体外受精-胚胎移植的助孕效果：胚胎体外培养和低温保存

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：从第一例试管婴儿诞生至今已二十余年，体外受精-胚胎移植技术在世界范围内得到蓬勃发展。
目的：回顾性分析体外受精-胚胎移植的助孕效果，探讨体外受精胚胎的培养及低温保存技术的应用。
方法：2013年泸州医学院附属医院生殖医学技术部接受体外受精-胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射助孕的不孕患者131例，共147个取卵周期，124个移植周期，患者平均年龄31.32岁。有131个取卵周期应用标准长方案促排卵，4个取卵周期应用超长方案促排卵、10个取卵周期应用超短方案促排卵，2个取卵周期为自然周期排卵；应用新鲜胚胎移植93例，冷冻胚胎移植28例。观察不同促排卵方案、新鲜或冷冻胚胎移植患者的临床妊娠率、胚胎植入率和流产率等。
结果与结论：应用标准长方案、超长方案及超短方案促排卵患者的临床妊娠率为34.7%，50%，20%；植入率分别为19.1%，22.2%，30%；流产率为21.7%，50%，33.3%；以上指标自然周期排卵患者均为0。新鲜胚胎移植临床妊娠率33.6%，植入率18.1%，流产率20.1%；冷冻胚胎移植临床妊娠率53.8%，植入率22.3%，流产率20.7%。提示应用标准长方案促排卵效果好，新鲜及冷冻胚胎移植的疗效相当，胚胎的体外培养及低温冷冻是辅助生殖技术中重要步骤，需进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 体外受精, 胚胎移植, 不孕, 胚胎, 体外培养, 低温保存, 促排卵, 临床妊娠率

Abstract:

BACKGROUND: Since the first successful birth of a "test tube baby", in vitro fertilization-embryo transfer technology has been greatly developed within 20 years.
OBJECTIVE: To retrospectively analyze the assisted reproductive effects of in vitro fertilization-embryo transfer, and to explore the culture of embryos in vitro and the application of cryopreservation technology.
METHODS: A total of 131 infertile patients received in vitro fertilization-embryo transfer or intracytoplasmic sperm injection in Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, China. There were 147 oocyte retrieval cycles and 124 transfer cycles, the mean age of the patients was 31.32 years. Standard long-protocol ovulation induction was given to 131 oocyte retrieval cycles, super-long-protocol ovulation induction was given to 4 oocyte retrieval cycles, and super-short-protocol ovulation induction was given to two oocyte retrieval cycles; 93 cases were transplanted with fresh embryos and 28 cases with frozen embryos. The clinical pregnancy rate, embryo implantation rate and abortion rate of patients receiving different ovulation induction protocols and fresh or frozen embryo transfer were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: In the patients receiving standard long, super-long and super-short protocols for ovulation induction, the clinical pregnancy rate was respectively 34.7%, 50%, 20%; the embryo implantation rates were 19.1%, 22.2%, 30%; and abortion rate was 21.7%, 50%, 33.3%; in those patients, no case exhibited natural cycle of ovulation. In the patients receiving fresh embryo transfer, the clinical pregnancy rate was 33.6%, embryo implantation rate was 18.1%, and abortion rate was 20.1%; in frozen embryo transferred patients, the clinical pregnancy rate was 53.8%, embryo implantation rate was 22.3%, and abortion rate was 20.7%. Experimental findings indicate that, standard long-protocol ovulation induction has good effects, the efficacy of fresh embryo transfer is equivalent to that of frozen embryo transfer, in vitro culture and cryopreservation of the embryos are important steps in assisted reproductive technology and deserver further study.

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Key words: fertilization in vitro, embryo transfer, cryopreservation, pregnancy, reproductive technology, auxiliary

中图分类号:

R318

王芳，陈绍威. 体外受精-胚胎移植的助孕效果：胚胎体外培养和低温保存[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2939-2944.

Wang Fang, Chen Shao-wei. Reproductive effects of in vitro fertilization-embryo transfer: in vitro culture and cryopreservation of embryos[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2939-2944.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析按意向性处理分析，131例的资料均进入结果分析。

2.2 不同促排卵方案患者基本情况及妊娠结果应用标准长方案促排卵131个取卵周期，应用超长方案促排卵4个取卵周期，应用超短方案促排卵10个取卵周期，自然周期排卵2个取卵周期，不同促排卵方案患者的基本情况见表1。

应用标准长方案促排卵患者的临床妊娠率为34.7%，植入率为19.1%，流产率为21.7%；应用超长方案促排卵患者的临床妊娠率为50%，植入率为22.2%，流产率为50%；应用超短方案促排卵患者的临床妊娠率为20%，植入率为30%，流产率为33.3%；按自然周期排卵患者的临床妊娠率、植入率及流产率均为0(图1)。

2.3 新鲜胚胎移植与冷冻胚胎移植患者移植后临床指标观察应用新鲜胚胎移植93例，冷冻胚胎移植28例，两组基本情况见表2。

新鲜胚胎移植93例95个周期，移植胚胎数171个，临床妊娠率33.6%，植入率18.1%，流产率20.1%；冷冻胚胎移植28例29个周期，移植胚胎数67个，临床妊娠率53.8%，植入率22.3%，流产率20.7%(图2)。

2.4 不同胚胎移植数量患者临床指标比较移植1个胚胎的10个周期中有1例临床妊娠，移植2个胚胎的98个周期中有34例临床妊娠，其中4例为多胎妊娠；移植3个胚胎的16个周期中有2例临床妊娠，无多胎妊娠。移植1个胚胎的胚胎植入率为10%，移植2个胚胎的胚胎植入率为23.5%，移植3个胚胎的胚胎植入率为8.3%。见表3，图3。

多胎妊娠的发生是影响胚胎移植结局的重要因素，减少胚胎移植数量会降低多胎妊娠的发生率，而不降低临床妊娠率，移植2个胚胎的临床妊娠率较高，但与移植3个胚胎相比，移植2个胚胎多胎妊娠的发生率较高，但移植3个胚胎生化妊娠的发生率较高，因此移植1个胚胎即单胚胎移植没显著降低临床妊娠率，还可以避免多胎妊娠的发生，达到提高临床妊娠率和胚胎植入率的目的。

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引言

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术，又称试管婴儿，是指从活体卵巢内取出成熟卵子，在体外放入模拟人体内的试管或培养皿内，和精子经体外受精，使卵子与精子进行结合，待受精卵发育成胚胎后，再移植到女性子宫内着床，发育成胎儿，分娩。体外受精-胚胎移植发展到今天，从常规试管婴儿技术到单精子注射技术^[1-2]、胚胎遗传病诊断技术至卵浆置换技术，世界范畴内的成功率已从原来的20%提高到了60%，而且遗传病的发生率也大为降低^[3-4]。

体外受精-胚胎移植技术融合了生殖医学、胚胎学、内分泌学、遗传学以及显微镜操作等技术，其中胚胎体外培养是辅助生殖技术中的关键性步骤，旨在获得高质量的胚胎^[5-7]；而在体外受精-胚胎移植技术实施过程中，经常需要运输或临时保存新鲜的卵母细胞或胚胎，细胞一旦活体开始原代培养，它的生物特性都将逐渐发生变化，需要及时冻存细胞，在有必要时再进行细胞复苏，以达到维持和保存细胞系的目的，因此低温冷冻保存已经成为人类辅助生殖技术(ART)中必不可少的一个环节^[8-9]。近年来，胚胎的体外培养及低温冷冻保存技术已经成为体外受精-胚胎移植领域研究的热点^[10-11]，本文报道2013年在泸州医学院附属医院生殖医学技术部进行体外受精-胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射的不孕患者131例的资料，在此基础上，结合本院的具体临床经验，重点讨论体外受精胚胎移植过程中卵母细胞采集、培养以及胚胎的低温保存技术的应用。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：病例回顾性分析。

时间及地点：2013年1月8日至12月10在泸州医学院附属医院生殖医学技术部完成。

对象：2013年1月8日至12月10在泸州医学院附属医院生殖医学技术部接受体外受精-胚胎移植或卵细胞浆内单精子注射(ICSI-ET)助孕的不孕患者131例，共147个取卵周期，124个移植周期，患者平均年龄31.32岁。不孕类型：盆腔及输卵管因素104例，占79.4%；子宫内膜异位症6例，占4.6%；排卵障碍26例，占19.8%；原因不明性不孕4例，占3.0%；男方梗阻性无精症4例，占3.0%；男方严重少弱畸精症19例，占14.5%。

患者纳入标准：①年龄≤40岁。②基础促卵泡生长激素5-15 U/L。③超声证实宫腔正常，子宫肌瘤或子宫腺肌症病灶直径≤3 cm，治疗前均进行了模拟移植。④患者对治疗均知情同意，并签署知情同意书。

患者排除标准：①年龄>40岁。②基础促卵泡生长激素> 15 U/L。③子宫肌瘤或子宫腺肌症病灶直径>3 cm，子宫内膜病变或先天性子宫发育异常。

147个取卵周期中131例为第1次助孕，16例为第2次助孕；移植1个胚胎的共10例患者10个移植周期，移植2个胚胎的共94例患者98个周期，移植3个胚胎的共15例患者16个周期；新鲜胚胎移植93例95个移植周期，冷冻胚胎移植28例患者29个移植周期。

方法：

取卵前临床检查：女方行常规体检和妇科检查、不孕症病因学相关检查、生殖内分泌检查、重要系统功能检查、感染性疾病或性传播性疾病检查、卵泡监测及性激素测定。男方行常规体格检查和男科检查、精液检查、生殖内分泌检查、染色体核型检查、健康检查及病原学检查。

促排卵方案：
方案	n	实施方法
标准长方案	131个取卵周期，占89.1%	于治疗周期前的黄体中期或口服避孕药 17 d时开始降调节，降调节14 d后达到降调标准即启动Gn(促性腺激素)
超长方案	4个取卵周期，占2.72%	应用促性腺激素释放激素激动剂 (GnRH-a，曲普瑞林)3.75 mg，28 d给药1次，连续3次，最后一次注射第20- 30天查血促卵泡生长激素、促黄体生成素、雌二醇，达Gn启动标准则开始Gn
超短方案	10个取卵周期，占6.8%	月经第2天GnRH-a 0.1 mg/d×3 d，月经第3天注射HMG或促卵泡生长激素3-5支至HCG日
自然周期方案	2个取卵周期，占1.36%	B超监测卵泡接近成熟时予以HCG (重组绒促性素)

体外受精及培养：取卵后三四个小时，将精子和卵子放在一起进行体外受精或进行单精子卵细胞浆内注射。从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密度的精子制备液。向卵子预培养皿中根据卵子的多少，按照每个卵子(3-5)×10⁴个精子的比例加入精子。将受精培养皿放回体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中继续培养4-9 h。动作尽量要快，以避免pH值及温度的改变。

胚胎质量评价标准：胚胎的卵裂球均匀、无碎片为Ⅰ级胚胎；Ⅱ级胚胎：胚胎的卵裂球均匀伴小碎片；Ⅲ级胚胎：胚胎的卵裂球不均匀、无碎片。

胚胎移植方法：经过48-72 h的培养，选择1-3个质量好的胚胎在B超监测下放入女方子宫内，剩余质量好的胚胎将予以冷冻保存备用。移植后14 d左右，检查尿或血HCG确定是否妊娠。

胚胎冷冻方法：培养72 h的卵裂期胚胎，根据女方年龄，<35岁的按2枚胚胎/管进行冷冻，≥35岁的3枚胚胎/管进行冷冻；采用日本加藤公司玻璃化冷冻试剂盒，冷冻试剂包括平衡液(Equilibration Solution，ES)、冷冻液(Vitrification Solution，VS)，取0.5 mL平衡液ES、冷冻液VS于Falcon 3037皿内24 ℃室温下平衡，将胚胎移入平衡液ES中5-20 min，然后移入冷冻液VS中，充分混匀后迅速将胚胎置于冷冻载体Cryotop顶端，并立刻投入液氮中，时间控制在60 s内。

胚胎解冻方法：采用日本加藤公司玻璃化解冻试剂盒，解冻试剂含有解冻液、稀释液、洗液1和洗液2；将0.5 mL解冻试剂取出在室温下平衡，并取解冻液TS于Falcon 3653皿中置于37 ℃预温，将要解冻患者的胚胎从液氮中取出，迅速将Cryotop顶端置于解冻液中1 min，然后在室温下依次将胚胎转入稀释液、洗液1、洗液2中3 min、5 min和5 min。最后将胚胎移入平衡过的培养液中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养2 h等待移植。

临床妊娠诊断标准：
指标	评价标准
植入率	着床胚胎总数/移植胚胎总数
妊娠率	妊娠数/移植周期数
流产率	流产数/妊娠数
临床妊娠率	临床妊娠例数/治疗周期数
多胎妊娠率	多胎妊娠例数/ 临床妊娠例数
生化妊娠率	仅血或尿HCG阳性而未达临床妊娠的例数/妊娠数

主要观察指标：临床妊娠率，胚胎植入率和多胎妊娠率等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

3.1 胚胎体外培养胚胎体外培养成功的关键在于胚胎接触微环境的控制，即人工环境的控制，培养环境、试剂以及耗材等。

3.1.1 卵母细胞采集体外受精胚胎移植过程中首先要进行卵母细胞采集，最常用的方法是卵巢超促排卵，以提高取卵成功率，以获得多个成熟高质量的卵母细胞。超促排卵常用药物包括克罗米酚，促性腺激素(GnRH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)。注射促性腺激素后可使其排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子，之后从卵巢取卵子，直接与获能的精子在体外受精，由于个体对这些药物的反应不同，因为卵巢刺激需要个性化处理。

取卵的方法常采用B超下用采卵针经阴道穿刺卵泡，去除卵泡洲，卵细胞在严格条件下置培养液中培养。也有超声波引导法，如借助超声波探头和屏幕的引导，从活体卵巢采集卵母细胞。

3.1.2 精子的制备及获能精子获能是指精子获得穿透卵子透明带的能力的过程。精子获能的方法有与血清白蛋白的溶液长时间孵育，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。同时在培养液中加入一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子获能。

3.1.3 胚胎培养方式取卵后三四小时，将精子和卵子放在一起进行体外受精或进行单精子卵细胞浆内注射。从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密度的精子制备液，按照(3-5)×10⁴个精子/每个卵子的比例加入精子，将受精培养皿放回体积分数5.0%CO₂、37 ℃培养箱中继续培养4-9 h。

体外培养的胚胎需在恒温的环境中生存，适宜的温度为35-37 ℃，适宜pH值为7.2-7.4，pH值低于6.8或高于7.6都可能对细胞造成伤害，要通过观察培养液的颜色及时更换新鲜培养液。

应用人工创造条件，对获取的早期胚胎进行体外培养，培养液的成分包括盐类，如无机盐和有机盐，营养物质包括氨基酸，苷酸，调节物质包括维生素和激素，特有物质，如动物血清。常用的培养方式包括悬滴培养法(盖玻片或凹载片)，微滴培养法(培养皿)，旋转管培养法(管状培养器皿)、灌注小室培养法(两个盖玻片或金属圈)、培养瓶培养法和培养板培养法。

目前应用较多的是培养板培养法，如四孔培养板和微滴培养板，四孔培养板为群体培养，即在每孔加入500 μL受精液和100-150枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子(1.0-1.5)×10⁹ L^-¹，在培养箱中孵育6-24 h。微滴法为单卵培养，是在塑料培养皿中用受精液做成20- 40 μL的微滴，上覆蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵母细胞10-20枚及获能处理的精子(1.0-1.5)×10⁹ L^-¹，在培养箱中孵育6-24 h。有研究认为群体培养有助于胚胎的发育，但也有研究认为多胚胎共同培养相互间作用会导致发育速度较单独培养缓慢。

经过48-72 h的培养，选择1-3个质量好的胚胎在B超监测下放入子宫内，剩余的质量好的胚胎将予以冷冻保存备用。

3.2 胚胎低温保存技术胚胎低温保存是将胚胎保存在-196 ℃液氮、-216 ℃液氮或-79 ℃干冰中做长期保存。储存在液氮中的细胞代谢活动停止，理论上可以做到无限期保存，是细胞冻存的理想方法，可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率。胚胎低温保存研究的历程见表4。

常用的冷冻方法有慢速冷冻法、超快速冷冻法(即玻璃化法)。慢速冷冻法也称程序冷冻法，但是此方法需要昂贵的仪器、耗时，并且对于囊胚冷冻效果差。玻璃化法冷冻法因简单、效率高、不需要昂贵仪器等优点应用较广泛。是近年来发展起来的一种新方法。玻璃化保存现在已经被广泛的应用，它的主要目的是最大限度的减少冰晶对细胞的损伤。当胚胎细胞被玻璃化冷冻保存的时候，通过用冷冻保护剂来防止冰晶的产生。

在低温保存胚胎过程中-5 ℃，-15 ℃是一个致死温度区，在这个温度区的细胞容易形成大的冰晶，目前认为冷冻过程中为了避免冰晶形成起关键性作用的是冷冻保护剂的种类及浓度以及载体的选择。

3.2.1 冷冻保护剂为了避免冰晶形成损伤细胞，向细胞培养液中加入甘油(GL)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、丙二醇(PROH)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)等冷冻保护剂后，由于他们对细胞无明显毒性，相对分子质量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点降低，提高细胞膜对水的通航性。在冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前秀出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内损伤。

甘油、乙二醇、丙三醇、丙二醇、二甲基亚砜、甲醇、丁二醇(butadiene, BD)等属于渗透性冷冻保护剂，其中常用的为是乙二醇和二甲基亚砜，普遍认为EFS溶液(乙二醇+F聚蔗糖)为最好的玻璃化冷冻保护剂。此类保护剂属于细胞内冷冻保护剂，为小分子物质，易与溶液中的水分子结合，在0 ℃以上易于穿透细胞，在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞内渗透出，减少了细胞内冰晶形成带来的细胞损伤。糖类为非渗透性冷冻保护剂，糖类如葡萄糖、果糖、山梨露醇、蔗糖、海藻糖和棉子糖，目前应用较多的为蔗糖。

研究发现单纯的甘油和乙二醇作为冷冻保护剂，其保护细胞的能力明显低于单纯的二甲基亚砜，相比较下，单纯用二甲基亚砜作为冷冻保护剂的细胞存活率可达到55%-60%。而混合冷冻保护剂的冷冻效果较单纯的应用甘油和乙二醇效果好。而不同的冷冻保护剂其适合的血清浓度各不相同。

最早使用的玻璃化液组成是，205 g/L DMSO，155 g/L乙酰胺、100 g/L丙二醇和60 g/L乙二醇，处理5-10 min，装管之后立即投入液氮^[17-19]，20%甘油+250 g/L丙二醇^[20-22]；体积分数40%乙醇+30%水溶性聚蔗糖+0.5 mol蔗糖(均使小鼠胚胎冷冻成功)^[20]。

本院常用到的试剂包括Quinn’s M-HTF (Sage 1023)，Quinn’s HSA 100 g/L(Sage 3001)，DMSO (Sigma D2650)，EG (Sigma E9129)，Sucrose (Sigma S1888)，Ficoll (M_W 400 000) (Sigma F1418)。基础液的配制包括A液：9.5 mL MHTF+0.5 mL HAS，B液：9.5 mL MHTF+3.4 g Sucrose+0.5 mL HAS，C液：9.5 mL MHTF+3.4 g Sucrose +0.5 mL HSA+0.1 g Ficoll。冷冻保护液的配制为孔1：A液，孔2：75 g/L DMSO+ 7.5%EG+ A液，孔3：150 g/L DMSO+15%EG+0.7 mol/L Sucrose+1%Ficoll+ A液。解冻液的配制为孔1：0.8 mL A液+0.4 mL B液，孔2：0.8 mL A液+0.2 mL B液，孔3：1 mL A液。

3.3.2 载体的选择玻璃化冷冻常用的载体包括麦管(Straw)、闭合式拉长塑料细管法(closed pulled straw, CPS)、开放拉长的塑料吸管法(open pulled straw，OPS)、开放式玻璃微细管法(glassmicropipette，GMP)、电子显微镜铜网法(electron microscopic grids，EMG)、冷冻环法(Cryo loop)以及微滴法(droplets)等。

1998年，Vajta等首次采用开放拉长的塑料吸管法进行进行细胞胚胎的玻璃化冷冻。OPS管来自冻精细管，将冻精细管拉制为原内径一半，利用毛细将胚胎和微量玻璃化吸入管后，直接投入液氮保存，与传统细管玻璃冷冻法相比，OPS在冷冻和解冻过程中的速度高十倍速，使细胞快速通过危险温区，减少冷冻损伤，操作简便，减少保护剂毒性，提高降温速率。开放式玻璃微细管法效果与开放拉长的塑料吸管法无明显差别，但毛细玻管可自行拉制，内径范畴远比OPS管宽，降低细胞胚胎的毒性。玻璃化冷冻法研究历程见表5。

小结：胚胎在超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂(cryoprolectant)处理，在逐步降温的情况下，于-196 ℃保存，一般来说，在-80 ℃以上时，细胞则逐渐失去活力，到-130 ℃以下，细胞内的水分是微细冰晶样或玻璃样结构，细胞内所有需要能量的反应停止，细胞的活动也几乎停止。玻璃化技术可明显减少细胞内冰晶的形成，最大限度的降低细胞损伤，但该技术尚不完善，卵细胞与卵巢组织的冷冻仍未达到令人满意的效果，很多问题还有待进一步的深入研究。