，5，2.5 g/L 混悬液(分别相当于生药 2，1，0.5 g/mL)。

维生素D滴剂：购于厦门星鳖制药有限公司，国药准字H35021450，产品批号：2914002。每粒含维生素D₃ 400单位，用双蒸水配置成5 μg/L溶液，溶液配置好后分装小试剂瓶内，避光低温保存备用。

方法：

实验造模与分组：72只SD雌性大鼠随机均分为6组(n=12)：假手术组、模型组、对照药物维生素D₃组和菟丝子黄酮小、中、大剂量组。将动物乙醚麻醉，腰背部两侧剪毛，体积分数75%乙醇消毒，假手术组大鼠从背部切口，找到卵巢后，只切除少量脂肪组织后缝合；其他各组均参照本实验室的背驮式方法从背侧切口摘除双侧卵巢^[7]，缝合伤口，然后涂以红霉素软膏抗感染。

卵巢切除1周后，给大鼠灌胃给药：菟丝子黄酮小剂量组大鼠灌胃给予1.25 mL/kg 菟丝子黄酮混悬液，菟丝子黄酮中剂量组大鼠灌胃给予2.5 mL/kg菟丝子黄酮混悬液，菟丝子黄酮大剂量组大鼠灌胃给予5 mL/kg菟丝子黄酮混悬液，对照组大鼠灌胃给予对照药物维生素D₃混悬液(2 mg/kg)，假手术组和模型组分别灌胃给予与菟丝子黄酮大剂量组等体积 (5 mL/kg)的蒸馏水，连续给药3个月后，腹主动脉取血，离心，分离出血清；取肾脏、小肠同一部位小部分组织于冻存管中-70 ℃保存；取大鼠的第2腰椎和股骨，小心剥离，去除表面软组织，保留完整骨膜，冷生理盐水纱布冷藏保存。

骨密度测定：取右侧股骨，按文献[8]分别测出股骨整体、股骨近端(为股骨近侧干骺端1/3)，股骨远端(为股骨远侧干骺端1/4)骨密度，最终以平均值计。

血清和肾脏组织1，25(OH)₂D₃含量的测定：将肾组织室温复融后用生理盐水洗净去杂、称质量、剪碎至10 mL的组织匀浆器中，按1 g组织加入5 mL PBS的比例进行组织匀浆，将组织匀浆液移入5 mL离心管中20 ℃ 5 000 r/ min离心15 min，取上清后再10 000 r/ min离心10 min后取上清备用。血清和肾脏组织1,25(OH)₂D₃含量检测操作过程按照试剂盒说明书进行。

腰椎组织维生素D受体mRNA表达的检测：引物由上海博亚生物工程公司依据 Genebank 数据库获得基因序列合成。维生素D受体引物序列：上游5’-GTG ACT TTG ACC ACG ATT TC-3’，下游5’- ATC ATC TCC CTC CCT CTG GT-3’，扩增片段长度为285 bp。β-actin引物序列：上游5’-TTG ATG TCA CGC GGC ACG TG-3’，下游5’-TGT CCC TGT ATG TTA CGC TG-3’，扩增片段长度为216 bp。

(1)总RNA提取：采用Trizol一步法分别提取腰椎组织中总RNA，具体操作步骤如下：在细胞中加入冰预冷的Trizol 试剂，室温静置5 min；加200 μL氯仿，充分摇匀15 s，室温静置2.0-3.0 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上层无色水相层转移至新EP管；加等体积异丙醇，室温静置 10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，管壁底处可见乳白色沉淀，即为RNA；弃上清，加体积分数75%乙醇1 mL，4 ℃，7 500 r/min离心5 min，洗涤2次；弃上层乙醇，无菌环境风干RNA沉淀。用20 μL DEPC处理的双蒸馏水(dd H₂O)溶解 RNA 沉淀，-80 ℃，备用；取 4 μL总RNA加至200 μL灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其A₂₆₀和A₂₈₀，计算A₂₆₀/A₂₈₀。样品总RNA(g/L)= A₂₆₀×40×稀释倍数(50)/1 000。A₂₆₀/A₂₈₀在1.8-2.0为样品较纯。用前调整浓度至1 g/L。

(2)反转录反应：在20 μL反应体积中进行，成分如下：总RNA 2 μg(5 μL)，随机引物1 μL，DEPC处理的ddH₂O 4.5 μL，70 ℃冰浴10 min；加10 μL反转录反应液(10×buffer 2 μL，MgCl₂ 4 μL，dNTP 2 μL，inhibitor 0.5 μL，反转录酶1 μL)，42 ℃冰浴60 min，99 ℃冰浴5 min，-20 ℃保存备用。

(3)荧光定量PCR反应体系：cDNA 1 μL，10×buffer 5.0 μL，MgCl₂(25 mmol/L) 7.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，Primer F (20 μmol/L) 0.8 μL，Primer R (20 μmol/L) 0.8 μL，SYBR Green Ⅰ1 μL，Taq 酶 (5 U/μL) 0.5 μL。反应条件：94 ℃ 30 min，94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，50个循环。Cycle threshold (Ct)值的计算分析：待测样品相对值=2^-^△△^Ct，△Ct = Ct 阴性对照-Ct 待测样品，△△Ct=△Ctβ-actin-△Ct待测样品。

小肠钙结合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表达的检测: 引物由Invitrogen公司合成，CaBp-D9K引物序列：上游5’- GCT ACC ACC CCA GA G AA GTC C A-3’，下游5’- CAG TGT GGG CG CCT TCA ACA-3’，扩增片段长度为 445 bp。β-actin引物序列：上游5’-CAT CTC TTG CTC GTC TGA GGA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG A AGC TCA GTG- 3’，扩增片段长度为317 bp。

总RNA 提取：采用 Trizol 一步法提取小肠组织中总 RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A₂₆₀/A₂₈₀均在 1.8-2.0。总RNA浓度=A₂₆₀值×8(g/L)，用前调整浓度至1 g/L。②在反转录酶 M-MLV 的作用下，将mRNA反转录成cDNA 分子，反应体系：H₂O 5.5 μL，Oligo(dT 18) 1.0 μL，tRNA 6.0 μL，Rnasin 0.5 μL，5×buffer 4.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，RT ase 1. 0 μL，反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。③用RG-3000 Real-time PCR仪扩增，所用试剂为芬兰Finnzymes公司DyNAmoTM SYBR Green qPCR Kits荧光染料。反应体系：上、下游引物各 0.7 μL，cDNA 1.5 μL，10×buffer 5.0 μL，MgCl₂(25 mmol/L) 7.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，SYBR Green Ⅰ1 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL。反应条件：94 ℃ 1 min，95 ℃ 4 min，53.1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共32个循环。以标本中所提取的质量较好的RNA反转录得到的cDNA作为标准品，经等比稀释后，进行PCR反应制备标准曲线。反应结束后，根据自动生成的标准曲线，Cycle threshold(Ct)值的计算分析：待测样品相对值=2^-^△△^Ct，△Ct=Ct阴性对照-Ct待测样品，△△Ct=△Ct β-actin-△Ct 待测样品。

主要观察指标： ①骨密度。②血清和肾脏组织 1，25(OH)₂D₃含量。③腰椎组织维生素D受体mRNA表达。④小肠钙结合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表达。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，应用SPSS 11.0软件进行统计学处理，组间比较采用单因素(one-way ANOVA)方差分析。

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讨论

1，25(OH)₂D₃ 通过与维生素D受体结合可调控钙结合蛋白基因转录^[1]，介导多系统器官的生理功能。细胞对 1，25(OH)₂D₃反应性的差异与胞内维生素D受体的表达水平直接相关，因此，调节细胞内维生素D受体表达便成为调节其对1，25(OH)₂D₃反应性的重要途径之一^[3]。 1，25(OH)₂D₃可上调多种组织细胞维生素D受体蛋白表达，但对维生素D受体 mRNA表达则可表现为上调或无调节作用，可能具有组织细胞特异性^[3-4]。无论是通过小肠吸收的维生素D₃，还是皮肤光合作用合成的维生素D₃，首先必须通过特异的维生素D结合蛋白转运到肝脏中，在肝细胞微粒体和线粒体25-羟化酶的作用下，维生素D₃脱氢生成25(OH)D₃。随后进入肾脏，在肾小管细胞线粒体 1-α羟化酶催化下，25(OH)D₃转化成维生素D的最终活性形式1，25(OH)₂D₃，成为具有最大生物活性的维生素D代谢产物，然后转运到肠道、肾脏、骨等靶器官中，与靶组织中的维生素D受体结合。维生素D受体是介导1，25(OH)₂D₃发挥生物效应的核内生物大分子，为类固醇激素/甲状腺激素受体超家族的成员，其与1，25(OH)₂D₃激素信号分子在靶细胞结合后形成激素-受体复合物，再与视黄醛x受体形成杂二聚体，后与维生素D反应元件结合，对靶基因的转录和翻译进行调控，进而实现调节钙磷代谢的生物学功能。 1，25(OH)₂D₃是重要的骨代谢调节激素(D激素)，在体内有多方面活性，如调节肾小管中的钙结合蛋白^[10]，促进肾调钙素结合蛋白(Calmodulin binding proteins，CaMBPs)的合成^[11]，调控Ⅰ型胶原、金属蛋白酶、骨唾液酸蛋白等成骨细胞外基质成分^[12,13]，影响成骨细胞的矿化、凋亡等^[14]。小肠黏膜上皮细胞中存在维生素D受体， 1，25(OH)₂D₃通过影响钙从小肠进入细胞外液的主动转运而实现对肠钙吸收的调节^[15]。维生素D受体是细胞核激素受体，其不仅存在于成骨细胞，也存在于破骨细胞，本质上反映了1，25(OH)₂D₃的功能，位于骨组织上的维生素D受体作用是双向的，成骨细胞上的维生素D受体可调节位于破骨细胞上的维生素D受体，维生素D受体是一种依赖配体的核转录因子，对骨合成和分解代谢起着双向调节作用。

钙结合蛋白是体内一种与Ca²⁺具有高亲和力的蛋白质，钙结合蛋白可以与游离Ca²⁺结合，阻止细胞内Ca²⁺过度蓄积，减轻Ca²⁺诱导的破骨作用，调节钙平衡。小肠钙结合蛋白及其mRNA表达特异性减少，提示钙结合蛋白基因表达的降低，导致骨代谢钙平衡失调，从而增加对破骨细胞的敏感性，导致钙离子介导的成骨细胞作用减弱。维生素D依赖性钙结合蛋白是一组受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，因为与钙有高亲和力，在小肠和肾脏钙的细胞内转运过程中起着非常重要的作用。肾脏上皮滤过钙10%-15%在远曲小管重吸收，远曲小管钙的重吸收与钠的重吸收无关，且不依赖于浓度差和电位差，远曲小管细胞内存在CaBP-28K和维生素D受体、PMCA(ATP依赖性浆膜钙泵)，维生素D受体使钙进入细胞内，同时CaBP-D28k、PMcA 基因表达和蛋白合成增加，PMCA 被激活，CaBP-D28k与钙离子有很高的亲和力，作为钙的载体，使钙迅速扩散，负责钙在细胞内的迅速转运，以使胞内外钙运动增加，满足机体对钙的需要^[16]。

正常情况下，肠道钙的吸收以主动转运为主，也就是需要肠道CaBp-D9k的协助。CaBp-D9k是一种受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，相对分子质量为9 000，主要集中于杯状细胞与小肠刷状缘的吸收细胞上，与肠道中的钙有高度亲和力，其分子结构中有两个钙结合部位，在小肠钙的细胞内转运过程中起有重要作用。1，25(OH)₂D₃在肠道 CaBp-D9K合成过程中也起着举足轻重的作用，给维生素D₃缺乏的大鼠和小鸡注射1，25(OH)₂D₃后可引起小肠黏膜中CaBp-D9K mRNA的快速合成和可翻译CaBp-D9K mRNA 的积聚，体内实验也证实1，25(OH)₂D₃可以增加 CaBp-D9K基因的转录。维生素D依赖性钙结合蛋白是一组受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，因为与钙有高亲和力，所以在小肠和肾脏钙的细胞内转运过程中起着非常重要的作用。CaBP-D9K主要集中在小肠，CaBP-Ds的功能是提高VD依赖性细胞内钙离子的转运。1，25(OH)₂D₃诱导产生的CaBP-D9K和CaBP-D28K与钙离子转运率和速度有关^[16]，CaBP-Ds增加钙离子通过细胞弥散的速度,加速钙从细胞顶端到达基底侧的速度^[16]。最近研究表明，从大鼠十二指肠提取的mRNA至少有10%指导钙结合蛋白的合成，mRNA的含量直接影响钙结合蛋白的合成，从而影响肠钙的吸收，且这些均与1，25-(OH)₂D₃的水平呈明显正相关。对体内钙代谢的调节方面，本研究室应用分子生物学基因重组和杂交技术，对地塞米松诱发的骨质疏松大鼠肠道CaBP-D9K基因及其mRNA水平及补肾中药和维生素D₃治疗后的变化进行了研究。对地塞米松和卵巢切除所诱发的骨质疏松模型及自然衰老的大鼠骨质疏松3种模型，给予中药治疗^[17]。结果证明，中药可以增强骨质疏松大鼠体内肠道CaBP-D9K基因的表达，CaBP-D9K mRMNA的增加意味着CaBP-D9K合成的增加及肠钙吸收的增强，进而纠正体内负钙平衡状态抑制破骨作用，促进成骨作用。

本实验结果表明，正常大鼠肠黏膜组织可以在基因、蛋白水平表达钙结合蛋白CaBP-D9K，并且可能在肠钙吸收中起重要作用。大鼠肾虚骨质疏松症的发生，与肠黏膜组织中钙结合蛋白CaBP-D9K mRNA和蛋白表达的变化有关，从而影响肠钙的吸收。实验假手术组小肠CaBp-D9K mRNA阳性表达，说明在健康大鼠小肠内有钙结合蛋白、肾脏有维生素D受体分泌。模型组骨密度、血清和肾脏组织1，25(OH)₂D₃含量降低，小肠CaBp-D9K mRNA表达降低，表明大鼠股骨和肾脏维生素D受体分泌减少。与模型组相比，菟丝子黄酮中、大剂量组、维生素D₃组的骨密度、血清和肾脏组织1，25(OH)₂D₃含量升高、小肠CaBp-D9K mRNA表达显著增加。说明菟丝子黄酮和VitD的生物活性主要是通过1，25(OH)₂D₃与靶器官(小肠、骨、肾)组织细胞核上的维生素D受体相互作用。菟丝子补肾，肾为先天之本，可以生后天之本脾，因脾主运化，调节小肠受盛化物，故能上调小肠上皮细胞CaBp-D9K mRNA的表达。本实验结果表明菟丝子黄酮中、大剂量组和活性维生素D₃组均能提高去卵巢骨质疏松骨密度，通过1，25(OH)₂D₃与靶器官(肠、骨、肾)组织细胞核上的维生素D受体作用，促进小肠CaBp-D9K mRNA表达，从而提高骨密度，菟丝子黄酮补肾中药通过调控大鼠肠黏膜钙结合蛋白CaBP-D9K mRNA蛋白表达，促进肠钙的吸收，对于骨质疏松症有一定的防治作用。本实验从分子水平揭示骨质疏松的发病机制，为骨质疏松的防治奠定基础。

去卵巢骨质疏松模型大鼠小肠钙结合蛋白mRNA表达与菟丝子黄酮的干预

Effects of flavonoids from Cuscuta chinensis on intestinal calcium-binding protein mRNA expression in ovariectomized osteoporosis model rats

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