V-ATPase a3转运系统影响破骨细胞、骨吸收及骨折愈合的分子机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.026

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3257-3262.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.026

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V-ATPase a3转运系统影响破骨细胞、骨吸收及骨折愈合的分子机制

宋敏¹，董万涛²，陈秉虎³，柴居堂¹，黎彦龙³，韦宏³，陈秉雄^1，3

1甘肃中医学院，甘肃省兰州市 730000；2甘肃中医学院附属医院，甘肃省兰州市 730020；3临洮县人民医院，甘肃省定西市 730500

收稿日期:2014-03-31 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 陈秉雄，在读硕士，甘肃中医学院，甘肃省兰州市 730000；临洮县人民医院，甘肃省定西市 730500
作者简介:宋敏，男，1964年生，甘肃省兰州市人，汉族，1987年甘肃中医学院毕业，教授，主要从事中医药对于骨折及代谢性骨病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81360554)；吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金(320.6750.11061)；甘肃省省青年科技基金计划(1208RJYA066)

Molecular mechanism of osteoclast, bone resorption and fracture healing by V-ATPase a3 transport system

Song Min¹, Dong Wan-tao², Chen Bing-hu³, Chai Ju-tang¹, Li Yan-long³, Wei Hong³, Chen Bing-xiong^{1, 3}

1Department of Orthopedics, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Affiliated Hospital of Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730020, Gansu Province, China; 3People’s Hospital of Lintao County, Dingxi 730500, Gansu Province, China

Received:2014-03-31 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Chen Bing-xiong, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; People’s Hospital of Lintao County, Dingxi 730500, Gansu Province, China
About author:Song Min, Professor, Department of Orthopedics, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360554; Clinical Research Special Funds by Wu Jieping Medical Foundation, No. 320.6750.11061; Science and Technology Project for Youth of Gansu Province, No. 1208RJYA066

摘要/Abstract

摘要：

背景：V-ATPase a3转运系统在破骨细胞对于骨吸收机制中起重要作用。
目的：归纳总结V-ATPase a3转运系统在骨折修复中的表达，以及V-ATPase a3转运系统抑制剂对于骨折愈合的影响，进而能更好的指导临床。
方法：在国内外期刊数据库中检索近10年内国内外文献，按检索关键词检索相关文献，筛选出符合纳入标准的文献，对其文献进行质量评估后采纳。
结果与结论：V-ATPase a3转运系统广泛存在于真核细胞的细胞质膜和细胞器膜上，V-ATPase a3有2个结构域V0和V1，V0结构域是质子转运的通道，V1结构域主要是水解ATP供能。V-ATPase a3转运系统集中存在于破骨细胞皱褶缘上，逆浓度梯度转运H+，为破骨细胞提供酸性环境，溶解无机物，为水解酶创造微环境降解有机物，参与骨吸收。因而V-ATPase a3转运系统在骨折的修复与重塑中选作研究靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 组织构建综述, V-ATPase a3, 破骨细胞, 骨折愈合, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The V-ATPase a3 transport system plays a crucial role on bone resorption mechanism of the osteoclasts.
OBJECTIVE: To observe the expression of V-ATPase a3 transport system in fracture repair and the effect of V-ATPase a3 transport system inhibitor on fracture healing.
METHODS: We retrieved related literatures in the periodicals database with the key words, and screen them according to the inclusion criteria. The literatures were included in this study after the evaluation of quality.
RESULTS AND CONCLUSION: V-ATPase a3 transport system widely exists in the cytoplasm membrane and organelle membrane of eukaryotic cells. V-ATPase a3 has two structural domains: V0 and V1. V0 structural domain is the proton transport channel, V1 structural domain is mainly the hydrolysis of ATP. V-ATPase a3 transport system focuses on the frilled edge of osteoclasts, H+ is transported to form a high concentration, dissolves inorganic minerals and provides the acidic environment for hydrolytic enzymes, thus being involved in bone resorption. So V-ATPase a3 transport system is selected as the research target in the fracture repair and reshape.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: V-ATPase a3, osteoclasts, fracture healing

中图分类号:

R318

宋敏，董万涛，陈秉虎，柴居堂，黎彦龙，韦宏，陈秉雄. V-ATPase a3转运系统影响破骨细胞、骨吸收及骨折愈合的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3257-3262.

Song Min, Dong Wan-tao, Chen Bing-hu, Chai Ju-tang, Li Yan-long, Wei Hong, Chen Bing-xiong. Molecular mechanism of osteoclast, bone resorption and fracture healing by V-ATPase a3 transport system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3257-3262.

图/表（结果） 2

2.1 V-ATPase a3基因蛋白、破骨细胞的功能及生物学意义真核细胞中的阳离子转运ATPase有3种，其中V-ATPase存在于细胞质膜和细胞器膜上，位于细胞质膜上的V-ATPase参与正常生理及疾病的过程，如破骨细胞皱褶缘上V-ATPase参与骨吸收；位于细胞器膜上的V-ATPase维持细胞器的酸性环境，对于受体介导的内吞噬非常关键^[1-2]。V-ATPase主要有2个结构域V0和V1，V0结构域是质子转运的通道，V1结构域主要是水解ATP供能^[2]。ATPase a3基因产物为相对分子质量 116 000的蛋白(a3)，是破骨细胞空泡型质子泵(空泡型氢离子三磷酸腺苷转运酶Vacuolar H⁺-translocatiing，ATP-ase，简称V-ATPase)跨膜部分之一，V-ATPase活化后将H⁺分泌到细胞外而完成骨吸收功能^[3]。 ATPase a3基因编码的蛋白作为一种酶，能够水解ATP，并能利用ATP水解释放出的能量驱动物质跨膜运输，把H⁺转输到细胞外，破骨细胞在H⁺作用下完成骨的吸收(图1)。

a3是V-ATPase的异构体，全部集中存在于破骨细胞皱褶缘上，是功能性破骨细胞的必需成分^[4]。a3亚基的表达随破骨细胞核数的增加而增多，是V-ATPase的关键性亚基，由V-ATPase基因调控，是功能性破骨细胞的必需成分^[3]。位于破骨细胞膜上的质子转运系统V-ATPase a3，水解ATP产生能量，逆浓度梯度转运H⁺跨膜转运的能量系统。为破骨细胞创造酸性环境，可见V-ATPase a3在破骨细胞骨吸收中不可或缺^[5]。

破骨细胞起源于造血干细胞，是一种高度分化的多核巨细胞，也是在骨折愈合过程执行骨吸收的唯一细胞类型。在1，25(OH)₂D₃以及白细胞以及白细胞介素(白细胞介素1，3)等细胞因子的作用下，分化为成熟的破骨细胞^[6]。其分化过程主要被基质/成骨细胞及来源于它们的巨噬细胞集落刺激因子(C-MSF)与核因子κB受体活化因子配体调控^[7]。即RNAKL信号与破骨细胞前体细胞膜上的RANK结合，将信号传递与TRAF6，通过NIK和IKK活化核因子κB，活化核因子кB迅速与IKK分离进入细胞核，使c-Fos的高表达，c-Fos进一步与活化的T细胞核因子结合并相互作用，启动相应的靶基因的表达和转录，最终诱导成熟破骨细胞的形成。

在破骨细胞表面有许多标志性受体，如降钙素受体(CTR)、抗酒石酸磷酸酶(TRAP)、Ⅱ型碳酸酐酶、组织蛋白酶K及Vitornectin受体(CR)等^[8]。破骨细胞膜上有质子泵，主要是空泡型质子泵。此外破骨细胞含有极其丰富的酸性磷酸酶、溶酶体酶、组织蛋白酶等，主要存在于粗面内质网、高尔基体中。

破骨细胞在骨吸收与骨的重建中起启动作用，附着于骨面形成骨吸收的微小环境，合成并释放水解酶和酸，终始骨矿溶解，骨胶原纤维的降解^[9]。破骨细胞通过其质膜上的空泡型分泌分解骨结构中的矿物质，并通过分泌多种水解酶降解有机骨基质，通过各种细胞间的相互作用，以及多种细胞因子的调控，执行骨吸收。

破骨细胞细胞膜表面由许多不规则的绒毛状突起，可以增加与骨组织的接触面积，并且这些绒毛状的突起可以合成和释放酸与酶等多种生物活性物质，其在绒毛部位的空破区，是骨吸收的重要组成部分。其中碳酸酐酶在骨吸收中起极为重要的作用，释放的酸主要是通过Ⅱ型碳酸酐酶将CO₂溶于水中形成H₂CO₃再次水解成H⁺和HCO₃^-。再通过H⁺离子泵转运出细胞^[10]。H⁺离子泵主要为泡状型H⁺-ATP酶(ATPase)，将该酶活化将H⁺离子源源不断的转运出细胞^[11]。

破骨细胞皱褶缘上存在V-ATPase转运系统可以创造酸性环境，这种酸性环境可以使羟磷灰石降解并激活cathepsin K消化胶原的酶，从而促进骨吸收，阻止V-ATPase转运系统的功能可以抑制骨吸收，以V-ATPase转运系统作为靶点，为代谢性骨病的防治提供新思路^[12]。

破骨细胞拥有独特的高度特化的质子产生机制及协同转运装置，还能分泌胶原酶和其他在骨基质蛋白降解中有活性的水解酶来快速溶解矿物质。为成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞等参与骨骼的重建细胞体系提供一种微环境。在正常状态下维系骨骼的动态平衡，在骨折时参与骨折的重塑，恢复骨骼的生物力学结构。

2.2 V-ATPase a3转运系统在骨吸收的作用创伤骨折伴随在人们的生活中，治疗技术正在日新月异的完善，但是骨折愈合与重建机制仍需要研究阐明。骨折愈合重建机制包括启动过程，参与的细胞，重建的参与细胞，修复中参与的细胞因子，修复过程的终止原理^[13-14]。人体即使没有发生骨折，也时时刻刻发生着骨结构的改造和重建。而发生骨折中改建机制也非常重要，在这中改建机制破骨细胞扮演着非常重要的角色。

V-ATPase a3基因蛋白在破骨细胞发生破骨与改建机制中起主要作用。其包括大量的破骨细胞活化，募集在骨折端，合成水解酶与酸，进行骨吸收，在骨吸收后连接成骨细胞完成修复过程。破骨细胞在骨吸收过程必须依赖酸性环境，V-ATPase a3基因蛋白水解ATP产生能量，质子泵在这种能量的驱使下，将H⁺转运到细胞外，破骨细胞和水解酶在酸性环境下进行骨吸收。在研究中制备编码V-ATPase a3转运系统缺失的小鼠，小鼠的破骨细胞数目正常，在骨吸收过程中不能形成陷窝，破骨细胞不能形成细胞外的酸化环境，不能形成酸化腔，也不能降解骨结构中矿物质，从而是小鼠出现骨质硬化^[15]。V-ATPase a3转运系统在破骨细胞执行骨吸收中不可或缺，该基因发生突变或缺失是婴儿骨硬化并发生以及胚胎死亡的主要原因^[16]。

破骨细胞在骨吸收过程中，包括骨矿物质的溶解，与其细胞膜上的质子泵—空泡型H⁺离子三磷酸腺苷酸酶(V-ATPase)密切相关，其功能是分泌酸，创造酸性环境中，使其矿物质溶解^[17]。空泡型H⁺离子三磷酸腺苷酸酶中的编码跨膜通道116kDa亚基的基因，水解ATP产生能量，将H⁺转运出细胞外，对破骨细胞的功能的发挥在骨吸收中具有决定性意义^[18]。

吴承亮等^[16]在实验中发现地塞米松+右归饮血清组与生路盐水和地塞米松+对照血清组有显著差异，从而得出右归饮具有阻止V-ATPase a3转运系统，起到抑制破骨细胞的作用。破骨细胞皱褶缘上V-ATPase a3转运系统在局部富集，分泌H⁺到细胞外形成酸性环境。酸性代谢产物和溶酶体酶的释放有利于酸性环境的维持^[19]。

破骨细胞是骨吸收主要执行细胞，在骨重建中也起关键作用。在正常的生理状态下，维持骨骼的动态平衡。骨折后在骨折愈合在重塑期，破骨细胞分泌大量的偶联因子(鞘氨醇1磷酸、肝细胞生长因子等)分泌^[20-21]，促使成骨细胞和破骨细胞聚集在骨折端，从而使骨折端形成的新骨通过成骨细胞和破骨细胞偶联完成骨折的重塑，骨的重建都按着数学法则，使骨的内部结构和外表形态适应其载荷环境的变化。

2.3 V-ATPase a3转运系统在骨折愈合中的作用在骨折愈合后期，原始骨痂形成后，内外骨痂及桥梁骨痂得进一步改建，骨折端的死骨经过爬行营代过程，新生血管伴成骨细胞和破骨细胞的侵入，死骨被清除，排列再乱的骨小梁趋于规律，以及哈佛系统的重建，幼稚的交织骨变成熟的板层骨，使骨质更加坚固。在这骨痂的改建过程中，破骨细胞在担当着非常重要的作用。

当组织细胞受到外界刺激时细胞因子产生，刺激活化破骨细胞，使大量的破骨细胞聚集、趋化及附着于改建的的骨表面。破骨细胞的细胞膜皱褶缘与骨基质共同形成一个密闭的骨吸收的微环境，完成骨吸收及骨细胞性骨溶解^[20-21]。

破骨细胞主要功能是骨吸收，在维持骨折后骨痂的改建、正常的骨骼动态平衡中是必需的。从破骨细胞的活化开始，随之细胞骨架结构发生重组、细胞极性的改变以及出现特定的骨吸收膜区域^[22]。在骨吸收过程中，破骨细胞褶皱缘形成一个特殊的环状密封区域，存在于褶皱缘上的V-ATPase a3转运系统，将胞内H⁺转运到密闭腔隙，提供酸性环境，促使无机物移动，并为水解酶提供酸性环境，完成骨骼的重建。

在骨痂的塑型期，破骨细胞与成骨细胞在骨外表面上是骨的吸收或者沉积，在内部结构上是改变骨组织的体积密度，加强或再吸收骨组织的内部结构。以优化的形态和结构完成自身的重建，无论其在几何形态还是内部结构上都与承载环境充分适应。

V-ATPase a3转运系统的主要功能是将H⁺转运出细胞外，处于静止状态破骨细胞的V-ATPase a3转运系统位于胞浆的空泡膜系统，当破骨细胞活化时黏附于骨表面，致使其结构骨架发生改变，空泡膜系统向附近的细胞膜表面移行并与之融合^[23]，募集在破骨细胞表面的皱褶缘上，将Ⅱ型碳酸酐酶水解成H⁺和HCO₃^-在V-ATPase a3转运系统的作用下，转运出细胞生成酸性环境，有利于无机质和胶原纤维的降解。V-ATPase a3转运系统营造酸化的环境，是骨中无机物移动，暴露出有机成分(Ⅰ型和Ⅱ型胶原纤维)，随后被组织蛋白酶K降解^[13-14]；分布于破骨细胞皱褶缘上V- ATPase a3转运系统将H⁺转运到微环境中，再通过非能量依赖性交换机制分泌Cl^-维持细胞内外的电荷平衡，使破骨细胞处于酸性的微环境中^[24](图2)。破骨细胞膜上的高表达IV型碳酸酐酶、XIV型碳酸酐酶，支持破骨细胞膜上的AE蛋白、碳酸酐酶形成转运代谢区室。

矿物质在酸性微环境中被溶解，有机成分在水解酶的作用下降解，降解后的产物被破骨细胞吞噬排泄后，破骨细胞从骨表面脱离后重新转移到新的位点^[25]。破骨细胞分解无机骨基质与H⁺有关。H⁺的产生由Ⅱ型碳酸酐酶催化产生，由V- ATPase a3转运系统转运。H⁺通过以下反应溶解无极骨基质，Ca¹⁰(PO₄)₆(OH)₂+ 8H⁺→6HPO₄^2-+10Ca²⁺+2H₂O所形成的Ca²⁺和磷酸经细胞外液进入血液^[26]。

V-ATPase a3转运系统在转运质子溶解矿物质后，随即发生的是许多蛋白水解酶降解有机骨基质，但在“骨再建小室”中发生的详细机制尚不清楚，就目前的广泛研究两种蛋白酶为溶酶体的半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K在破骨细胞中的高表达并大量的向封闭带中的分泌，说明两种酶在骨重建中扮演着重要的角色。但是除组织蛋白酶K之外，其他的蛋白水解酶在骨吸收中的作用目前了解尚少。

磷灰石的溶解产生钙离子、磷酸盐和大量的碳酸氢根离子，碳酸氢根离子调节吸收陷窝的pH微环境，如果不被及时的清除将影响骨的重建。以及降解后的有机物片段，不及时清除，也会影响骨的重塑。胶原蛋白降解片段，是通过破骨细胞吸收并且转运到FSD区而被清除。

由各种膜介导的质子与蛋白酶向细胞外分泌及降解产物运输到细胞内的胞转途径。同时存在于破骨细胞的褶皱缘上，并且运输是双向的，而这个膜机制允许酸和蛋白酶向细胞外转运，与此将降解产物胞吞到细胞内，V-ATPase a3转运系统主要在外围的褶皱缘表达；胞吞作用的相关蛋白主要在褶皱缘的中间区域表达。

2.4 V-ATPase a3转运系统抑制剂对于骨折愈合的影响 V- ATPase a3转运系统广泛存在于破骨细胞的皱褶缘上，其V-ATPase a3转运系统与破骨细胞的细胞核的数量呈正比^[27]。V- ATPase a3基因的异常表达，导致破骨细胞功能异常，从而使骨改建平衡失调^[3]。

随着V-ATPase a3转运蛋白信息通路研究的深入化，抗骨吸收药物已日新月异，其通过与受体的结合或旁路途径，直接或间接抑制破骨细胞的功能，最终实现阻止骨的吸收。

Ⅱ型碳酸酐酶抑制剂(如乙酰唑胺)能减少不断分化成熟的破骨细胞，并且能使成熟的破骨细胞吸收活性明显下降，致使骨陷窝的数量和吸收面积明显减少^[28]；Plecomacrolides抗生素家族中的Bafilomycin A1和concanamycin A，属于链霉菌属，在低浓度时抑制V-ATPase，使其功能受限，高浓度时触发破骨细胞程序性死亡，而对其他骨细胞没有细胞毒性作用^[29]；链霉菌属对于破骨细胞在骨折愈合后期骨的重建具有抑制作用，在骨性骨痂的改建中极为不利，导致骨硬化，影响骨的生物力学结构。

V- ATPase a3转运系统抑制剂能阻断H⁺的转运，阻止酸性微环境的形成，抑制水解酶的活性，从而抑制破骨细胞对于骨的重塑与改建。在预防治疗骨质疏松及骨代谢方面成为新的研究靶点。但V- ATPase a3转运系统抑制剂在骨折的愈合方面极为不利，延缓骨的改建。

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引言

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近年来，分子生物学从分子水平阐明生命的本质以来，其作为新兴边缘学科的兴起，在骨科基础研究领域日益得到重视并受到广泛的应用，骨折愈合的机制非常复杂，它不同于其他组织器官的愈合，主要参与的细胞、细胞因子、基因、激素神经等较多，不同愈合阶段有不同的细胞及细胞因子参与，同时细胞外多种基因蛋白在其愈合过程中也起重要作用。

1997年诺贝尔化学奖授予了3位从事ATPase研究的科学家以来，ATPase的研究与日俱增。2001年研究者提出“骨再建小室”的定义^[30]，来阐述骨重建的位置及重建的过程，以及存在于“骨再建小室”中的 V-ATPase a3转运系统转运质子调节骨重建过程，破骨细胞酸化吸收陷窝，形成细胞外的吞噬小体。而这个“骨再建小室”也成为封闭带，是一个动态的过程，在细胞极化进行吸收作用时存在，细胞铺展迁移时消失，存在“骨再建小室”或者封闭带中的关键是V-ATPase a3转运系统，它为封闭带提供酸性微环境，溶解无机物，为水解酶提供酸化的环境降解有机物。在许多启动因子的调节下。成为骨重建的基础单位。

V-ATPase a3转运系统在骨的重建中扮演着重要的角色，也起着核心的作用。以及附属于骨吸收的蛋白水解酶也成为研究的热点。就存在于封闭带中的水解酶研究甚少，以及发生在封闭带中的骨吸收和骨重建代谢的详细过程尚了解甚微。存在于封闭带中的网状代谢有待于进一步的挖掘。

骨的重建过程是吸收与重建并存的过程，细胞内外电荷的平衡机制；有机物降解片段的胞吞机制；降解组分降解经历的环节及最小分子的检测，以及V-ATPase a3小泡与褶皱缘的融合机制，有待于实验的进一步验证和解释。

骨折的修复是一个极其复杂的过程，在不同的修复阶段涉及多种细胞、基因蛋白、细胞因子，在这修复方面虽不断有新的进展，但仍有许多存在于分子水平的现象尚未经充分的揭露或未得到圆满的解释。V-ATPase a3转运系统的研究虽已取得一定的进展^[31-42]，但V-ATPase a3转运系统从细胞内的迁移及封闭带与其骨基质之间的分子偶合机制，在骨折的愈合中骨的重建的机制尚不明朗，以及细胞外机制对骨的作用及其在骨折愈合中所起的作用已日益引起学者们的关注，如神经肽。随着现代科学技术的向生命科学的渗入，V- ATPase a3转运系统机制深入研究，以及特异性的抑制的研制，将可能对加快骨的重建机制，缩短骨折愈合的时间，以及创伤性骨折的基础研究、临床治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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V-ATPase a3转运系统影响破骨细胞、骨吸收及骨折愈合的分子机制

Molecular mechanism of osteoclast, bone resorption and fracture healing by V-ATPase a3 transport system

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