不同分期骨关节炎滑膜细胞中COX-2 mRNA表达的差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (7): 1003-1008.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.004

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不同分期骨关节炎滑膜细胞中COX-2 mRNA表达的差异

曾明珠¹，段戡²，袁长深²，梅其杰²，秦凯³

1广西自治区骨伤医院，广西壮族自治区南宁市 530012
2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
3广西中医药大学研究生学院，广西壮族自治区南宁市 530001

修回日期:2013-12-03 出版日期:2014-02-12 发布日期:2014-02-12
通讯作者: 段戡，主任医师，博士，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:曾明珠，男，1986年生，广东省湛江市人，汉族，硕士，主要从事骨关节炎及关节疾病研究。

COX-2 mRNA expression at different stages of osteoarthritis synoviocytes

Zeng Ming-zhu¹, Duan Kan², Yuan Chang-shen², Mei Qi-jie², Qin Kai³

1Orthopedics Hospital of Guangxi Autonomous Region, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
2The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
3Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2013-12-03 Online:2014-02-12 Published:2014-02-12
Contact: Duan Kan, M.D., Chief physician, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zeng Ming-zhu, Master, Orthopedics Hospital of Guangxi Autonomous Region, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：COX-2基因实际存在于关节成纤维样滑膜细胞里，影响骨关节炎症的发生、发展。阐明不同分期骨关节炎滑膜细胞中COX-2基因表达量的差异对进一步深入了解骨关节炎的发生与发展，以及滑膜细胞在这一过程中的作用，具有重要的理论意义。
目的：分析COX-2 mRNA在不同分期骨关节炎成纤维样滑膜细胞中表达的差异。
方法：收集膝骨关节炎病变滑膜44例及正常滑膜12例，经原代细胞培养生长至4代的成纤维样滑膜细胞用于实验，应用实时荧光定量RT-PCR检测骨关节炎和正常成纤维样滑膜细胞中COX-2 mRNA的表达情况，最后使用2-ΔΔCt方法进行相对定量分析。
结果与结论：COX-2 mRNA在骨关节炎的成纤维样滑膜细胞中的表达明显高于正常成纤维样滑膜细胞 (P < 0.05)，其中骨关节炎早期组表达最高，与骨关节炎中期组、晚期组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，骨关节炎中期组与晚期组中表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。结果说明COX-2mRNA可能是骨关节炎症病变过程中的重要生物学指标，且主要起作用于骨关节炎病变早期。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 实时荧光定量RT-PCR, 骨关节炎, 成纤维样滑膜细胞, COX-2 mRNA

Abstract:

BACKGROUND: COX-2 gene actually exists in the joint fibroblast-like synoviocytes, it affects osteoarthritis occurrence and development. Understanding the differences of COX-2 gene expression levels at different stages of osteoarthritis synoviocytes has important theoretical significance for the occurrence and development of osteoarthritis, as well as the role of synoviocytes in this process.
OBJECTIVE: To analyze the difference of COX-2 mRNA at different stages of osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes.
METHODS: Synovial membrane from 44 osteoarthritis patients and 12 normal cases were selected. Primary cells were cultured to passage 4 fibroblast-like synoviocytes for the use in the experiment. COX-2 mRNA expression in osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes and normal fibroblast-like synoviocytes was detected using real-time fluorescence quantitative RT-PCR. The relative quantitative analysis was performed using 2^-ΔΔCt method.
RESULTS AND CONCLUSION: Expression of COX-2 mRNA in osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes was significantly higher than that in normal fibroblast-like synoviocytes (P < 0.05). The expression levels reached a peak at early osteoarthritis group, with significant differences compared with middle and late osteoarthritis groups (P < 0.05). There was no significant difference between middle and later osteoarthritis groups (P > 0.05). COX-2 mRNA might be important biological marker for the inflammation in osteoarthritis, and mainly plays a role in early osteoarthritis stage.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoarthritis, knee, synovial membrane, fibroblasts, reverse transcriptase polymerase chain reaction, COX-2

中图分类号:

R318

曾明珠，段戡，袁长深，梅其杰，秦凯 . 不同分期骨关节炎滑膜细胞中COX-2 mRNA表达的差异[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1003-1008.

Zeng Ming-zhu, Duan Kan, Yuan Chang-shen, Mei Qi-jie, Qin Kai . COX-2 mRNA expression at different stages of osteoarthritis synoviocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 1003-1008.

图/表（结果） 5

2.1 成纤维样滑膜细胞形态 在原代培养4 d后第1次换液时即可在倒置显微镜下见有成纤维细胞样生长，细胞分裂增殖迅速，呈长梭状极向排列，培养第9天后细胞基本布满瓶底，此时可传代。传代后滑膜细胞在2 h后开始贴壁，12 h后能完全贴壁生长，生长速度较快，形态以梭形为主，第3天即可长满瓶底。第2代后的滑膜细胞生长较为稳定，且基本只保留了贴壁生长的B型细胞^[8]。

2.2 标准曲线绘制及分析 目的基因COX-2及内参基因β-Actin的扩增曲线均接近S型曲线(图1)，熔解曲线呈单峰且溶解温度均一(图2)；PCR产物琼脂糖凝胶电泳图可见大小约190 bp的单一条带，未见有杂带及产物二聚体(图3)。实验以β-Actin为内参做校正，与正常成纤维样滑膜细胞相比，骨关节炎成纤维样滑膜细胞的COX-2 mRNA相对表达量呈高表达。

2.3 扩增效率 根据标准曲线的斜率与扩增效率之间的关系，分别算出两组病例的扩增效率为109.4%和105.6%(图4)，属于90%-110%范围，符合数据分析要求^[9]，因此认为该标准曲线是可靠的。

2.4 2^-^ΔΔCt相对定量分析 COX-2 mRNA在非骨关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达量为1.0(0.9-1.1)，骨关节炎早期组细胞中的表达量为5.3(5.1-5.6)、中期组为3.7(3.4-3.9)、晚期组为4.2(3.7-4.7)；骨关节炎三期的表达量分别是非骨关节炎表达量的5.3、3.7和4.2倍(P均 < 0.05)；而骨关节炎早期组是中期组的1.4倍(P < 0.05)、晚期组的1.3倍(P < 0.05)，中期组与晚期组两组间比较差异无显著性意义(图5)。

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引言

材料方法

设计：对照实验。

时间及地点：2012年4月至2013年1月在广西医科大学中心实验室完成。

材料：膝关节滑膜组织均于广西医科大学第一附属医院骨关节脊椎科膝关节镜术中所得，诊断分期明确。

实验组：收集骨关节炎患者44例滑膜组织为实验组，其中男14例，女30例；年龄41-78岁，平均年龄57.5岁。依据Kellgren和Lawrence的X射线诊断标准^[5]分为3组，早期组：Ⅰ-Ⅱ级15例；中期组：Ⅲ级14例；晚期组：Ⅴ级15例。

纳入标准：①符合中华医学会骨科学分会制定的骨关节炎诊治指南(2007版)中的膝骨关节炎诊断标准^[6]。 ②年龄41-78岁。③X射线分级参照Kellgren-Lawrence的分级标准Ⅰ-Ⅳ级。④基本了解试验目的并能配合治疗者。

排除标准：①不符合上述纳入标准者。②重叠有其他风湿性疾病者。③合并有严重的心血管、脑血管、肺、肝、肾和血液系统原发疾病及精神病患者。④2个月内接受过激素治疗者。⑤孕妇或哺乳期妇女。⑥不合作者。

对照组：非骨关节炎患者12例滑膜组织为对照组，其中男7例，女5例，年龄13-34岁，平均年龄28.9岁，半月板损伤4例，交叉韧带损伤7例，胫骨平台骨折1例。

纳入标准：①单纯半月板损伤、交叉韧带损伤及胫骨平台骨折患者。②年龄13-34岁。③既往无膝骨关节炎病史。④基本了解试验目的并能配合治疗者。

排除标准：①不符合上述纳入标准者。②重叠有其他风湿性疾病及滑膜炎症者。③合并有严重的心血管、脑血管、肺、肝、肾和血液系统原发疾病及精神病患者。④2个月内接受过激素治疗者。⑤孕妇或哺乳期妇女。⑥不合作者。

试剂：细胞培养基DMEM购自Gibico公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司，胰酶购自碧云天生物制剂公司，总RNA提取试剂TRIzol购自北京TIANGEN公司，反转录Fernentas试剂盒购自北京TIANGEN公司。

方法：

成纤维样滑膜细胞培养：

成纤维样滑膜细胞原代培养：使用不加消化酶人工贴壁培养^[7]。将术中取出的滑膜组织在无菌条件下剪碎，D-Hank’s(含双抗)液浸泡并漂洗3遍，分离并去除混杂的脂肪组织和少量的肌肉组织，剪碎至1.0³ mm大小组织块，离心洗涤2次(2 500 r/min，离心6 min)，吸弃上清液，加入100 μL体积分数为100%的胎牛血清混匀，用吸管吸出并摆置入培养瓶中，每小块约相隔5 mm左右为宜。轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入3 mL含体积分数为20%胎牛血清的培养液，盖好瓶盖(松紧度以不影响气体进入瓶内为宜)，置于CO₂孵箱(37 ℃，体积分数为5% CO₂)贴壁生长，持续五六个小时后将培养瓶翻正，静置四五天后第1次换液，并在倒置显微镜下观察细胞生长及贴壁情况。下次更换培养液可根据培养瓶内液体颜色及细胞生长速度每三四天更换1次。

成纤维样滑膜细胞传代培养：待原代培养的滑膜细胞布满培养瓶底部85%-95%时即可进行传代培养，此次实验一般9-11 d符合传代。按1∶2或1∶3比例进行传代培养接种，此为第1代滑膜细胞。继续培养至布满瓶底85%-95%面积时，即可按1∶3比例再次进行传代培养。以下实验均用培养的第4代细胞。

总RNA样本制备：取对数生长期细胞，按照RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(DP419，TIANGEN公司)操作步骤进行提取。琼脂糖凝胶电泳确定总RNA质量；紫外分光光度仪测，A₂₆₀/A₂₈₀>1.8，检验总RNA纯度并计算其浓度符合实验要求。

总RNA反转录反应：应用反转录试剂盒Fernentas(北京TIANGEN公司)对总RNA进行反转录。根据试剂盒说明书，把所提取的总RNA短暂离心后，将 11 μL的DEPC水和RNA(1 μg)放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度达到0.5 g/L，再加入Oligo(dt)1 μL，轻轻混合均匀，短时间离心。最后按顺序加入：5×buffer 4 μL、核糖核苷酸酶抑制剂1 μL，10 mm dNTP MIX 2 μL，M-Mulu反转录酶1 μL，轻轻混合均匀，再短时间离心。最后将混合物置于42 ℃ 60 min。70 ℃加热5 min，中止上述反应并置于冰上。

实时荧光定量RT-PCR：

RT-PCR引物设计与合成：PCR引物由PrimerPremier 6.0设计引物，Oligo7评估引物，最后由上海生工合成引物(表1)。

荧光定量PCR反应：20 μL反应体系，包括模板cDNA 8 μL、FastStart Universal SYBRGreen Master(ROX) 10 μL、COX-2 mRNA/内参β-actin引物2 μL。反应条件：预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40个循环。每个标本有3个复孔。

数据处理：COX-2基因的相对表达量为采用2^-ΔΔCt 法计算，ΔCt= Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组样品-ΔCt对照组样品，相对表达量=2^-ΔΔCt。当2^-ΔΔCt值>1.0认为表达增高，<1.0认为表达降低，=1.0认为表达无改变。

主要观察指标：观察实验组不同分期成纤维样滑膜细胞及对照组成纤维样滑膜细胞中的目的基因COX-2的扩增曲线、熔解曲线及表达量的差别。

统计学分析：所有实验数据均使用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理，采用配对样本的Wilcoxon秩和检验(双侧)，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

膝骨关节炎又称膝骨关节病、退行性膝关节病，是一种退行性关节疾患，主要表现为关节肿痛和不同程度的功能障碍，并最终导致功能丧失。在中国40-75岁以上人群患病率呈逐渐升高趋势，致残率约53%^[6]，是影响老年人活动的最常见原因。

骨关节炎的病因可分为原发性和继发性两大类型，原发性骨关节炎的发病原因至今仍未明确，其发生发展是一种长期、慢性、逐步退行的病理过程，涉及全身及局部许多因素，西医学认为构成关节的附属结构的综合病理变化是其主要的病理特征。早期研究认为^[10]，膝骨关节炎滑膜病变是关节内软骨病变和刺激所出现的继发性反应，从而引发患膝疼痛、肿胀。但越来越多研究表明膝骨关节炎存在滑膜炎症表现，可促进骨关节炎的发生与发展并影响骨关节炎的症状^[11]。在骨关节炎的早期，滑膜的增生和纤维化、分泌炎症介质和软骨降解酶，可能是骨关节炎发病的重要因素，随着骨关节炎的进一步发展，滑膜始终参与其病理过程^[12]。有学者根据现代成像技术已经证明滑膜炎病理改变在骨关节炎早期和晚期很普遍^[13]；滑膜炎逐渐也被公认为是骨关节炎病理生理学的重要特征。目前也有多数研究表明软骨自身的的损伤和其自身的机制对骨关节炎的形成起主要的作用，尤其当软骨进入凋亡的时候，是软骨自身的损伤机制起主要作用，但一旦在骨关节炎形成后，引起继发性滑膜炎时，滑膜炎便会替代软骨病变成为骨关节炎继续发展的主要因素，并相互影响，恶性循环。

滑膜的增生可能是关节内局限性炎症的病因所在。滑膜成纤维细胞产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，是引起临床症状的主要因素^[14]；随着滑膜细胞及血管数量增加，侵入软骨或骨组织，在持续分泌的各种炎症介质和细胞因子的作用下，最终导致关节和骨的破坏^[15]。临床实验证实：症状性骨关节炎患者比非症状者更普遍地合并中等或大量的关节渗液与滑膜增厚；且在膝部症状性患者中，滑膜肥厚与膝痛程度之间存在特定的相关性^[16]；有效的抑制滑膜的病变，能减少滑膜的炎症，亦可延缓原发性膝骨关节炎的进展^[17]。

近年来，随着分子生物学的飞跃发展，对骨关节炎的研究也有新的认识，有研究表明骨关节炎是多种基因共同作用的结果，对其中相关的关键分子的深入研究能进一步认识骨关节炎的发病机制^[18]。

研究证实，COX-2在关节炎或其他疾病的病理生理过程中起着多元的作用角色，是许多新型非类固醇抗炎药物及癌症的主要作用靶点^[19]。COX-2是前列腺素合成的关键酶，在病理情况下，COX-2可被诱导催化生成大量前列腺素，参与炎症反应；产生疼痛、水肿及损伤等^[20]。由于COX-2的高表达与炎症和疼痛有关，对COX-2的抑制作用越强，抗炎作用就越强^[21]。因此，抑制滑膜成纤维细胞COX-2的表达和合成，是治疗骨关节炎的重要环节之一。舒强等^[22]研究发现在无炎症介质激活时，骨关节炎成纤维样滑膜细胞在体外未表现出高增殖潜能，使用高剂量的艾拉莫德可对细胞的增殖分化及表达有直接抑制作用，能降低滑膜炎症反应并通过此机制对骨关节炎滑膜炎进行免疫调节。王虹虹等^[23]通过核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸可降低肿瘤坏死因子α诱导的滑膜细胞中核因子κB的转录活性，抑制其下游因子COX-2基因的表达，从而达到治疗骨关节炎的目的。siRNA是一种干扰型RNA，能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2mRNA表达和COX-2蛋白的合成，特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达^[24]。以上的研究都表明COX-2基因实际存在于关节成纤维样滑膜细胞里，并影响骨关节炎症的发生、发展。然而，在骨关节炎的发展过程中，特别是不同分期的骨关节炎之间，COX-2基因表达的差异尚不清楚，目前也没有相关的研究。因此，阐明不同分期骨关节炎滑膜细胞中COX-2基因表达量的差异对进一步深入了解骨关节炎的发生与发展，以及滑膜细胞在这一过程中的作用，具有重要的理论意义和临床诊疗指导意义。

实时荧光定量RT-PCR具有快速、灵敏度高、有操作简单、重复性好、污染率低的优点。本研究结果显示COX-2mRNA在所有的成纤维样滑膜细胞中均有表达，但非骨关节炎组与骨关节炎组患者之间、不同分期的骨关节炎滑膜细胞之间表达量存在明显差异：正常组成纤维样滑膜细胞呈低度表达或几乎不表达，但与骨关节炎组相比差异明显(P < 0.05)；而骨关节炎之间，早期组(Ⅰ-Ⅱ级)呈高表达状态，与中、晚期组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，中期组与晚期组间表达无明显差异(P > 0.05)。本研究从分子水平体现了COX-2基因表达跟不同分期的骨关节炎病变的关系，实验所得结果与原有的实验设计方案吻合，但目前未见有相关研究证明COX-2基因在不同分期的膝骨关节炎中表达的差异。该结果为进一步研究防治骨关节炎奠定了可靠的理论基础，下阶段将研究COX-2抑制剂对不同分期骨关节炎成纤维样滑膜细胞COX-2mRNA表达的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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