基因枪介导的骨形态发生蛋白2基因转染治疗陈旧性骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1680-1686.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.007

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基因枪介导的骨形态发生蛋白2基因转染治疗陈旧性骨缺损

朱小萌¹，王翀¹，宋兴华¹，詹玉林²，李文举¹

¹新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²上海交通大学附属上海市第六人民医院骨科，上海市 200033

修回日期:2014-02-21 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 宋兴华，硕士研究生导师，主任，主任医师，新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:朱小萌，男，1987年生，新疆维吾尔自治区吐鲁番市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事骨病运动损伤与骨肿瘤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81060144)

Particle gun-mediated bone morphogenetic protein-2 gene transfection for treatment of chronic bone defects

Zhu Xiao-meng¹, Wang Chong¹, Song Xing-hua¹, Zhan Yu-lin², Li Wen-ju¹

¹Department of Bone Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Orthopedics, Affiliated Sixth People’s Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China

Revised:2014-02-21 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Song Xing-hua, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Bone Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhu Xiao-meng, Studying for master’s degree, Department of Bone Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060144

摘要/Abstract

摘要：

背景：体内外研究都已证实骨形态发生蛋白具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化、诱导异位骨形成、促进骨折愈合、控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。

目的：使用含有骨形态发生蛋白2基因真核表达质粒的基因枪进行局部基因注射以治疗陈旧骨缺损。

方法：72只新西兰大白兔建立陈旧兔桡骨中段骨缺损模型，按所截骨长度均分1.5 cm组、2.0 cm和2.5 cm组。各组又随机分为治疗组(骨形态发生蛋白2基因转染组)和对照组(自然愈合组)。于转染后1，3，8，9周拍摄X射线平片，1，3，8和9周取骨折间软组织行骨形态发生蛋白2的Western blot检测，于1，3，8和9周时取标本大体观察，评价愈合情况。

结果与结论：①大体标本观察发现治疗组骨痂生成量多于对照组。②治疗组转染后1，3，8，9周的Lane-Sandhu X射线评分优于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。③骨形态发生蛋白2浓度定量，各时间点治疗组骨形态发生蛋白2浓度优于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果说明应用基因枪介导骨形态发生蛋白2基因局部转移治疗陈旧骨缺损效果明确。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨细胞, 陈旧性骨缺损, 愈合, 骨形态发生蛋白2, 基因转染, 基因枪, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Both in vitro and in vivo studies have confirmed that, bone morphogenetic protein (BMP) regulates the differentiation of osteoblasts and chondroblasts, induces heterotopic bone formation, promotes fracture healing, and controls the morphology of skeleton in mammals.

OBJECTIVE: To treat chronic bone defects using particle gun containing BMP2 gene eukaryotic expression plasmid via local injection.

METHODS: A total of 72 healthy New Zealand white rabbits were applied to establish chronic bone defect model in the rabbit radius. According to the length of bone defect, the rabbits were divided into three groups: 1.5 cm group, 2.0 cm group, 2.5 cm group. Each group was further randomly assigned into two subgroups: treatment group (BMP-2 gene transfection) and control group (naturally healing). X-ray examinations were performed at 1, 3, 8 and 9 weeks after transfection, and soft tissue between the bone defects was harvested to detect BMP-2 using western blot analysis; and radius specimens were taken for gross observation at the same time points, to evaluate the healing.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gross specimen observation: bone callus formation in treatment group was generally more than that in control group. (2) Lane-Sandhu X-ray score in treatment group was significantly higher than that in control group at 1, 3, 8, 9 weeks after transfection (P < 0.05). (3) BMP-2 concentration in treatment group was significantly higher than that in control group at each time point (P < 0.05). The local transfer of particle gun-mediated BMP-2 gene is an effective therapy of chronic bone defect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: fractures, bone, bone morphogenetic proteins, osteotomy, biolistics, fracture healing

中图分类号:

R318

朱小萌，王翀，宋兴华，詹玉林，李文举. 基因枪介导的骨形态发生蛋白2基因转染治疗陈旧性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1680-1686.

Zhu Xiao-meng, Wang Chong, Song Xing-hua, Zhan Yu-lin, Li Wen-ju. Particle gun-mediated bone morphogenetic protein-2 gene transfection for treatment of chronic bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1680-1686.

图/表（结果） 2

2.1 大体标本观察

基因转染后1周：骨缺损区被不规则、断续的暗褐色物质填充，质地略硬，对照组骨缺损间填充物稍低于治疗组。多数骨缺损表面凹凸不平，较易与周围组织剥离，骨髓腔均已闭，大部分对照组骨折断端有异常活动。

基因转染后3周：机化组织填充于各组骨缺损区，多数1.5 cm组断端间连接有粗细不一的纤维性骨桥。2.0 cm治疗组断端间有少量纤细骨组织连接，断端间骨痂均呈向心性延伸生长。2.5 cm组骨痂较少、向心性延伸。断端无异常活动。治疗组整体愈合情况优于对照组。其中1.5 cm组最为突出。

基因转染后8周：1.5 cm治疗组断端间可见大量不规则连续骨痂形成，呈向心性分布，但骨痂中央区相对薄弱。2.0 cm组断端间均有骨痂，亦呈向心性生长趋势，对照组缺损部位形成弧形凹槽，治疗组两端骨痂间多形成较细的弓形骨桥。2.5 cm治疗组断端骨痂亦呈向心性生长，形成下凹槽，缺损长度有所缩短，偶可见弓形骨桥；而对照组骨缺损断端仅可见少量骨痂形成，有骨不连倾向。

基因转染后9周：大体情况如基因转染后8周时，治疗组修复部位直径普遍大于对照组。

2.2 骨折修复后X射线检查结果

基因转染后1周：治疗组与对照组比较差异有显著性意义(1.5 cm组：t=4.547，P < 0.05；2.0 cm组：t=2.237， P < 0.05；2.5 cm组：t=3.169，P < 0.05)，见图2。

基因转染后3周：治疗组优于对照组(1.5 cm组：t=6.436，P < 0.05；2.0 cm组：t=4.452，P < 0.05；2.5 cm组：t=6.185，P < 0.05)，见图3。

治疗后8周：治疗组优于对照组(1.5 cm组：t=5.612，P < 0.05；2.0 cm组：t=5.571，P < 0.05；2.5 cm组：t=5.476，P < 0.05)，见图4。

治疗后9周：治疗组优于对照组(1.5 cm组：t=5.854，P < 0.05；2.0 cm组：t=11.362，P < 0.05；2.5 cm组：t=13.308，P < 0.05)，见图5。

治疗组与对照组在转染后1，3，8，9周拍摄X射线平片的Lane-Sandhu X射线评分结果组内比较：各骨缺损长度，各时间点治疗组与对照组X射线评分差异有显著性意义(P <0.05)：治疗组优于对照组(表2)。

2.3 所取组织标本中骨形态发生蛋白2的western-blot检测 分别在基因转染后处死以上各组实验动物3只，取骨缺损间软组织行Western blot检测，样本骨形态发生蛋白2浓度定量结果显示，各骨缺损长度，各时间点治疗组骨形态发生蛋白2浓度优于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05，表3)。

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引言

临床上，各种原因造成的长管状骨的节段性缺损是骨科较为常见且较棘手的问题之一，常常因病情迁延致陈旧性骨缺损，甚至导致骨不连的发生^[1-2]。目前的骨缺损治疗的相关研究涉及自体骨移植、异体骨移植、骨搬移技术、人工骨移植、组织工程骨、转基因工程等多方面，这些方法均有各自的适应证和优缺点^[3-4]。基因转染技术的发展为解决此类问题开辟了新的研究思路。

参与骨缺损修复的骨诱导因子较多，其中骨形态发生蛋白是目前研究较为透彻的骨诱导因子之一。体内外研究都已证实骨形态发生蛋白具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化、诱导异位骨形成、促进骨折愈合、控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能^[5-6]。其中骨形态发生蛋白2在体内、体外均可诱导骨形成^[7-9]，对骨折和骨缺损的治疗可发挥重要作用。很多研究结果证明骨形态发生蛋白2表达水平的高低与骨量产生呈正相关^[10-12]。基因转染是将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持生物功能^[13]。转染后的细胞可以持续表达、释放骨形态发生蛋白，发挥促进骨愈合的作用。

基因枪是利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金属粒或金粉微颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定转化并有可能获得表达的转基因装置。实验旨在探索使用含有骨形态发生蛋白2基因真核表达质粒的基因枪治疗陈旧骨缺损的效果，以期为临床骨缺损治疗提供新方法和新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：于2011年6月至2013年8月在新疆医科大学第一附属医院动物实验室完成。

材料：

实验动物：选用健康新西兰大白兔72只，3月龄，体质量(2.5±0.2) kg，雌雄不限，标准喂养，由新疆医科大学动物饲养中心提供，许可证号：SYXK<新>2010-0002。饲养室定时杀菌、消毒，温度23 ℃左右，相对湿度为65%左右。

对动物的处理过程符合中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物实验通过动物伦理学审查(中国新疆医科大学动物实验伦理审批号：20100723008)。

方法：

动物分组：将72只大白兔按所截骨长度随机均分3组(n=24)：1.5 cm组、2.0 cm组、2.5 cm组。各组又随机均分为2组(n=12)：治疗组给予骨形态发生蛋白2基因转染进行治疗，对照组不进行干预为自然愈合。

粒子制备：按照文献[14]进行pIRES2-EGFP-骨形态发生蛋白2真核表达质粒制备及其基因序列、生物活性检测。

目的基因“子弹”制作：制作骨形态发生蛋白2的DNA/金粉悬液(按80颗子弹量计算)；制作子弹。

制备兔左侧桡骨陈旧骨缺损模型：截取大白兔左侧桡骨中断骨，长度分别为1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm。

采用基因枪进行局部给药治疗骨缺损：准备好子弹，使用氦气作为基因枪动力源，按基因枪说明书提供的数据，设定氦气输出压力280-300 psi，将子弹上入弹夹。暴露骨缺损区域，照准位置，扣动扳机轰击。截骨后12周向治疗组每一桡骨骨缺损区发射1枚子弹，利用高压氦气将位于子弹内壁处预包有目的DNA的金粉颗粒直接打入细胞内部，即转染约1.25 μg的质粒；向对照组发射空枪。关闭切口，依次缝合，术后分别给予80×10⁴ U青霉素肌注，2次/d，连续3 d。患肢无任何内、外固定，活动不受限。

主要评价指标：

一般情况及大体标本观察：术后观察实验动物的精神状态、饮食及术区有无感染等。在预定时间将大白兔处死，取左前臂原切口进入，剥离出左侧桡骨，观察、记录骨痂形成及断端愈合情况。留取影像资料。

X射线平片：分别于基因转染时及治疗后1，3，8和9周时行左前臂正侧位X射线检查，并按照Lane-Sandhu X射线评分标准判断骨缺损愈合情况^[15](表1)。

分子生物学检查：于基因转染后1，3，8，9周时将试验大白兔处死，并取骨缺损间软组织，进而定量检测骨形态发生蛋白2浓度值。

标本采集与检测：

X射线平片：分别于基因转染后第1，3，8和9周时间点拍摄X射线平片，依据骨缺损长度、骨痂形成量评估大白兔骨缺损愈合情况。

大体标本采集：分别于基因转染后第1，3，8和9周将动物处死后，取左侧前臂原切口切开进入，剥离出左侧桡骨，充分暴露桡骨断端，肉眼观察、记骨录缺损部位骨痂形成及断端愈合情况，评价愈合情况，并留取影像资料。

骨缺损间组织：分别于基因转染后第1，3，8和9周处死以上各组实验动物3只，取骨缺损间软组织行Western blot检测，以了解骨形态发生蛋白2蛋白活性。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度：根据A值及蛋白标准品浓度绘制出浓度标准曲线，y=0.000 8x+0.151 5(R²=0.994 6 >0.99)，见图1。

统计学分析：用Excel软件整理原始数据结果，计量数据以x(_)±s表示，用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。检验水准α=0.05。

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讨论

骨缺损是指骨折两断端因创伤、疾病等某种原因导致部分骨质丧失而形成较大的缺损。对于小范围和轻微的骨缺损，骨组织具有自我修复能力，但大段骨缺损性机体无法自行修复而最终将导致陈旧性骨缺损^[16-17]。陈旧性骨缺损仍然是当今骨科领域治疗所面临的难题之一。目前的科学一直在努力寻求解决陈旧性骨缺损的治疗问题。

骨形态发生蛋白是由Urist于1965年通过实验而发现的，其作为一种能够在体内诱导骨和软骨的因子渐被后人肯定，骨形态发生蛋白是一个大家族，具有诱导多种未成熟或未分化细胞分化为成骨细胞功能，如骨髓基质干细胞，进而通过增殖、迁徙等过程导致骨、软骨形成，极大地促进骨折修复能力^[18-23]。目前研究较多的是骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7，其中骨形态发生蛋白2被证实其是诱导成骨活性最主要的成骨调控因子^[24]。骨形态发生蛋白2已被证实治疗临界骨缺损疗效确切，其疗效可与自体骨移植相媲美。Huang等^[25]发现，添加骨形态发生蛋白2可显著增加骨钙蛋白含量。实验对比了治疗组与对照组的Western-blot法定量检测结果与影像学变化情况，也间接证明了骨形态发生蛋白2的表达情况与骨缺损愈合情况有正相关关系。

基因转染是通过体外细胞培养，将具生物功能的骨形态发生蛋白目的基因转移或运送到体内并使核酸在细胞内维持生物功能。转染后的细胞可以持续表达、释放骨形态发生蛋白，发挥促进骨愈合的作用。基因枪是是一种基因转移工具，本实验利用高压氦气将外包裹有外源基因DNA的金粉微粒打入完整细胞中，从而使外源pIRES2-EGFP-骨形态发生蛋白2真核表达质粒在细胞中稳定转化，从而治疗骨缺损。

实验标本大体观察、X射线平片检测、骨形态发生蛋白2浓度值测定结果趋于一致，即治疗组标本大体情况、骨痂生成量、骨形态发生蛋白2蛋白含量均优于对照组，达到了预期目的。本课题前期实验显示：新鲜骨缺损发生后骨折局部组织中骨形态发生蛋白2活性表达水平和时间呈正态分布关联性，即骨形态发生蛋白2在1周内出现分泌量明显增加，3周时达峰值，4周时分泌量渐减少，推测骨形态发生蛋白2 含量随时间延长将进一步减少，直至恢复正常水平^[26]。而实验在制备完成新鲜骨缺损模型后观察12周，达到陈旧性骨缺损模型要求，此时机体分泌骨形态发生蛋白2量将趋于正常值，如此可减少实验误差出现，本次实验按转染后1，3，8，9周采集标本，之后统一采用 Western-blot法定量检测骨形态发生蛋白2活性结果，根据检测数据经分析可见，直到9周时，各治疗组骨形态发生蛋白2活性表达依然维持较高水平，无明显下降趋势。推测可能是基因转染后细胞活性较高，从而使得骨缺损区骨形态发生蛋白2持续高表达。有研究表明，一定程度上骨形态发生蛋白2的表达量的增加会随着缺损长度的增加而不断增加^[27]，而整合实验的数据经分析后不能得出以上结论，这还需要进一步的研究。

Johnson等^[28-29]指出，若缺损的长度大于骨干直径的三四倍时，可导致因骨缺损引起的骨不愈合。3月大新西兰大白兔平均桡骨直径在4.0-5.0 mm，因此根据以上理论，当兔的桡骨骨缺损长度超过2.0 cm时，将有可能产生因为骨缺损引起的骨不愈合^[30]。因此推测，机体对较长的骨缺损的修复与对较短的骨缺损的修复反应机理可能是不同的，但是何种因素导致了以上修复反应的不同呢？而且在这种病理状态下人体又是如何反应的？这还需要以后的大量研究解决以上的问题，为大范围的骨缺损所导致的骨不愈合的治疗提供可能。

总之，通过本实验研究结果显示，治疗组与对照组比较差异有显著性意义(P <0.05)，拟推断出骨形态发生蛋白2对陈旧性骨缺损愈合有促进作用；另外，应用基因枪介导基因转染技术对陈旧性骨缺损的治疗可行。因实验进程中各方面不可避免会受到内外界因素的干扰，可能造成一定误差，所以以上结论的确立，仍需要进一步深入的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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