磷酸钙人工骨联合雷洛昔芬修复兔下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：雷洛昔芬是第3代选择性雌激素受体调节剂，可减少骨量的丢失，增加骨组织中的矿物质含量，降低骨折风险。
目的：观察雷洛昔芬结合自固化磷酸钙人工骨修复兔下颌骨缺损的效果。
方法：在36只新西兰大白兔左侧下颌骨制作8 mm×4 mm×3 mm的缺损模型，随机分组，实验组12只植入自固化磷酸钙人工骨，并给予雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)；药物组12只给予雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)；人工骨组12只植入自固化磷酸钙人工骨。分别于治疗4，8，12周取下颌骨标本，免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2的表达，激光共聚焦显微镜观察转化生长因子β的表达。
结果与结论：实验组治疗后4，8周时的骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色阳性细胞数明显高于药物组与人工骨组，治疗后12周时实验组骨改建基本完成，骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色阳性细胞数目低于其他两组。实验组转化生长因子β免疫荧光染色表达为逐步升高，到第8周时达到峰值，而药物组和人工骨组的转化生长因子β免疫荧光表达从4-12周一直呈上升状态，趋近于最高峰。说明雷洛昔芬能够促进自固化磷酸钙人工骨在骨缺损过程中骨形态发生蛋白的早期表达及早期骨痂的形成，加快骨缺损修复。

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 雷洛昔芬, 磷酸钙人工骨, 骨缺损, 骨形态发生蛋白2, 转化生长因子β

Abstract:

BACKGROUND: Raloxifene is the third generation of selective estrogen receptor modulators, which can decrease bone loss, increase bone mineral content, and reduce fracture risk.
OBJECTIVE: To study the effects of raloxifene combined with self-setting calcium phosphate cement on the repair of rabbit mandibular defects.
METHODS: Totally 36 New Zealand white rabbits were selected to prepare 8 mm×4 mm×3 mm mandibular defect models, and then randomized equally into experimental group (raloxifene, 7.5 mg/kg per day, combined with self-setting calcium phosphate cement), drug group (raloxifene, 7.5 mg/kg per day), artificial bone group (self-setting calcium phosphate cement). Rabbits were sacrificed 4, 8 and 12 weeks later, respectively, for measurement of bone morphogenetic protein 2 using immunohistochemistry method and transforming growth factor β using a laser scanning confocal microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After 4 and 8 weeks, the expression of bone morphogenetic protein 2 was obviously higher in the experimental group than the drug and artificial bone groups; after 12 weeks, bone remodeling was basically complete in the experimental group, and the expression of bone morphogenetic protein 2 became lower than that in the other two groups. The expression of transforming growth factor β in the experimental group was gradually increased and reached the peak at 8 weeks, while in the drug and artificial bone groups, the expression of transforming growth factor β exhibited an increasing trend within 4-12 weeks, which was close to the peak. These findings suggest that raloxifene can promote early expression of bone morphogenetic proteins and early callus formation as well as accelerate the repair of bone defects with calcium phosphate cement.

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Key words: biocompatible materials, calcium phosphates, raloxifene, bone morphogenetic proteins, transforming growth factor beta

中图分类号:

R318

关键，徐峰. 磷酸钙人工骨联合雷洛昔芬修复兔下颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(25): 3993-3997.

Guan Jian, Xu Feng. Raloxifene combined with calcium phosphate cement for repair of rabbit mandibular defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(25): 3993-3997.

图/表（结果） 2

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引言

目前，由各种原因引起的骨缺损很多，尤其是在骨科、口腔颌面外科及整形外科等很常见。据统计，中国每年需要植骨的骨缺损和骨折患者可达到300万以上，理想的修复方法是临床所面临的一大难题。骨组织由骨细胞和骨基质所组成，在组织中正常的成骨细胞、骨细胞核和骨细胞功能是生理骨量和骨结构形成的基础^[1-2]。一般治疗骨缺损的方法以自体骨和同种异体骨移植为主，但这两种方法都有一定的局限性^[3]。因此，具有良好生物相容性和生物活性的无机类骨水泥材料获得了较快的发展，如自固化、可注射磷酸钙材料及多孔支架材料等，在骨缺损修复及骨折愈合方面的研究与应用较为广泛，但其降解速率较慢^[4]。如何有利于促进骨缺损的愈合仍是现阶段研究的重点。雷洛昔芬是第3代选择性雌激素受体调节剂，有特异性激动剂和拮抗剂的双重作用，是目前惟一被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松的选择性雌激素受体调节剂^[5]。它对骨重建和钙代谢的作用相似，在降低骨吸收的同时，使钙平衡正向转移，减少尿钙的丢失，增加骨矿盐密度和骨髓纤维化。朱小峰等^[6]研究雷洛昔芬对骨质疏松大鼠颅骨缺损修复的实验发现，雷洛昔芬可加强外源性骨髓基质干细胞在体内的成骨作用，可明显提高骨缺损修复的能力。故实验观察雷洛昔芬对植入磷酸钙人工骨材料兔下颌骨缺损的修复作用，观察骨缺损愈合过程中骨形态发生蛋白2 和转化生长因子β的变化，为临床提供一种理想恢复骨愈合的新方法及实验数据。

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材料方法

设计：随机分组动物观察实验。

材料：

实验动物：成年新西兰大白兔36只，雌雄不拘，体质量2-2.5 kg，由佳木斯大学动物中心提供。

雷洛昔芬联合磷酸钙人工骨修复骨缺损实验的材料及仪器：
材料与仪器	来源
磷酸钙人工骨粉	上海瑞邦生物材料有限公司
雷洛昔芬	山东宏富达医药化工有限公司
骨形态发生蛋白2即用型SABC免疫组织化学试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
NSK牙科微动力低速钻、生物清洁工作台、BI-2000医学图像分析系统	成都泰盟公司
FV100-ASW2.0型荧光光度分析系统、FV1000型OLYMPUS显微镜	佳木斯大学基础医学院

实验方法：

实验动物下颌骨骨缺损模型的建立及分组干预：取新西兰大白兔36只，以3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉注射麻醉至动物完全麻醉，备皮，用清水洗兔颏下区后消毒，体积分数75%乙醇和0.5%碘伏交替反复消毒，铺孔巾，暴露兔的颏下区位置，然后沿兔左侧下颌骨下缘3 cm切开皮肤，分离肌层，沿下颌缘切开骨膜分离骨膜暴露下颌体，并以低速牙钻生理盐水冷却下做一8 mm×4 mm×3 mm的骨缺损，保留骨膜生理盐水反复冲洗，随后将动物随机分组，实验组12只于骨缺损处植入自固化磷酸钙人工骨，并给予雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)；药物组12只骨缺损区不作处理，给予雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)；人工骨组12只于骨缺损处植入自固化磷酸钙人工骨，充分止血后严密逐层缝合创口。

术后动物的饲养及用药：单笼饲养每只兔，常规饲料喂养。3组兔子术后7 d连续肌注盐酸庆大霉素0.5 mg/kg，1次/d，并每日碘伏消毒创区。实验组与药物组术后连续给予雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)，直至实验结束。

大体一般情况观察：术后大体观察动物的饮食、活动、精神状态及术区有无感染等情况。

取材及标本制备：术后4，8，12周时分别耳缘静脉栓塞法处死动物，取离体的下颌骨标本，要求在下颌骨缺损区周围至少5 mm的正常组织标本骨组织块。生理盐水反复冲洗后，体积分数10%甲醛固定液常规固定。

固定24 h后，将标本块放入到10%EDTA脱钙液中，在常温下脱钙28 d，每4 d更换1次脱钙液。在28 d时标本呈现乳白色，用大头针刺入标本块边缘的组织块顺利通过，表明骨组织已经完全脱钙。进行下一步乙醇梯度脱水：先将标本骨组织块用流水冲洗24 h，体积分数60%乙醇1 h，体积分数70%乙醇1 h，体积分数80%乙醇过夜，体积分数90%乙醇1h，体积分数95%乙醇35 min，体积分数100%乙醇1 h。将标本取出，标本块浸蜡，包埋，切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的蜡块。

免疫组织化学观察：参照骨形态发生蛋白2免疫组织化学试剂盒的操作方法进行免疫组织化学染色。每个标本取10张切片，显微镜放大，200倍后随机取10个视野，阳性为黄褐色，采用BI-2000序列图像分析软件进行骨形态发生蛋白2阳性细胞数量的测量。阳性细胞达到高峰越早说明骨组织愈合越快。

激光共聚焦显微镜观察：参照转化生长因子β免疫组织化学试剂盒的操作方法进行免疫组织化学染色，分别将4，8，12周时3组转化生长因子β的免疫组织化学荧光染色切片放大到400倍，行激光共聚焦显微镜观察，PI FITC激发波长为488，发射波长为543。荧光光度分析仪检测标记细胞的荧光强度，荧光强度越强说明转化生长因子β的表达量大，骨生长的速度快。

主要观察指标：各组标本骨形态发生蛋白2与转化生长因子β的表达。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，应用SPSS 11.5软件进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

由于骨缺损常给患者带来严重的生理危害，严重影响患者的生活和工作，因而找到一种快速治疗骨缺损的方法已成为许多研究者的心愿^[7]。骨重建是个非常复杂的过程，多种因素交互作用，包括破骨细胞、生长因子、细胞因子等^[8]，骨细胞在这些因子及内分泌和神经系统的影响下，调节骨愈合过程^[9]。骨组织的合成贯穿人体整个生命过程的始终，骨骼重建需要骨组织不断的进行更新^[10-12]。理想的骨缺损修复材料具有与人体骨结合的良好生物相容性、生物化学性能，无毒性，安全性，对周围骨无损伤性，并可对不同骨缺损的形态进行骨形态重塑，恢复骨组织原有形态^[13]。自固化磷酸钙人工骨目前已成为临床较为常见的一种骨缺损充填材料^[14]。雷洛昔芬的抗骨质疏松作用在绝经后骨质疏松症的临床中得到证实。Body等^[15]报道用雷洛昔芬7.5 mg/(kg•d)治疗骨质疏松症3年，结果腰椎骨密度增加1%-3%，脊柱骨折减少30%-50%。动物实验也证实雷洛昔芬对卵巢切除大鼠诱发的骨质疏松有治疗作用，可增加腰椎、股骨远端骨强度，疗效与雌激素替代的治疗相似^[16]。还有相关动物实验也证明了雷洛昔芬能使骨松质的骨量在多个部位显著增加^[17-23]。人们对雷洛昔芬的药理作用进行了广泛的基础和临床研究，相关文献也论证了其促进成骨和对骨质疏松的治疗作用^[24]。自固化磷酸钙人工骨作为临床上较为常见的骨缺损充填材料也已被广泛应用^[25]。实验结果证明了磷酸钙人工骨材料结合雷洛昔芬对骨形成的协调作用。

生长因子在骨形成及骨组织修复过程中起着重要作用^[26-27]。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中最具代表性的成员之一，由成骨细胞分泌，具有诱导间充质细胞、骨髓基质细胞、骨膜细胞迁移、增殖分化为软骨细胞、成骨细胞，最终导致新骨形成的成骨活性因子^[28-29]，其还有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，能够促使肢芽的生长，诱导软骨细胞和成骨细胞前体的形成，并协同其他调节因子参与骨组织形成^[30]。骨形态发生蛋白2是公认的最主要骨形成调控因子^[31-32]，也是惟一一个可诱导异位成骨的细胞因子^[33]。体内外实验证明它具有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力^[34-35]。Beek等^[36]研究指出，雌激素代替治疗不仅可阻止骨丢失，也增加骨形成，上调间充质干细胞骨形态发生蛋白2 mRNA的表达。骨形态发生蛋白2的含量可反映成骨细胞的骨形成能力^[37-38]。骨修复早期在创伤等因素刺激下，骨缺损端局部成骨细胞和周围间充质细胞增殖，局部骨形态发生蛋白2高表达细胞增多，从而使骨形态发生蛋白2合成和分泌增加，又进一步促使间充质细胞向成软骨细胞和成骨细胞转化，增强骨诱导性。骨缺损修复晚期，随着成熟骨细胞增多，成软骨细胞、成骨细胞和间充质细胞减少，骨形态发生蛋白2表达下降，骨形态发生蛋白2合成减少，骨诱导作用减弱，直至达到维持正常骨代谢的平衡水平。Sheehan等^[39]研究通过制作实验恒河猴造成双侧缺损模型，证实骨形态发生蛋白2治疗骨缺损可以促进和明显改善骨形成和骨连接，初步评价其应用有良好的安全性。实验中观察到实验组8周前的骨形态发生蛋白2阳性细胞数目均高于药物组和人工骨组，12周时又均低于药物组和人工骨组，药物组和人工骨组在整个实验周期无差别，证实了磷酸钙人工骨材料和雷洛昔芬结合有促进骨形成的作用。

转化生长因子β是一组多功能的蛋白多肽，广泛存在于动物的正常细胞及转化细胞中，以血小板和骨组织中含量最丰富^[40]。转化生长因子β对骨细胞有以下几种作用：对成骨细胞的作用，调节成骨细胞的分化和增殖；趋化作用，可以促进细胞向骨折部位聚集和迁移；对破骨细胞的作用，抑制破骨细胞的形成和活化。有研究显示骨折发生的24 h内，细胞外的转化生长因子β表达主要位于骨折区和骨膜下的血肿内，而在软骨形成阶段，增殖型的间充质细胞和幼稚的软骨细胞阳性表达最强。还有研究认为，转化生长因子β是诱导软骨和骨生成的重要因子之一，通过Northern blot杂交技术验证并描述了骨愈合过程中转化生长因子β水平的动态变化。形态计量学研究发现，转化生长因子β的表达强度与软骨细胞的数目有关，在骨组织中含量很丰富，在骨愈合的各阶段均有表达，可促进成骨细胞增殖和基质合成。实验通过激光共聚焦的方法对转化生长因子β进行免疫荧光检测，免疫荧光光度分析表明，实验组4，8周时的转化生长因子β荧光强度均高于药物组和人工骨组，并在8周时达到最高峰。在12周时，实验组的转化生长因子β荧光强度降低，基本完成成骨的重建，药物组和人工骨组的转化生长因子β荧光强度仍持续升高，还在继续骨的改建。

实验选择了代表性因子骨形态发生蛋白2和转化生长因子β研究骨缺损愈合过程，观察雷洛昔芬促进磷酸钙人工骨材料对兔下颌骨缺损的作用。从动物实验结果表明，单纯服用雷洛昔芬或单独植入磷酸钙人工骨材料修复骨缺损的过程中虽成骨活性较好，但在植入磷酸钙人工骨材料并服用雷洛昔芬后，骨缺损处生长因子的表达多且早于单纯服用雷洛昔芬或单独植入磷酸钙人工骨材料，说明雷洛昔芬能够促进磷酸钙人工骨材料在骨缺损过程中骨形态蛋白早期的表达及早期骨痂的形成。

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生长因子在骨形成及骨组织修复过程中起着重要作用。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中最具代表性的成员之一,由成骨细胞分泌，具有诱导间充质细胞、骨髓基质细胞、骨膜细胞迁移、增殖分化为软骨细胞、成骨细胞，最终导致新骨形成的成骨活性因子，其还有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，能够促使肢芽的生长，诱导软骨细胞和成骨细胞前体的形成，并协同其他调节因子参与骨组织形成。骨形态发生蛋白2是公认的最主要骨形成调控因子，也是惟一一个可诱导异位成骨的细胞因子。体内体外实验证明它具有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。Zhou等研究指出，雌激素代替治疗不仅可阻止骨丢失，也增加骨形成，上调间充质干细胞骨形态发生蛋白2mRNA的表达。骨形态发生蛋白2的含量可反映成骨细胞的骨形成能力。骨修复早期在创伤等因素刺激下，骨缺损端局部成骨细胞和周围间充质细胞增殖，局部骨形态发生蛋白2高表达细胞增多，从而使骨形态发生蛋白2合成和分泌增加，又进一步促使间充质细胞向成软骨细胞和成骨细胞转化，增强骨诱导性。骨缺损修复晚期，随着成熟骨细胞增多，成软骨细胞、成骨细胞和间充质细胞减少，骨形态发生蛋白2表达下降，骨形态发生蛋白2合成减少，骨诱导作用减弱，直至达到维持正常骨代谢的平衡水平。Sheehan 等研究通过制作实验恒河猴造成双侧缺损模型，证实骨形态发生蛋白2治疗骨缺损可以促进和明显改善骨形成和骨连接，初步评价其应用有良好的安全性。实验中观察到实验组8周前的骨形态发生蛋白2阳性细胞数目均高于药物组和人工骨组，12周时又均低于药物组和人工骨组，药物组和人工骨组在整个实验周期无差别，证实了磷酸钙人工骨材料和雷洛昔芬结合有促进骨形成的作用。

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