图2A为芯片的掩膜图，芯片中微通道的总长度为20 mm, 两侧的圆孔分别为进液孔和出液孔，直径均为3 mm，考虑到以后会进一步进行胚胎实验，作者设计了2种芯片：中间的圆孔用于放置胚胎，上图的中间圆孔直径为5 mm，下图则为2 mm，通道的宽度均为1 mm。输卵管峡部短而直，平均长度为2.0-3.0 cm，管腔最窄，直径0.1-1.0 cm^[15]，而本实验设计的仿真输卵管模型呈圆柱状，长度为2 cm，直径为1 cm，在形状上与体内输卵管的解剖学特征比较相符合。图2B为微流控芯片的实物图。将微流控芯片接入到控制系统中后，在计算机程序的控制下，液流能以缓慢的速度经入口进入芯片的微通道，再经出口流出，胚胎可在芯片通道中生长发育(图2C、D)。总的来说，此芯片在物理环境上实现了对输卵管的解剖学上的模拟。 
2.2  小鼠输卵管原代上皮细胞的培养、提纯和鉴定  经培养、提纯后的小鼠输卵管原代上皮细胞的鉴定结果为：细胞的角蛋白免疫荧光为阳性(图3)，其中被蓝色荧光Hoechest标记的为细胞核(图3A)，被绿色荧光AF488标记的为角蛋白KRT8(图3B)，融合后的合成图可见有角蛋白荧光的细胞比例> 90%(图3C)。角蛋白为上皮细胞特异表达的分子，为细胞内结构^[25]，细胞的角蛋白免疫荧光阳性表明此细胞为小鼠输卵管原代上皮细胞。小鼠的输卵管原代上皮细胞经提纯后比例在90%以上才可用于芯片上的细胞培养。由免疫荧光的结果可观察到：输卵管原代上皮细胞呈不规则多角形，细胞核圆且大。小鼠输卵管原代上皮细胞经过四五天的培养后，可铺满24孔板底。



2.3  微流控芯片中实现了输卵管生化环境和流体环境的模拟  将提纯后的小鼠输卵管原代上皮细胞调整到合适的细胞密度后，通过入口被通入微流控芯片中，在通入细胞后大约12 h后细胞逐渐开始贴壁，三四天可完全贴壁，培养至5- 7 d时细胞可铺满整个通道(图4A)。通过接入自动换液装置，每24 h可进行一次换液，换液前后细胞数目及生长状态无明显变化(图4B、C)，说明细胞贴壁较为牢固。被小鼠输卵管原代上皮细胞铺满的微通道和自动换液装置帮助微流控芯片实现了对输卵管生化环境和流体环境的模拟。

目前全球约有10%的夫妇深受不孕症的困扰，越来越多的患者希望通过辅助生殖技术来生育下一代。自1978年全球第一例“试管婴儿”路易斯•布朗诞生已有40余年，现今全球约有800万例试管婴儿诞生。辅助生殖技术一直是人们研究的重点，而受精和早期胚胎培养条件一直是限制辅助生殖技术发展的瓶颈。目前传统的辅助生殖技术主要采用微液滴法来完成胚胎培养的过程，即用玻璃管将受精后的胚胎转移至油封后的卵裂培养液液滴中培养至D3后，再将发育为卵裂期的胚胎转移至油封后的囊胚培养液液滴中继续培养直至D5-D6囊胚形成甚至孵化，然而这项胚胎培养技术自使用至今却基本没有更新过^[1-2]。这整个操作过程的主观性比较强，依赖于实验人员的技术，同时也极易受实验室的培养环境及条件的影响^[3]，在不同实验室，甚至同一实验室的不同实验人员的卵裂率以及成囊率都有所不同。此外，目前胚胎培养的方式使得胚胎的发育微环境处于相对静止，而体内胚胎发育则是处于动态环境中，静态微环境中例如氨基酸、葡萄糖等成分的代谢产物，也会对胚胎发育造成影响^[4-5]，这些缺陷有待进一步改善和解决。

微流控芯片又被称作芯片实验室，是将传统的化学技术和生物技术结合，并将所有基本操作单元微缩集成在一块芯片上以自动完成全过程的一项新技术^[6-7]，它在生物、化学、医学等领域都有巨大潜力，也广泛运用于包括体外受精、精子优化、胚胎培养、胚胎筛选以及胚胎冷冻等在内的辅助生殖技术的各个阶段^[8-12]。虽然近年来学者们相继在微流控芯片上实现了体外受精及胚胎培养的相关过程^[11-13]，但是，目前仍没有办法实现同体内类似的胚胎生存微环境。        输卵管是体内受精及早期胚胎培养的场所，其独特的环境为受精和早期胚胎发育提供了不可替代的条件^[14-16]。胚胎在输卵管壶腹部和峡部交界处完成受精过程后，在流动的输卵管液、摆动的输卵管上皮细胞纤毛、收缩的输卵管肌肉等的共同作用下移动至宫腔进行着床^[16-17]，另外，输卵管上皮细胞会分泌各种细胞因子辅助胚胎的发育^[18-20]，因此输卵管对胚胎的发育和着床过程非常重要。然而输卵管是腹腔内器官，由于其解剖位置和特殊的生化环境，目前缺乏合理的、有效的体外输卵管模型。此次研究拟将辅助生殖技术与微流控芯片相结合，在体外构建输卵管解剖特点和功能的模型，重现体内受精卵及早期胚胎发育环境，为进一步改善辅助生殖技术和提高受精率和优胚率奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  体外细胞水平实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1月至2019年1月在华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  采用6-8周龄的雌性C57/BL6小鼠，均购于湖北省实验动物研究中心，小鼠的饲养条件和方法都遵循标准流程：14 h光照10 h黑暗，不禁食不禁水。实验经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准，批准号为TJ-A20190201。

1.3.2  实验试剂  含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS(ThermoFisher，USA)，Ⅰ型胶原酶(Sigma-Aldrich， USA)，胎牛血清(四季青)，DMEM/F12(Bosterbio，China)，40 g/L的多聚甲醛(Servicebio，China)，PBS缓冲液(Servicebio，China)，0.5%Triton X-100(Servicebio，China)，体积分数10%山羊血清(Servicebio，China)，兔抗鼠KRT8多克隆一抗(ABclonal，China)，AF488标记的羊抗兔二抗(Thermo Fisher，USA)，Hoechest(Servicebio，China)，抗荧光淬灭剂(Servicebio，China)，fibronectin(Gibco，USA)。

1.3.3 实验耗材  70 μm细胞过滤器(Eppendorf, Germany)，60 mm培养皿(Eppendorf，Germany)，24孔板(Eppendorf，Germany)。

1.4  方法

1.4.1  小鼠输卵管原代上皮细胞的培养、纯化及鉴定  雌性C57/BL6小鼠在适应环境后3 d断颈处死。取出输卵管后，在体式显微镜下进行如下处理：将小鼠输卵管置于提前预热好的生理盐水中，剪去多余的组织并洗涤干净后，再转移至用含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS溶解的1 g/L的Ⅰ型胶原酶中，在体视显微镜下沿输卵管纵轴剪开、剪碎。将剪碎的组织放在 37 ℃恒温摇床上消化2 h后，用70 μm细胞过滤器进行过滤，将滤液转移至含有体积分数20%FBS的DMEM/F12的60 mm培养皿中，使用差速贴壁法进行纯化^[21-24]，在37 ℃培养箱中培养2 h后，吸取上清液转移至24孔板中，在24孔板中制作细胞爬片以进行鉴定，细胞铺满孔后取出爬片进行免疫荧光鉴定，其余的细胞继续培养。

角蛋白是上皮细胞的特异性蛋白^[25]，故实验采用角蛋白的免疫荧光来对小鼠的输卵管原代上皮细胞进行鉴定^[26]。待24孔板中的纯化后的小鼠原代输卵管上皮细胞铺满爬片后，取出爬片，用40 g/L的多聚甲醛在4 ℃下过夜固定，PBS冲洗3次后，加入0.5%Triton X-100在室温下通透20 min，再次用PBS冲洗3次后，加入体积分数10%山羊血清在37 ℃下封闭30 min，吸掉封闭液后，加入足量1︰100稀释后的兔抗鼠KRT8多克隆一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。用PBST冲洗3次后，加入AF488标记的羊抗兔二抗在37 ℃下孵育1 h，冲洗3次后加入Hoechest染核5 min，洗去多余的Hoechest后，用抗荧光淬灭剂进行封固后，在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.4.2  微流控芯片的设计及制备  此次实验所使用的微流控芯片均采用标准光刻法制作^[27]，见图1。制作方法如下：首先用负光刻胶SU-8TM在硅片上制作掩膜，将聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)和固化剂以配比   10︰1的质量比进行混合后，倒在掩膜上，去除气泡，铸型后在65 ℃温箱中加热。4 h后将固化的PDMS胶从掩膜上剥离，在PDMS上的3个圆孔上进行打孔用于液流进出和放置胚胎，为了避免液体流失并维持体系的稳定性，在中间的圆孔上方放置了一块小PDMS胶。再将整块胶放置于一块平的PDMS胶上，温箱中过夜黏合即可。

1.4.3  体外输卵管模型的构建  此次实现拟通过将鉴定纯化后的小鼠原代输卵管上皮细胞和微流控芯片结合在一起，实现体外输卵管模型的构建。由于PDMS是非极性材料，细胞无法直接在PDMS上贴壁生长，因此使用fibronectin对PDMS进行预处理以增加细胞黏附性^[28-29]。将制作好的芯片放在等离子清洗机中进行等离子处理，再向通道内注射体积分数75%乙醇，置于紫外灯下处理30 min以实现芯片内外消毒。用双蒸水清洗通道3次后，用100 mg/L的fibronectin过夜封闭芯片内通道，PBS冲洗通道3次后再用含体积分数20%FBS的DMEM/F12润洗通道3次，再将小鼠输卵管原代细胞的浓度调整至1×10⁹ L^-1，通入芯片中，在含体积分数5%CO₂的37 ℃培养箱中培养。每48 h将芯片接入自动换液装置进行换液，直至细胞完全铺满通道。

       该研究首次在微流控芯片中实现了对体内受精及早期胚胎发育环境的体外模拟，为进一步改善辅助生殖技术应用条件奠定了基础。目前，临床上关于早期胚胎培养主要方式有微液滴法^[1-2]，Time-lapse延时摄像胚胎观测技术等等^[30-31]，但是这些技术和应用都无法重现体内受精和胚胎发育环境。对于生育这一过程而言，胚胎受精及早期胚胎发育是其中极其关键的一部分，同时这决定了受精卵的分化和发展的方向^[32-34]。胚胎受精和早期发育的过程主要发生在体内输卵管的峡部。输卵管峡部在解剖学上短而直，这一段不仅物理环境简单^[15，35]，有稳定的液流供应^[20]，同时输卵管上皮细胞分泌的多种因子^{[14-19，36-37]}，均有利于受精和胚胎的早期发育。受精后的胚胎一边生长发育，一边在流动的输卵管液、摆动的输卵管上皮细胞纤毛、收缩的输卵管肌肉等的共同作用下移动至宫腔进行着床^[38-39]。因此，输卵管的存在对于胚胎生长发育而言，是不容忽视的^[40]。近年来学者逐渐开始在体外尝试体内环境的重建，但是输卵管峡部这一受精和早期胚胎发育环境的重要部位，却一直无法重现，原因可能在于微型环境的局限性，同时也可能是因为输卵管的原代上皮细胞较难获得，原代细胞也不能多次传代，因此输卵管模型的构建相对来说比传统的胚胎培养方法复杂。本研究突破了这一技术瓶颈，实现了体外模拟体内受精及早期胚胎发育环境。而且微流控芯片技术近年来的发展，为这一技术实现提供了可能性。微流控芯片凭借其微量性、集成性、自动性和良好的生物兼容性的特点，为构建模拟体内环境奠定了坚实的基础^{[41- 42]}。

该实验以微流控芯片为载体，将小鼠的原代输卵管上皮细胞种植在微流控芯片的微通道中，构建了模拟体内输卵管的仿真模型。输卵管峡部短而直，平均长度为2.0-3.0 cm，管腔最窄，直径0.1-1.0 cm，胚胎从受精卵到8细胞阶段再发育为囊胚的过程主要在此部位完成^[16]。此次实验设计的仿真输卵管模型呈圆柱状，长度为2 cm，直径为1 cm，在形状上与体内输卵管的解剖学特征比较相符合。此外，整个微通道中均被小鼠原代输卵管细胞所覆盖，有文献报道猪、牛、小鼠等哺乳动物的胚胎和输卵管组织共培养不仅可以缩短胚胎的发育时间，还能提高胚胎的卵裂率和成囊率^[43-46]，本模型为胚胎发育提供了模拟体内胚胎生长发育的微环境，有利于胚胎的发育。本模型尽可能还原了体内输卵管，实现了输卵管解剖和功能上的重建。

该模型的有效性作者将在后期进一步从胚胎培养的实际效果进行验证。总之，此次研究首次在体外实现对体内输卵管受精及早期胚胎发育的环境的模拟，为进一步改善辅助生殖技术发展提供较大的推动作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

输卵管：女性生殖系统的重要组成部分，体内受精及早期胚胎培养的场所，胚胎在输卵管壶腹部和峡部交界处完成受精过程后，在流动的输卵管液、摆动的输卵管上皮细胞纤毛、收缩的输卵管肌肉等的共同作用下移动至宫腔进行着床，另外输卵管上皮细胞会分泌各种细胞因子辅助胚胎的发育，对胚胎的发育和着床过程非常重要。

文章亮点：

1 临床上胚胎培养技术几十年来基本没有更新，而本研究将微流控芯片应用于辅助生殖技术，通过模拟体内受精及早期胚胎发育环境，实现了输卵管解剖学和生化环境的的重建，构建了以输卵管为模型的器官芯片，为进一步改善辅助生殖技术和提高受精率和优胚率奠定基础。

2 由于输卵管的解剖学特点目前缺乏有效的输卵管模型，本研究创新性的构建了一个基于微流控芯片模拟体内受精及早期胚胎发育环境的输卵管模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程