双相钙磷生物陶瓷/硫酸钙骨水泥多孔三维支架的生物性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着组织工程技术的发展，多孔生物陶瓷被越来越多的运用到骨缺损的修复中，当前的研究主要集中在这种生物陶瓷的合成及其各项性能的评价。
目的：研究一种新型骨水泥的制备方法并测定其理化性能及与成骨细胞的生物相容性。
方法：共沉淀法制备双相钙磷生物陶瓷粉体，利用胶体团聚成颗粒，烧结后得到颗粒状、多孔羟基磷灰石/磷酸三钙生物陶瓷，并按不同比例与高纯度医用半水硫酸钙混合制备钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥。
结果与结论：X射线衍射证实合成物质为双相钙磷陶瓷，颗粒状双相钙磷陶瓷具有多孔网状结构，骨水泥在 3 min内保持可塑状态，固化时间为15 min，固化温度为36.5 ℃，压缩强度最高为5.82 MPa，MTT毒性级为0级，成骨细胞在材料表面生长良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 钙磷生物陶瓷, 硫酸钙, 骨水泥, 理化性能, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: With the development of tissue engineering, porous bioceramics are more and more used to repair bone defects. Current research focuses on the biological synthesis of this bioceramics and its performance evaluation.
OBJECTIVE: To discuss the preparation of a new kind of bone cement and to determine its physicochemical properties and biocompatibility with osteoblasts.
METHODS: Biphasic tricalcium phosphate powders were prepared using co-precipitation method. The powder was turned into granular stuff by arabic gum. After sintering, porous hydroxyapatite/tricalcium phosphate bioceramics were harvested, and then mixed with alpha-hemihydrate to prepare the bone
cement.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray diffraction confirmed that the synthetic substance was a kind of biphasic calcium phosphate ceramic having a porous structure. The bone cement could be in the plastic state within 3 minutes. The curing time was 15 minutes, and the curing temperature was 36.5 ℃. The maximum compression strength was 5.82 MPa, and the MTT toxicity was level 0. Osteoblasts could grew well on the material surface.

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Key words: biocompatible materials, calcium sulfate, hydroxyapatites, osteoblasts

中图分类号:

R318

谭迎赟，白石，廖运茂. 双相钙磷生物陶瓷/硫酸钙骨水泥多孔三维支架的生物性能[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1161-1164.

Tan Ying-yun, Bai Shi, Liao Yun-mao. Biological properties of biphasic tricalcium phosphate bioceramics/calcium sulfate bone cement porous three-dimensional scaffolds [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1161-1164.

图/表（结果） 1

2.1 双相钙磷生物陶瓷的X衍射图谱将衍射结果进行物相鉴别，证实仅有羟基磷灰石和磷酸三钙两种晶相，合成的物质为双相钙磷生物陶瓷(图1)。

2.2 钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥的固化时间和温度加入去离子水调拌均匀后，3 min内骨水泥能保持可塑形状态，固化时间为15 min，各组间无明显差别。其固化温度随硫酸钙的含量增加而增高，但是最高温度为36.5 ℃。

2.3 钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥的压缩强度各组骨水泥均有较高的压缩强度，当硫酸钙的质量分数为40%时，骨水泥的压缩强度最高(5.8 MPa)(图2)。

2.4 钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥与双相钙磷陶瓷颗粒的表面形态图3A示钙磷生物陶瓷呈球形颗粒，直径 0.6-0.9 mm；图3B为2 000倍扫描电镜图像，示钙磷生物陶瓷颗粒有广泛相连的微孔结构；图3C为20 000倍扫描电镜图像，示钙磷生物陶瓷颗粒表面微孔孔径为0.5-1.5 μm，平均孔径为1 μm，羟基磷灰石以柱状六方晶体形态存在。图3D为10 000倍扫描电镜图像，示骨水泥固化后的断面形态，硫酸钙晶体包绕钙磷生物陶瓷颗粒。
2.5 成骨细胞在材料表面生长的形态观察倒置相差显微镜观察示与材料复合培养的成骨细胞生长良好，接种后 4 h后可见成骨细胞贴壁生长，有正常的分裂增殖表现，随着培养时间的延长，可见细胞增多并沿着材料周边密集生长，细胞形态多为梭形，无细胞衰老及异常分裂现象。图4A示复合培养2 d后大量成骨细胞黏附于多孔材料表面，多数细胞已伸展成梭形或多角形，伸出突起黏附于材料孔壁上，黏附的细胞量较少。图4B示复合培养4 d后，多孔材
料表面细胞数量明显增多，细胞充分伸展，形态多样，有数个突起，附着于材料表面或深入到孔隙内，与材料牢固结合，细胞融合成片，将多孔材料表面覆盖。
2.6 MTT法检测细胞增殖情况结果表明各时间点的相对增殖度均大于100%，毒性评级均为0。细胞增殖在第4天达到峰值，表明骨水泥浸提液对细胞的增殖无毒性(图5)。

参考文献

引言

材料方法

材料：

相关主要试剂、仪器和细胞：
试剂、仪器和细胞	来源
医用半水硫酸钙	Sigma公司
X射线衍射仪	X'Pert Pro型，荷兰飞利浦公司
INSTRON5565万能力学测试仪	美国
成骨细胞	MG63细胞株，口腔疾病国家重点实验室提供

实验方法：

共沉淀法制备羟基磷灰石/磷酸三钙生物陶瓷：按照质量比1.825︰1 称取一定量的四水硝酸钙[Ca(NO₃)₂•4H₂O]与磷酸氢二铵[(NH₄)₂HPO₄]，使得Ca/P摩尔比为1.646，分别配制成0.5 mol/L硝酸钙和0.15 mol/L磷酸氢二铵溶液，将磷酸氢二铵溶液滴加入硝酸钙溶液中，并不断搅拌，反应中控制pH为7。静置、陈化、过滤沉淀得到固体，用去离子水冲洗掉多余的NH₄⁺离子，干燥、球磨得到粉体，利用胶体团聚成直径为0.6-0.9 mm的颗粒，于电炉中加热到1 200 ℃，并保持1 h，自然冷却，得到颗粒状双相钙磷生物陶瓷，羟基磷灰石与磷酸三钙的摩尔比为7︰3。

钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥的制备：颗粒状双相钙磷生物陶瓷按一定比例与医用半水硫酸钙混合后加入适量的去离子水，即得到钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥。硫酸钙的质量分数分别为50%，40%，30%，20%。

钙磷生物陶瓷X射线衍射分析：双相钙磷生物陶瓷颗粒研磨成粉末进行X射线衍射，得到X射线衍射图谱，并进行物相鉴别。

钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥的固化时间和温度的测定：在室温下(27 ℃)将各组钙磷陶瓷颗粒与硫酸钙混合，加入去离子水调拌均匀后，使骨水泥在37 ℃水浴箱中固化，测定其保持可塑形状态的时间。并测定其固化过程中的最高温度。每个组别测定3次，取其平均值。

钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥的压缩强度：将各组钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥在模具中制成直径12.5 mm、高13.5 mm的圆柱，在万能力学测试仪上进行压缩强度的测试，每个比例测试3次，并取其平均值。

钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥与双相钙磷陶瓷颗粒的表面形态观察：将材料进行表面喷金处理后，用扫描电镜分别观察钙磷陶瓷颗粒与钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥固化后断面的表面形貌。

成骨细胞在材料表面接种和形态观察：将材料制作成直径12.5 mm，厚度2 mm的圆片，置于24孔板中，将成骨细胞(MG63细胞株)以5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于材料上，在37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度孵箱中静置培养。适时在倒置相差显微镜下观察细胞生长，并分别于第2天、第4天取出材料样本各2片，3%戊二醛浸泡过夜固定，依次用体积分数为30%，50%，70%，80%，95%，100%乙醇梯度脱水，临界点干躁，真空离子喷金镀膜，扫描电镜观察。

MTT法检测细胞增殖情况：将成骨细胞以5×10⁷ L^-1浓度接种于96孔板中，在37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度孵箱中静置培养，次日倒置相差显微镜观察细胞贴壁，吸出培养基，加入200 μL骨水泥浸提液，于1，2，3，4，5，7 d各取1块孔板，置换新鲜培养基后每孔加入MTT 20 μL， 37 ℃孵育3.5 h后终止培养，吸弃各孔内培养上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜，置37 ℃孵箱30 min，水平摇床振荡使沉淀物充分溶解。以PBS为对照调零，在酶联免疫检测仪上测定每孔的吸光度值。以空白对照组的吸光度均值为100%细胞增殖率，计算个实验组的细胞相对增殖度(RCR)。

相对增殖度(%)=实验组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%

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讨论

骨水泥调和后在3 min内保持可塑状态，并在5 min初凝，具有合适的临床操作性；其固化过程中反应温和，不会对植入部位的组织造成灼伤；固化后具有较高的压缩强度，使其在植入后能够保持稳定的形态。

通过在体外模拟体内细胞生长的微环境，将材料与细胞复合培养可直接观察细胞在生物材料上的生长情况，其形态学观察是材料生物相容性评价的一个重要方面。实验结果显示，成骨细胞在多孔支架材料表面生长良好，有数个突起，附着于材料表面或深入到孔隙内，形成一种锚状结构与材料牢固结合，细胞增殖现象明显。说明成骨细胞在多孔支架材料表面表现出很好的黏附能力、增殖活力及成骨活性，多孔材料具有更适合于细胞生理功能发挥的三维环境。有研究证实三维支架能有效刺激成骨细胞的分化，有利于成骨前细胞的迁移和增殖^[8]。

MTT实验的生物学终点是线粒体，其数目在细胞生命活动旺盛时增多，衰退时减少，线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征。用电子计算机控制的自动分光光度仪测试MTT染色的吸光度值，可以准确、客观的计算出细胞的增殖率和死亡率。因而测定MTT结晶的形成量可以反映细胞的数量与活力，从而对材料的细胞毒性作出可靠的定量评价。实验各时间点的相对增殖度均大于100%，毒性级为0，表明骨水泥浸提液对细胞的增殖无毒性。

实验未对钙磷生物陶瓷的羟基磷灰石/磷酸三钙摩尔比以及颗粒状材料的孔隙率进行探讨，钙磷生物陶瓷的羟基磷灰石/磷酸三钙摩尔比可以控制，颗粒状材料的孔隙率可以通过多种方法调节，两者都与材料的生物活性相关；钙磷生物陶瓷与硫酸钙的比例也会影响到材料的生物活性。实验所制备的颗粒状钙磷生物陶瓷具有良好的生物相容性，在其进一步的实验中，可以探讨其最佳的羟基磷灰石/磷酸三钙摩尔比、颗粒状材料孔隙率以及钙磷生物陶瓷与硫酸钙的比例，以获得最佳的生物活性。

结论：实验所制备的钙磷生物陶瓷/硫酸钙骨水泥具有合适的临床可操作性，良好的可塑性及一定的压缩强度，

良好的生物安全性，其多孔结构为成骨细胞的生长提供了良好的环境，为其进一步的细胞实验和动物实验打下了基础。

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全文链接：

[1]	陈心敏, 李文标, 熊凯凯, 熊晓燕, 郑利钦, 李木生, 郑永泽, 林梓凌. 钉道强化股骨近端防旋髓内钉治疗老年A3.3型股骨转子间骨折：最佳骨水泥量有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1404-1409.
[2]	袁俊, 杨家福. 局部氨甲环酸浸润在非骨水泥全膝关节置换过程中止血效果的评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 873-877.
[3]	侯广原, 张继学, 张志军, 孟祥晖, 段文, 高维陆. 骨水泥强化椎弓根螺钉内固定治疗伴骨质疏松腰椎退行性疾病的1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 878-883.
[4]	化昊天, 赵文宇, 张磊, 白文博, 王新卫. 抗生素人工骨治疗慢性骨髓炎疗效和安全性的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 970-976.
[5]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[6]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[7]	钟远鸣, 万通, 钟锡锋, 吴卓檀, 何炳坤, 吴思贤. 弯角与单侧椎弓根入路椎体成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折有效性与安全性的Meta分析 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 456-462.
[8]	成世高, 王万春, 蒋栋, 李腾飞, 李洵, 任炼. 标准柄与加长柄骨水泥型假体置换治疗高龄转子间骨折的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 362-367.
[9]	孟令杰, 钱辉, 盛晓磊, 陆剑锋, 黄建平, 祁连港, 刘宗宝. 3D打印建模联合骨水泥成形微创治疗塌陷Sanders Ⅲ型跟骨骨折[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3784-3789.
[10]	李鑫平, 崔秋菊, 曾曙光, 冉高英, 张兆强, 刘显文, 方炜, 徐帅妹. β-磷酸三钙/壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与矿化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3493-3499.
[11]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.
[12]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.
[13]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[14]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[15]	马晴, 施丽燕, 黄思雪, 郑章博文, 张爱华, 战德松, 付佳乐. 氧化锆陶瓷在牙体修复领域的研究现状及展望[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3597-3602.