设计:病例-对照观察。
时间及地点:病例来自2011年4月至2013年3月在广西中医药大学第一附属医院骨科就诊的门诊及住院患者。
对象:样本总量为180例,其中病例组120例(含腰椎间盘突出症血瘀证60例及腰椎间盘突出症非血瘀证60例两个亚组)来自同期广西中医药大学第一附属医院骨科就诊的门诊及住院患者;健康对照组60例来自广西中医药大学职工、在校大学生及在医院健康体检中心进行常规体检的人群,且经体检结论为健康者。血瘀证组、非血瘀证组及健康组均于同期按民族、性别及年龄等基线资料所占频数相同匹配纳入,各组间性别、年龄等分布差异无显著性意义(P > 0.05)。
诊断标准[1-4]:①腰椎间盘突出症诊断标准:采用行业公认的国内诊断标准。②中医辨证(诊断)标准:根据国家中医药管理局1994年批准的《中华人民共和国中医药行业标准—腰椎间盘突出症的症候分类》及2002年中华人民共和国卫生制定的《中药新药治疗腰椎间盘突出症的临床研究指导原则》判定,分为血瘀证、寒湿证、肝肾亏虚、湿热证4型。
病例选择及纳入标准:①确诊为腰椎间盘突出症并中医辨证为血瘀证、寒湿证、肝肾亏虚及湿热证者。②年龄19-58岁。③无可查亲缘关系、向上追溯3代均为壮族或均是汉族的个体。
病例排除标准:①合并肝肾疾病、心脑血管、呼吸系统或精神病患者。②合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等。③患者拒绝参与本研究者。
健康组选择及纳入标准:①经体检结论为健康者。②近期无炎症感染。③年龄19-58岁。④无可查亲缘关系、向上追溯3代均为壮族或均是汉族的个体。
方法:
标本的采集:研究过程严格遵循受试者知情同意原则,向入选各组研究对象充分告知试验目的及意义,征得同意后采集清晨空腹静脉血2 mL,立即放入4 ℃冰箱静置 30 min,然后按3 000 r/min离心5 min,吸取血清,按每管100 μL分装,置-70 ℃冰箱保存。
血清样品处理:从-70 ℃冰箱中取出血清样品,置冰盒上融解;以10 000 r/min,4 ℃离心5 min。取上清10 μL与U9裂解液(9 mol/L Urea,2%CHAPS,50 mmol/L Tris-HCl,pH9.0)充分混匀,冰浴振荡孵育30 min后加入370 μL缓冲液(50 mmol/L NaAC,pH 4.0)稀释,血清的总稀释倍数为40倍。
蛋白质芯片的处理:预活化:将CM10蛋白质芯片装入生物芯片处理器(Bioprocessor),每孔加入200 μL缓冲液(50 mmol/L NaAC,pH4.0),置振荡器(MS1 Minishaker) 600 r/min震荡5 min,弃出液体,重复1次。孵育:在芯片处理器每孔中加入100 μL稀释后的的血清样品,置振荡器600 r/min,4 ℃震荡1 h,弃出液体。洗脱:每孔加入200 μL的结合缓冲液(50 mmol/L NaAc,pH 4.0),室温置振荡器600 r/min震荡5 min,弃出液体,重复1次。每孔加入 200 μL HPLC水,立刻弃出。加基质:拆开芯片处理器,取出芯片待干后,在每个加样孔上加SPA(0.5TFA,50% ACN)1 μL后上机测定。
质谱参数:利用SELDI-TOS-MS对处理好的蛋白质芯片CM10进行读取分析。用已知5个标准肽(Arg8-Vasopressin 相对分子质量 1 084.2,Somatostatin 相对分子质量 1 637.9,Bovine Insulin Beta-Chain 相对分子质量 3 495.9,Human Insulin 相对分子质量5 807.6,Hirudin BHVK 相对分子质量 7 033.61)对质谱仪进行广谱外标分子量校正,使得系统的质量偏差调整为0.1%。为避免基质峰对结果造成干扰,将相对分子质量为1 000以下的蛋白质峰滤去,读取范围为50 000,优化范围为2 000-10 000。芯片阅读的主要参数设置为:激光强度200、检测灵敏度为8。利用数字化操作平台,通过Ciphergen Pmteinchip 3.1软件辅助,程序性完成数据读取过程。
质控和重复性:蛋白质芯片CM10规格为A-H,每条芯片可检测8例样品。每条芯片在实验过程中均随机加入1个质控血清样品(购自北京德易检验医学中心),得出的蛋白表达谱平均CV<10%。
主要观察指标:①腰椎间盘突出症血瘀证血清差异表达蛋白及其诊断模型的建立。②腰椎间盘突出症血瘀证血清诊断模型的验证。
统计学分析:用Biomarker Wizard 3.1软件对资料数据进行统计学处理,由峰值强度反映组与组间具有相同质荷比(M/Z)蛋白质的含量差异,对采集图谱进行均一化处理,去噪平滑,过滤信噪比小于5的蛋白峰。所有数据均经SPSS 16.0统计软件包处理,对血瘀证组、非血瘀证组、健康者3组进行方差分析,P < 0.05为差异有显著性意义。初步筛选出的差异蛋白峰,采用BioMarker Pattern 5.0(用的是决策树方法对目标对象进行分类)对数据分组及建立蛋白质峰分类决策树诊断模型,评价该模型的感敏性及特异性。