下肢缺血再灌注损伤模型大鼠接受依达拉奉干预后的超微结构变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (18): 2867-2871.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.014

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下肢缺血再灌注损伤模型大鼠接受依达拉奉干预后的超微结构变化

董素明¹，常文凯²，罗俊茜¹，薛佳杰¹，贾英伟²，梁炳生²

1山西医科大学，山西省太原市 030001；2山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001

收稿日期:2014-03-10 出版日期:2014-04-30 发布日期:2014-04-30
通讯作者: 常文凯，在读博士，副主任医师，硕士生导师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001
作者简介:董素明，男，1987年生，山西省晋中市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事肢体修复与功能重建的研究。
基金资助:
山西省社会发展科技攻关计划项目(20120313021-6)；课题名称：新型手术方式及麻醉技术在临床中的应用—依达拉奉灌注+术中临时供血治疗四肢超时限血管损伤的研究

Ultrastructural changes in a rat model of lower limb ischemia/reperfusion injury undergoing edaravone

Dong Su-ming¹, Chang Wen-kai², Luo Jun-qian¹, Xue Jia-jie¹, Jia Ying-wei², Liang Bing-sheng²

1Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Second Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2014-03-10 Online:2014-04-30 Published:2014-04-30
Contact: Chang Wen-kai, Studying for doctorate, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Second Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Dong Su-ming, Studying for master’s degree, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Social Development Science and Technology Project of Shanxi Province, No. 20120313021-6

摘要/Abstract

摘要：

背景：肢体缺血再灌注损伤中，氧自由基及细胞凋亡发挥重要的作用，通过抑制氧自由基生成及细胞凋亡，可减轻肢体缺血再灌注损伤。
目的：验证依达拉奉在大鼠肢体缺血再灌注损伤方面的应用及疗效。
方法：30只雌性SD大鼠，随机取20只，分别用自制气囊袖带环扎大鼠右后肢根部加压至40 kPa达到阻断血流，4 h后松解形成再灌注，制作肢体缺血再灌注损伤模型。造模成功后随机分为2组，依达拉奉灌注组于再灌注前5 min由左股静脉注射依达拉奉3 mg/kg，模型组及剩余10只(正常组)于相同时间点给予等量的生理盐水。于再灌注24 h，取每组大鼠右胫前肌，用透射电镜观察其超微结构变化，并采用RT-PCR对每组大鼠胫前肌中bcl-2 mRNA、bax mRNA进行半定量检测并计算bcl-2/bax比值。
结果与结论：①电镜结果显示：依达拉奉灌注组与模型组相比肌纤维较整齐，M线、Z线较清晰，线粒体肿胀减轻、其数量及嵴稍增多。②RT-PCR结果显示，缺血再灌注24 h后，右胫前肌bcl-2 mRNA的相对表达量以及bcl-2 mRNA与bax mRNA的比值：模型组显著低于依达拉奉灌注组(P < 0.05)，而bax mRNA的相对表达量模型组高于依达拉奉灌注组，且两组均高于正常组(P < 0.05)。结果提示自由基清除剂依达拉奉可能通过改善线粒体等超微结构及促进bcl-2 mRNA、抑制bax mRNA的表达来减轻肢体缺血再灌注损伤，这可为肢体缺血再灌注损伤的治疗提供新的选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 依达拉奉, 肢体, 缺血再灌注损伤, 细胞凋亡, bcl-2, bax, 氧自由基

Abstract:

BACKGROUND: The oxygen free radicals and apoptosis play an important role in limb ischemia/reperfusion injury, so we can alleviate limb ischemia/reperfusion injury by inhibiting the production of oxygen free radicals and apoptosis.
OBJECTIVE: To discuss the application and effect of edaravone on limb ischemia/reperfusion injury in rats.
METHODS: Of the 30 female Sprague-Dawley rats, 20 rats were randomly selected to make models of limb ischemia/reperfusion injury by ligating the root of right lower limb with a self-made balloon cuff at 40 kPa pressure to block blood flow for 4 hours and reperfusing. After success model establishment, they were randomly assigned to two groups. In the edaravone perfusion group, edaravone 3 mg/kg was injected via the left femoral vein at 5 minutes before reperfusion. In the model group and normal group (the remaining 10 rats), an equal volume of physiological saline was given at the same time point. At 24 hours after reperfusion, the right anterior tibial muscle of each group was removed and these ultrastructural changes were observed by transmission electron microscope. Bcl-2 mRNA and Bax mRNA of rat anterior tibial muscle of each group were semiquantitatively detected with the RT-PCR and the ratio of bcl-2/bax was calculated.
RESULTS AND CONCLUSION: (1)Electron microscope results: compared with the model group, the muscle fibers were neater; the M line and the N line were clearer; the swelling of mitochondria was alleviated; the numbers of mitochondria and mitochondrial crista were also increased in the edaravone perfusion group. (2)RT-PCR results: At 24 hours after reperfusion, the relative expression of bcl-2 mRNA and the ratio of bcl-2 mRNA to bax mRNA in right anterior tibial muscle were lower in the model group compared with the edaravone perfusion group (P < 0.05). However, relative expression of bax mRNA was greater in the model group than that in the edaravone perfusion group, which were both higher than the normal group (P < 0.05). Results indicated that the free radical scavenger edaravone relieved limb ischemia/reperfusion injury by improving the mitochondrial ultrastructure and promoting expression of bcl-2 mRNA and inhibiting expression of bax mRNA, and could provide a new choice for the treatment of limb ischemia/reperfusion injury.

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Key words: reperfusion injury, lower extremity, free radical scavengers, cell death

中图分类号:

R318

董素明，常文凯，罗俊茜，薛佳杰，贾英伟，梁炳生. 下肢缺血再灌注损伤模型大鼠接受依达拉奉干预后的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2867-2871.

Dong Su-ming, Chang Wen-kai, Luo Jun-qian, Xue Jia-jie, Jia Ying-wei, Liang Bing-sheng. Ultrastructural changes in a rat model of lower limb ischemia/reperfusion injury undergoing edaravone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2867-2871.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

随着工业化进程发展，高能量交通伤及工矿企业机器伤呈增高趋势^[1]，肢体血管损伤患者日渐增多，对个人与社会造成巨大的损害，如何尽早恢复血供，降低组织缺血的损伤成为创伤外科和显微外科积极探讨的热点话题。当前，显微外科器械、缝合材料及血管吻合技术日趋成熟，与之相比，肢体缺血再灌注损伤引起的二次伤害成为影响血管损伤患者预后的主要因素之一。

肢体缺血再灌注损伤是指部分肢体缺血再灌注后，肢体功能、代谢障碍及结构破坏不仅没有恢复，反而进一步加重的病理过程^[2]，常见于断肢再植、骨筋膜室综合症、四肢血管损伤等骨科疾病。肢体缺血再灌注损伤可能与氧自由基、钙超载、中性粒细胞、一氧化氮、微循环、能量代谢及细胞凋亡等因素相关^[3-4]，但具体机制尚未阐明^[5]。肢体缺血再灌注损伤作为一种多因素、多机制参与的复杂病理过程，若处理不当，常面临截肢风险，甚至引起全身炎症反应综合征影响远端器官，引起多器官功能障碍综合征危及生命^[6]。因而对其进行进一步研究尤为重要，当然，从其发病机制的各个环节进行干预无疑是理想的方法，然而，在其治疗方面目前临床上尚没有特定的药物^[7]。

研究表明：自由基清除剂可通过多种途径减轻缺血再灌注损伤^[8]。自由基清除剂依达拉奉用于脑梗死患者的治疗并取得良好疗效。依达拉奉作为一种自由基清除剂，2001年日本政府首先批准用于脑梗死患者，13年临床经验证实：其疗效确切；实验研究亦证实：在心肌、肺、肠、肝、胰腺和肾损伤等模型中^[7^，^9-10]，依达拉奉可能通过清除羟自由基抑制自由基生成与脂质过氧化反应、增强超氧化物歧化酶活性以维持线粒体结构及氧化磷酸化，进而促进骨骼肌ATP合成能力的恢复；通过抑制胞内钙超载及内质网应激随后的凋亡通路^[11]、促进线粒体通透性转换孔开放等途径对炎症过程、基质金属蛋白酶水平、一氧化氮的产生、细胞凋亡、细胞坏死等方面发挥调节作用，从而减轻缺血再灌注损伤^[12-14]。

故本实验通过对大鼠下肢缺血再灌注损伤模型的构建及处理，探讨依达拉奉在肢体缺血再灌注损伤方面的影响，为今后治疗肢体缺血再灌注损伤提供参考。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年1月在山西医科大学生物医学研究工程中心实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级健康雌性SD大鼠30只，体质量(230±30) g，由山西医科大学生理教研室提供，许可证号：SCXK(京)2009-0017。

实验药物：①依达拉奉注射液(昆明积大制药有限公司，生产批号：120320)；临时用0.9%氯化钠配置。②戊巴比妥钠(Biotopped公司)。

主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Trizol试剂	上海生工生物工程有限公司
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	MBI Fermentas公司
FastStart Universal SYBR Green Master	Roche公司
实时荧光定量PCR(RT-PCR) 仪	西安天隆科技有限公司
TGL-16 高速台式冷冻离心机	湖南长沙湘仪检测设备有限公司
JY96-II N 型超声细胞粉碎机	宁波新芝生物科技股份有限公司
JEM-1200EX透射电子显微镜	山西医科大学电镜室提供
XJ11D台式血压计	上海医疗器械股份有限公司

FQ-PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司设计：
基因	引物序列	扩增长度
β-actin	上游：5'GTC AGG TCA TCA CTA TCG GCA AT3' 下游：5'AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CGT3'	147 bp
Bcl-2	上游：5'GGG ATG CCT TTG TGG AAC TA3' 下游：5'CTC ACT TGT GGC CCA GGT AT3'	138 bp
Bax	上游：5'TGC AGA GGA TGA TTG CTG AC3' 下游：5'GAT CAG CTC GGG CAC TTT AG3'	173 bp

方法：

动物模型的制作及分组：自制气囊袖带制备大鼠右下肢缺血再灌注损伤模型^[15-16]。健康雌性SD大鼠30只，随机分为3组，每组10只。实验前12 h禁食，20 g/L戊巴比妥钠(首次剂量30 mg/kg，必要时追加10 mg/kg)腹腔麻醉。①正常组：麻醉后，用自制气囊袖带环绕结扎大鼠右后肢根部，采用三通管将袖带与血压计连接，袖带不加压。②缺血再灌注损伤模型组：用自制气囊袖带环绕结扎大鼠右后肢根部，采用三通管将气囊止血带与人体血压计连接，袖带加压至40 kPa，阻断血流4 h后松解，恢复血流灌注。③依达拉奉灌注组：造模与模型组相同，于再灌注前5 min经左股静脉注射依达拉奉3 mg/kg^[8]。以上各组均于再灌注24 h，分别取材，完成下述形态学及分子学指标观察。

电镜观察大鼠肌丝肌节形态和超微结构变化：再灌注24 h，切取1 mm×1 mm×1 mm右胫前肌3-5块，25 g/L戊二醛和10 g/L锇酸固定，常规洗涤、脱水、浸透、包埋、切片后，行醋酸铀和硝酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察各组大鼠肌丝肌节形态、线粒体数量、形态、肿胀程度等超微结构变化。

bcl-2 mRNA、bax mRNA测定：再灌注24 h，取部分右胫前肌-80 ℃保存。测定方法：RT-PCR。①Trizol法抽提右胫前肌总RNA。②反转录反应。反应体系20 μL：11 μL RNA (1 μg)、1 μL random hexamer primer(0.2 mg/L)、4 μL 5×Buffe、2 μL dNTP(10 mmol/L)、1 μL RNase Inhibitor (20 U/μL)、1 μL M-MuLV(200 U/μL)；反应条件：25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，72 ℃孵育15 min。③real-time PCR反应。反应体系20 μL：FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 10 μL，0.5 μL forward primer (15 μmol/L)，0.5 μL reverse primer(15 μmol/L)，cDNA 2 μL，无DNAse和RNAse的水7 μL。反应条件：94 ℃预变性 10 min，活化Taq酶；94 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，40个循环。选择荧光阈值为0.1，软件分析融解曲线和扩增曲线并记录Ct值，用2^-^ΔΔ^CT来计算各组标本bcl-2和bax基因的相对表达，并计算其比值^[17]。

主要观察指标：①大鼠肌丝肌节形态和超微结构变化。②RT-PCR检测大鼠缺血再灌注后右胫前肌bcl-2 mRNA、bax mRNA相对表达结果。

统计学分析：用SPSS 13.0软件进行数据处理，计量资料用x(_)±s表示。采用单因素方差分析和LSD法进行各组比较及组间比较，检验水准取α=0.05，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

目前，实验动物科学因其诸多优点已成为科学研究的重要手段，动物模型的制备显得十分重要，例如，大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的制备方法较多，具体包括：①止血带模型：将橡皮圈环扎于大鼠肢体根部^[15]，阻断血流，该法操作简便，但易由于人为因素引起各样本缺血程度不同。②改良止血带模型：麻妥后，游离股动静脉或髂总动脉或腹主动脉并用血管夹夹闭，橡皮筋阻断侧支循环^[18]；或使用活结技术结扎腹主动脉、右髂总动脉、右股动脉，并环扎肢体阻断侧支循环^[19]。本法操作过程复杂，时间长，易导致感染。③分离某块肢体肌肉或肌皮瓣(保留或不保留血管神经束)，或血管神经束与活体相连，此方法主要用于肢体功能重建。④不破坏表面微血管的基础上，分离暴露某条肌腱，观察缺血再灌注后的微循环变化。⑤Crawford RS巧妙利用McGiveny痔结扎器扣环、张力计以及口腔正畸橡皮圈制备小鼠下肢缺血模型并获得成功^[20]。作者参照止血带模型，将人体血压计与自制气囊袖带巧妙连接，降低了因压力不同导致实验样本缺血程度的差异，此法方便简单，经济适用，值得推广。

细胞凋亡是缺血再灌注损伤的发生机制之一，近年来受到广泛关注^[21-22]。细胞凋亡又称之为细胞程序性死亡，是指机体在自身基因控制下的自主有序的死亡，涉及一系列复杂的基因激活、表达与调控。研究表明：bcl-2家族在细胞凋亡的调控过程中作用很大，该家族成员包括抗细胞凋亡基因与促细胞凋亡基因，bcl-2是抗细胞凋亡基因的代表，其编码的蛋白主要位于线粒体外膜、内质网等部位，通过抑制促凋亡成员而发挥作用^[23]；bax是促细胞凋亡的代表，可允许细胞色素C等小分子穿过线粒体膜^[24]，进入细胞质而引起细胞凋亡^[25]；bcl-2 mRNA与bax mRNA两者表达水平的高低及其比值对细胞存活或凋亡影响较大，bcl-2/bax较低时细胞易凋亡，bcl-2/bax较高时细胞易存活^[26]。

依达拉奉作为一种脑保护剂，其清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤等功能已经得到临床印证。然而，依达拉奉在肢体缺血再灌注损伤方面的研究，尤其在细胞凋亡方面的研究相对较少，故本实验通过构建肢体缺血再灌注损伤模型，采用RT-PCR对各组大鼠右胫前肌细胞中凋亡因子bcl-2与bax mRNA 的表达进行检测，以期探讨肢体缺血再灌注损伤模型中，依达拉奉在细胞凋亡方面的保护作用。

实验电镜结果显示：依达拉奉灌注组大鼠肢体缺血再灌注损伤后肌纤维排列整齐度，M线、Z线清晰度，线粒体数量、嵴致密度、膜完整度及其肿胀程度较缺血再灌注损伤模型组有所好转^[27-28]；结果表明：依达拉奉在肢体缺血再灌注损伤过程中可能通过对线粒体等超微结构的保护以及减轻二次水肿等途径而发挥保护作用^[29]。同样，RT-PCR结果显示：缺血再灌注损伤模型组与依达拉奉灌注组bcl-2 mRNA的相对表达量以及bcl-2 mRNA与bax mRNA的比值均低于正常组(P < 0.05)，bax mRNA的相对表达量均高于正常组(P < 0.05)；依达拉奉灌注组与模型组相比：bcl-2 mRNA的相对表达量以及bcl-2 mRNA与bax mRNA的比值较高(P < 0.05)，bax mRNA的相对表达量较低(P < 0.05)；结果表明：依达拉奉在肢体缺血再灌注损伤过程中，可能通过抑制bcl-2 mRNA表达，促进bax mRNA的表达而发挥保护作用^[30-31]。

结论：实验运用人体血压计与自制气囊袖带成功构建大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，不仅操作简单、经济实用，而且降低了因压力不同导致样本缺血程度的差异。通过RT-PCR对各组大鼠胫前肌凋亡基因bcl-2 mRNA与bax mRNA进行半定量检测表明，自由基清除剂依达拉奉可能通过改善线粒体等超微结构及促进bcl-2 mRNA表达、抑制bax mRNA的表达来减轻肢体缺血再灌注损伤，这可为肢体缺血再灌注损伤的治疗提供新的选择。

下肢缺血再灌注损伤模型大鼠接受依达拉奉干预后的超微结构变化

Ultrastructural changes in a rat model of lower limb ischemia/reperfusion injury undergoing edaravone

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