低温快速成型亲水改性复合人工骨支架的性能测定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1824-1830.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.004

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低温快速成型亲水改性复合人工骨支架的性能测定

何美健^{1, 2}，王大平^{1, 2, 3}，黄江鸿^{1, 2, 3}，张明⁴

1安徽医科大学深圳二院临床学院，广东省深圳市 518035
2深圳市第二人民医院骨科，广东省深圳市 518035
3深圳市组织工程重点实验室，广东省深圳市 518035
4中科院深圳先进技术研究院，广东省深圳市 518035

修回日期:2014-02-08 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 王大平，教授，主任医师，硕士生导师，深圳市第二人民医院骨科，广东省深圳市 518035
作者简介:何美健，男，1990年生，安徽省芜湖市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，医师，主要从事创伤骨科、骨组织工程研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(S2012010008129)；深圳市科技资金研发项目(CXZZ2012061416023484)；深圳市重点实验室提升项目(CXB201104220049A)

Preparation and properties of hydrophilic modified artificial bone scaffold using low-temperature rapid prototyping

He Mei-jian^{1, 2}, Wang Da-ping^{1, 2, 3}, Huang Jiang-hong^{1, 2, 3}, Zhang Ming⁴

1Shenzhen Second Hospital Clinical School of Anhui Medical University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
2Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
3Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
4Shenzhen Institutes of Advanced Technology Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

Revised:2014-02-08 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Wang Da-ping, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Shenzhen Second Hospital Clinical School of Anhui Medical University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
About author:He Mei-jian, Studying for master’s degree, Physician, Shenzhen Second Hospital Clinical School of Anhui Medical University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010008129; the Scientific Research and Development Program of Shenzhen City, No. CXZZ2012061416023484; Enhancement Projects for Shenzhen Key Laboratories, No. CXB201104220049A

摘要/Abstract

摘要：

背景：低温快速成型技术具有支架成型可控性、保持材料生物学活性和易于实现支架材料的三维多孔立体结构等优势，被迅速用于骨组织工程支架的制备。
目的：采用低温快速成型制备聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架，并检测其性能。
方法：采用低温快速成型设备分别制备聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架，通过电镜观察支架超微结构，以介质(乙醇)浸泡法测定支架孔隙率，采用电子试验机检测支架力学性能；将两种支架材料分别与大鼠成骨细胞共培养，培养12 h采用沉淀法检测细胞黏附率，培养1，3，5，7，9，12 d采用CCK-8法检测细胞增殖。
结果与结论：两组支架孔径均在理想范围内并具有较高孔隙率，但聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的孔径波动范围大，孔径均值较聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架小且部分有闭塞现象。聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的细胞黏附率及表面细胞增殖活性高于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架(P < 0.05)，力学性能低于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架(P < 0.05)。表明聚乙二醇改性聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 低温快速成型, 聚乳酸-乙醇酸, 聚乙二醇, 纳米羟基磷灰石, 骨组织工程, 复合支架, 骨缺损, 亲水改性, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Low-temperature rapid prototyping technology is a new kind of rapid prototyping technology, and it is rapidly used in the preparation of bone tissue engineering scaffolds because it can make scaffold forming controllable and can keep the biological activity of the materials, also can easily realize the scaffold with porous of three-dimensional structure and other advantages.
OBJECTIVE: To investigate the preparation process of polyethylene glycol-modified polylactic acid-glycolic acid/nano-hydroxyapatite (PLGA-PEG/n-HA) using the low-temperature rapid prototyping, and to test its performance.
METHODS: PLGA-PEG/n-HA and PLGA/n-HA were prepared by low-temperature rapid prototyping equipment. Under an electron microscopy, we observed ultra-structure of the scaffolds. Immersion (ethanol) method was used to test the porosity, and electronic testing machine was used to determine the material mechanical properties. Then these two kinds of scaffolds with rat osteoblasts were cultured in vitro, the cell adhesion rate was detected by precipitation method after 12 hours, and cell counting kit-8 method was used to determine the cell proliferation at culture days 1, 3, 5, 7, 9, 12.
RESULTS AND CONCLUSION: Both of the two scaffolds had ideal aperture range and high porosity. But the aperture range of PLGA-PEG/n-HA scaffolds had large fluctuations, and the average aperture was smaller than that of PLGA/n-HA. Some pores were closed up. The cell adhesion rate and the cell growth curve of PLGA-PEG/n-HA was better than that of PLGA/n-HA (P < 0.05), but the mechanical properties were less than PLGA/n-HA (P < 0.05). The results showed the PLGA-PEG/n-HA scaffolds had good cell compatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: tissue engineering, hypothermia, polyethylene glycols, durapatite

中图分类号:

R318

何美健，王大平，黄江鸿，张明. 低温快速成型亲水改性复合人工骨支架的性能测定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1824-1830.

He Mei-jian, Wang Da-ping, Huang Jiang-hong, Zhang Ming . Preparation and properties of hydrophilic modified artificial bone scaffold using low-temperature rapid prototyping[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1824-1830.

图/表（结果） 2

2.1 大体观察 基于低温快速成型技术制备的亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架均成三维立方体状，肉眼可见材料密布呈网格状规则孔径，见图2。

2.2 电镜扫描 电镜下见聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架纵向面、横断面密布类圆形或椭圆性大孔结构，部分孔径闭塞，孔壁宽度分布不均；聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架材料大孔结构成类正方形，孔壁宽度分布较均匀，表面较聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架光滑、较少刻痕；聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架大孔径均值为(412.0±74.3) µm，聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架孔径为(430.0±20.5) µm，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3 材料孔隙率 聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架组6份样本孔隙率分别为81.7%，80.2%，83.6%，85.5%，83.7%及82.9%，平均为82.9%；聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架组6份样本孔隙率分别为88.9%，90.5%，89.3%，91.7%，89.4%及90.6%，平均为90.1%。两组支架细胞孔隙率比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 支架的力学性能检测结果 弹性模量和抗压强度是反应支架力学性能最常用的指标^[15]。聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架和聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架弹性模量分别为(19.20±2.65) MPa和(28.70±2.40) MPa，抗压强度分别是(0.82±0.17) MPa和(1.19±0.03) MPa，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，可认为亲水改性后支架力学性能下降(图4)。

2.5 细胞黏附率 复合培养12 h，聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架组细胞黏附率(71.70±1.21)%明显高于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的(63.30± 1.23)%，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 细胞增殖活性检测 接种的第1天内主要是细胞黏附及适应期，实验组吸光度A值显示要高于对照组，提示亲水改性后支架黏附的细胞基数提高；接种第3-7天，生长曲线基本成线性，细胞处于快速增殖期；接种7 d后，细胞增殖速率明显减慢，处于平台期。两组细胞增殖差异有显著性意义(P < 0.05，图5)。

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引言

创伤或肿瘤、感染病灶切除后造成的大面积骨缺损修复问题，是临床上长期面临的难题。因自体骨移植骨量缺乏、同种异体骨移植需考虑供体情况且存在某些传染病传播的可能，以及异种骨移植后免疫排斥反应问题等，人工骨组织工程研究已成为近几十年来的热点之一^[1]，但目前尚未能制造出一种理想的人工骨支架作为骨移植替代材料。

聚乳酸-乙醇酸和纳米羟基磷灰石是研究最多、最常被用于制备骨组织工程支架的材料。聚乳酸-乙醇酸是聚乳酸与聚羟基乙酸熔融共聚而成的高分子聚酯类材料，其在人体最终代谢产物为水和二氧化碳，具有良好的生物相容性，亦具有良好的可降解吸收性^[2]；其在临床上已被应用于骨折内固定材料(可吸收螺钉)、手术缝合线及药物控释载体^[3-4]，并取得一定的治疗效果。但在长期实验和临床应用中，发现单纯聚乳酸-乙醇酸材料存在高温易分解、力学性能欠佳及分子链缺乏活性基团、材料亲水性差等缺点^[5]。纳米羟基磷灰石是人体骨组织、牙齿的主要无机物成分，具有良好的力学性能及生物相容性，但其降解性能较差，因而学者们常常将其与聚乳酸-乙醇酸复合，综合两种材料的优点，制备具有良好力学性能及降解性的聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石复合人工骨支架^[6]。聚乙二醇可溶于水及多种有机溶剂，对人体无不良反应，无抗原性及免疫原性并具有良好亲水活性、保湿性与生物相容性，常被用于药物片剂薄膜衣、医用软膏基质、滴眼液与注射剂。将聚乙二醇引入聚乳酸-乙醇酸分子链间可为其疏水性分子提供非离子表面活性基团，增加聚乳酸-乙醇酸材料亲水性。国内外有关聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇材料的报道多集中在药物控释载体研究方面^[7]。亦有学者分别将聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇及聚乳酸-乙醇酸作为组织工程支架与大鼠骨髓间充质干细胞复合体外培养，结果显示聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇组支架细胞较聚乳酸-乙醇酸组明显增多，聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇具有更好的细胞相容性^[8]。因而将聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇与纳米羟基磷灰石复合理论上可提高聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架亲水性，提升支架的细胞相容性。

此外，为满足临床人工骨组织工程支架的要求，除需合适的材料外，其成型工艺或制备技术也显得尤为重要。快速成型技术自20世纪80年代后期诞生以来，如熔融沉积制造、选择性激光烧结、三维印刷等，因它们制备支架迅速，具有可实现支架商品化潜质及支架三维结构等优势，愈来愈受广大学者们的青睐和重视^[9]。而低温快速成型(又称低温沉积制造)作为结合相分离法的一种新型快速成型技术，也因操作简便，设备维护及运行成本较低，具有支架成型可控性、可保持材料生物学活性和易于实现支架材料的三维多孔立体结构等优势，被迅速用于骨组织工程支架的制备^[10]。

实验利用低温快速成型技术制备引入亲水基团的聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇与纳米羟基磷灰石复合人工骨支架，并进行表征，期待制备的新型聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架在保持生物学活性的同时，具备良好的三维多孔立体结构和细胞相容性，为种子细胞增殖及功能表达提供良好的生物学支撑，亦旨在为其作为骨缺损修复材料可行性提供伦理和实验支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察实验。

时间及地点：于2013年3至11月在中科院深圳研究院和深圳市第二人民医院组织工程重点实验室完成。

材料：

实验动物：新生1 d内的SD大鼠6只，由北京大学深圳医院动物实验中心提供。

实验方法：

聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架材料的制备^[11]：首先在低温沉积制造系统Tissue FormⅡ系统(图1A)中通过计算机Cark软件设计支架三维模型，对模型进行离散，获得二维层面信息及喷头运动轨迹数据并以NET文件格式存储及输出；其次将一定质量的纳米羟基磷灰石粉末、聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇放入干燥烧杯中(纳米羟基磷灰石与聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇的质量比为2∶8)，加入一定量的1，4-二氧六环溶剂，于磁力搅拌器上充分混合搅拌约6 h，制备成均质浆料并将其加入低温沉积制造系统Tissue FormⅡ储料罐内。设置低温成型参数(成型室温度-20 ℃，喷头直径0.3 mm，温控喷头温度为17 ℃，喷头运动速度15.0 mm/s，匀浆挤出速率1.80 mm/s，细丝间距离d值=1 mm)，计算机NET文件驱动下喷头进行扫描运动并挤出匀浆细丝，实现二维层面的打印，通过二维层面的叠加形成三维形状支架(图1B)；将成型平台中的聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架放置于系统冷冻干燥机干燥48 h，使溶剂1,4-二氧六环升华，最终得到室温环境下的多孔支架。同样方法制备聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架材料。

支架材料的净化消毒：体积分数95%乙醇浸泡24 h，去除残余溶剂，等离子纯水清洗，低温烘干，环氧乙烷消毒封闭备用。

支架的电镜观察：负压抽气处理后，分别取聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架(n=6)与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架(n=6)横断面及纵向面，扫描电镜下将支架截面平均划分成4个象限，随机取一象限扫描视野，测量5个完整边缘的孔径大小。

孔隙率的测定：采用介质(乙醇)浸泡法测定。测量聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架或聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架干燥支架的总体积(V)，用电子

天平测量干燥支架在空气中的质量m₁，将支架完全浸入乙醇中，采用循环抽真空使乙醇完全填满孔隙。充分饱和后取出支架，用滤纸轻微吸干表面乙醇，电子天平称出此时支架在空气中的总质量m₂，用以下公式计算孔隙率：θ=(m₂- m₁)/ρ_乙醇V。

力学性能测定：使用三思电子万能试验机CTM4000测定聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架的弹性模量及抗压强度。测试支架的尺寸为50 mm×10 mm×50 mm，试验机加载负荷量为1 000 N，加载速度5 mm/min，测试样本量n=6。

大鼠成骨细胞的分离培养：采用酶消化法提取成骨细胞^[12]。取出生1 d内胎鼠3只，乙醚吸入麻醉后，夹颈法处死并于体积分数75%乙醇中浸泡消毒；然后取出在超净工作台中，用无菌剪刀剪开头部皮肤，暴露头盖骨并环形剪下；于含10%双抗(青霉素及链霉素)的PBS中，仔细分离剔除黏附的脑组织、结缔组织及血液；清洗数次后，用无菌剪刀将头盖骨剪成泥状，加入5 mL 0.25%胰酶，在37 ℃水浴锅内消化30 min，静置约5 min后吸管吸除含成纤维细胞的消化液；PBS清洗1次，加入5 mLⅠ型胶原酶，37 ℃水浴振荡消化30 min；消化结束后于1 000 r/min离心5 min (离心半径150 mm)，弃上清，用α-DMEM培养基清洗离心，最后用成骨细胞培养液(含体积分数10%胎牛血清及10%双抗的α-DMEM培养基)轻轻吹打，制出细胞悬液，静置 5 min待剩余泥状骨片沉淀后，将细胞悬液移入细胞培养瓶中。向沉淀骨片在加入5 mLⅠ型胶原酶，37 ℃水浴消化30 min，循环以上步骤，收集细胞悬液。将收集的细胞悬液于成骨培养基中吹打均匀以1×10⁹ L^-¹浓度接种于细胞培养瓶，然后放置37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养。

成骨细胞的纯化及传代：利用成骨细胞与成纤维细胞贴壁时间差纯化细胞^[13]。原代培养的成骨细胞达80%融合时，按1∶2比例用胰酶消化传代。于原代细胞培养瓶中加入适量0.25%胰酶消化约5 min，显微镜下观察，当细胞变圆、大部分细胞脱落时终止消化；吸弃上清液，加入适量成骨培养液，轻轻吹打混匀，将制成的细胞悬液加入新的细胞培养瓶中于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中5-10 min，然后轻轻吸取上清液，移至另一培养瓶中，再次放入培养箱中培养5-10 min，如此反复3次转瓶，基本去除成纤维细胞；纯化成骨细胞每2 d更换培养基，当细胞融合达80%时胰酶消化传代。

细胞黏附率的测定：采用沉淀法检测细胞黏附率^[14]。取3代纯化成骨细胞，将细胞浓度调整为1×10⁹ L^-¹；取大小约10 mm×10 mm×0.5 mm 聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架与聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架材料膜各6块，将细胞悬液0.5 mL滴加于材料上，放入 37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中复合培养12 h，PBS清洗去除未黏附细胞。然后每孔加入胰酶消化，收集细胞并用血球计数细胞数。支架上细胞的黏附率计算公式是：黏附率=黏附细胞数/原细胞总数。

细胞增殖活性检测：采用CCK-8法，实验分为两组：实验组(聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架)与对照组(聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架)，于24孔板内进行支架与第3代纯化成骨细胞的复合培养，每组6个复孔，细胞接种浓度为1×10⁹ L^-¹，接种体积0.5 mL，加入成骨细胞培养液使每孔液体量相等并在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养，隔2 d换液。分别在细胞培养的第1，3，5，7，9，12天，在每孔加入CCK-8溶液50 µL后从新放入培养箱培养4 h，将各孔液体转移至96孔板中并保持每孔内液体量一致，酶标仪于490 nm波长测吸光度A值。

主要观察指标：聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架材料的大体形态及电镜下孔径；成骨细胞在改性材料表面的黏附率及增殖曲线。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量数据用x(_)±s表示，材料的孔径、孔隙率、力学性能及黏附率比较采用t 检验，细胞增殖活性的吸光度比较采用单因素方差分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

3.1 低温快速成型技术与骨组织工程支架制备 由创伤、肿瘤及感染等造成的骨缺损常常是大范围不规则形状的，这就需要制备的人工骨支架具有特殊的三维立体结构。传统骨组织工程支架工艺(如静电纺丝法、固液相分离法、溶盐法等)是基于材料分离、加工原理的技术，其操作步骤较复杂，需要模具或裁剪才能获取三维立体结构，因而常常

造成型支架三维立体结构精度欠佳^[16]。低温快速成型技术作为一种新型快速成型技术，结合了计算机辅助技术、数控技术、新材料制造技术及相分离技术等，可精确、快速将三维扫描图像或设计图形转化为实体零件。余东等^[17]利用低温快速成型技术准确制备出具有与山羊标准颅骨相同弯曲弧度的三维贴敷人工骨支架。低温快速成型制备三维立体结构支架具体原理如下：在计算机辅助下，将影像学扫描(如CT、MRI等)获取骨缺损部位的三维立体模型或事先设计模型并离散成多个层面二维结构，得到喷头扫描路径；在低温成型平台上先成型出二维结构层面，在通过各个二维结构层面的叠加准确形成具有特殊结构的三维形状^[18]。成型过程中可通过控制喷头挤出或喷射浆液细丝的长度调控成型支架的外形，通过控制喷头在X、Y平面扫描的层数(N值)及成型平台于Y轴方向下降高度(Z值)调控成型支架厚度。此外，低温快速成型可避免传统快速成型(如熔融沉积制造、选择性激光烧结)过程中热相变过程^[19]，即成型过程的低温环境不破坏材料的化学成分，可保证支架材料生物学活性。

实验通过计算机事先将复合人工骨支架模型设计为立方体，结果显示基于低温快速成型技术制备的两种支架均成三维立方体状，因而成型精度较高。聚乳酸-乙醇酸及聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇在高温环境下均易分解，低温快速成型技术良好保证了材料的生物学活性。实验制备的是单纯复合人工骨支架，并未加入骨诱导生长因子(如骨形态形成蛋白)，而低温快速成型技术使支架成型过程中加入此类热敏感生长因子成为可能，从而具有直接成型活性组织工程骨支架的潜力。

3.2 支架孔径、孔隙率及力学性能 目前对理想骨支架材料的孔径要求尚未有定论，多数学者认为孔径在 200-500 μm最适合种子细胞黏附及骨组织形成^[20-22]；而孔隙率越高则细胞相容性越好，更利于细胞长入支架内部^[23]。利用传统工艺制备的支架孔径一般为200 μm以下可控，而低温快速成型可通过调控支架成型参数实现支架孔径数百微米范围可控^[24]。具体流程为：①通过调节喷头挤出浆料细丝间距离(d值)实现对支架网格大小的控制，从而决定水平与竖直截面上孔径大小。②通过调控喷头直径控制挤出浆液细丝粗细，影响浆液细丝固化时间，从而影响孔径大小。实验利用低温快速成型技术并通过调控成型参数，实现亲水改性组与未改性组材料的孔径均在理想孔径范围内并具有较高孔隙率。然而，在成型参数相同的条件下，两组孔径及孔隙率差异有显著性意义，聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架组材料的孔径波动范围大，孔径均值较聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架组小且部分孔径有闭塞现象，这可能与亲水改性材料在低温快速成型过程中固化时间较长，喷头喷出的细丝不能迅速固化，产生细丝“膨胀”现象，从而导致浆液细丝连接部分出现刻痕及孔径变小。

其次，理想支架的力学性应与正常人骨的力学性能相一致，良好的力学性保证了骨组织形成早期的支撑作用^[25]。然而，实际成型的人工骨支架为保持良好的细胞相容性必须具备多孔疏松结构，即高孔隙率；受材料高孔隙率的影响，人工骨支架的力学性能往往较正常人骨组织低。实验利用低温快速成型制备的两组材料力学性能均不及松质骨，且聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石组材料力学性能低于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石组；除去材料类型的关系，通过电镜观察可见聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石组材料部分有裂痕，这在一定程度上影响了其力学性能。Liu等^[26]通过对低温快速成型喷射系统的研究，得出适当的喷头运动速度、液体材料挤出速度才能避免叠加过程中的支架倒塌和孔隙闭塞，构建适合材料的成型参数才能保证支架三维多孔结构的建立。实验首次利用低温快速成型技术制备聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架，为保证实验对照原则，使用成型参数是聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石支架成型的最佳参数；因材料类型不同，此参数不一定是聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架的最佳成型参数。因而，尚需进一步实验研究适合聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架成型的最佳参数，从而提高成型精细度，避免孔径闭锁及材料裂痕的产生。

3.3 支架的细胞相容性 细胞黏附率及增殖活性是检测材料细胞相容性的重要指标。骨修复过程中细胞只有与支架黏附才能增殖、分化，分泌胶原骨基质，促进新骨矿化^[27]。PLGA为乳酸类高聚物，其结构上得疏水性使其与细胞的亲和性降低，从而不利于细胞在支架上的黏附。聚乙二醇具有良好的亲水性能，独特的生物相容性及无免疫原性和抗原性；有学者研究在PLGA材料上引入聚乙二醇链，可将聚乙二醇的优良性能转移，从而改善原材料的亲水性，增加材料对细胞的亲和性^[28]。细胞与材料复合培养显示亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石支架在细胞黏附率及表面细胞增殖活性上明显优于聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石组。亲水改性支架细胞黏附率高，起始细胞基数大；且有研究显示细胞、材料及其共培养的微环境均会对细胞黏附产生影响^[29]，亲水改性组支架提供了黏附活性基团聚乙二醇，可减少因微环境改变(如换液、pH值等)导致的细胞脱落，从而利于细胞增殖。此外，亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石材料在电镜下观察下见较多粗糙刻痕，有研究显示支架材料表面拓扑形态及粗糙性更利于细胞黏附、增殖及功能表达^[30]。因而，低温快速成型制备的亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石材料较聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石具有更好的细胞相容性。

总的来说，利用低温快速成型技术制备的亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石材料具有合适的孔径范围及高孔隙率，细胞黏附率及增殖活性较高，是一种细胞相容性良好的骨支架材料，具有良好的骨缺损修复潜能。在成型参数相同的条件下，聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石材料的力学性能较聚乳酸-乙醇酸/纳米羟基磷灰石欠佳，需要进一步研究成型参数与材料力学性能的关系，并且亲水改性聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇/纳米羟基磷灰石的降解率及骨缺损修复效果有待进一步的动物实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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低温快速成型亲水改性复合人工骨支架的性能测定

Preparation and properties of hydrophilic modified artificial bone scaffold using low-temperature rapid prototyping

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