成肌细胞体外培养-力学刺激模型与周期性张应力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (5): 669-674.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.003

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成肌细胞体外培养-力学刺激模型与周期性张应力的影响

张强¹，王洪玲²，丁弦¹，夏晨蕾¹，刘丽娟³，王爽玉¹，李建平¹，贺苗¹，孙文娜¹，阎潇¹，刘文¹，张月¹，姚如永⁴，袁晓¹

¹青岛大学医学院附属青岛市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266071；²泰安市口腔医院，山东省泰安市 271000；³潍坊市人民医院口腔科，山东省潍坊市 261000；⁴青岛大学医学院附属医院中心实验室，山东省青岛市 266003

修回日期:2014-01-15 出版日期:2014-01-29 发布日期:2014-01-29
通讯作者: 袁晓，教授，硕士生导师，青岛大学医学院附属青岛市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266071
作者简介:张强，男，1987年生，山东省淄博市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事牙颌面畸形的矫治及其机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31170891)

Effects of cyclic stretch on in vitro culture-tensile stimulation models of myoblasts

Zhang Qiang¹, Wang Hong-ling², Ding Xian¹, Xia Chen-lei¹, Liu Li-juan³, Wang Shuang-yu¹, Li Jian-ping¹, He Miao¹, Sun Wen-na¹, Yan Xiao¹, Liu Wen¹, Zhang Yue¹, Yao Ru-yong⁴, Yuan Xiao¹

¹Center for Stomatology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China; ²Taian Stomatology Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China; ³Department of Stomatology, Weifang Municipal People’s Hospital, Weifang 261000, Shandong Province, China; ⁴Central Laboratory, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Revised:2014-01-15 Online:2014-01-29 Published:2014-01-29
Contact: Yuan Xiao, Professor, Master’s supervisor, Center for Stomatology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Zhang Qiang, Studying for master’s degree, Center for Stomatology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31170891

摘要/Abstract

摘要：

背景：内质网应激参与多种疾病的发生发展过程，如动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病，GRP78是内质网应激的标志蛋白，GRP78的表达水平反映内质网应激的程度。

目的：研究周期性张应力对L6大鼠成肌细胞GRP78表达的影响，以明确周期性张应力与内质网应激的关系。

方法：在成功构建L6大鼠成肌细胞体外培养力学刺激模型的基础上，采用RT-PCR和Western blot法分析周期性张应力对GRP78 mRNA和蛋白表达的影响。加力组分别给予 1，6，12，24 h的力学刺激，加载频率为10 cycles/min，拉伸变形幅度为15%。对照组与实验组在同时种板，不给予力刺激。

结果与结论：GRP78 mRNA随着加力时间的延长呈一致上升趋势，与对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.05)；GRP78蛋白在加力1 h后，蛋白表达量开始升高，加力6 h后蛋白表达量显著升高，到24 h达到峰值，与对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.05)。由以上结果得出，在一定时间范围内，周期性张应力可引起内质网应激，并且随着时间的延长逐渐增强；持续的应力刺激，可引起严重的内质网应激导致成肌细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, GRP78, 周期性张应力, 内质网应激, L6, 成肌细胞, 功能矫形, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Endoplasmic reticulum stress participates in the occurrence and development of many diseases, such as atherosclerosis, diabetes, and Alzheimer’s disease. GRP78 is a marker of endoplasmic reticulum stress. The expression of GRP78 reflects the degree of endoplasmic reticulum stress.

OBJECTIVE: To investigate the effect of cyclic stretch on GRP78 expression of L6 rat myoblasts, and to identify the relationship between cyclic stretch and endoplasmic reticulum stress.

METHODS: In vitro culture-tensile stimulation models of myoblasts of L6 rats were established successfully. The expression of GRP78 of myoblasts exposed to cyclic stretch was determined by reverse transcription-PCR and western blot assay. Stretch groups were subjected to 15% surface elongation at a frequency of 10 cycles per minute, over a period of 1, 6, 12 and 24 hours. Cells were simultaneously seeded on a plate in the control and experimental groups with no stimulation.

RESULTS AND CONCLUSION: The expression of GRP78 mRNA was continuously elevated over time after stretched treatment, and significant differences were detected as compared with the control group (P < 0.05). GRP78 protein expression began to increase at 1 hour after stretched treatment, was significantly increased at 6 hours, peaked at 24 hours, and significant differences were visible as compared with the control group (P < 0.05). In conclusion, cyclic stretch induced the occurrence of endoplasmic reticulum stress, which was enhanced with prolonged time. However, prolonged stretch caused severe endoplasmic reticulum stress and leaded to apoptosis of myoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: endoplasmic reticulum, myoblasts, apoptosis, immunoglobulin heavy chains, mechanics

中图分类号:

R318

张强，王洪玲，丁弦，夏晨蕾，刘丽娟，王爽玉，李建平，贺苗，孙文娜，阎潇，刘文，张月，姚如永，袁晓. 成肌细胞体外培养-力学刺激模型与周期性张应力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(5): 669-674.

Zhang Qiang, Wang Hong-ling, Ding Xian, Xia Chen-lei, Liu Li-juan, Wang Shuang-yu, Li Jian-ping, He Miao, Sun Wen-na, Yan Xiao, Liu Wen, Zhang Yue, Yao Ru-yong, Yuan Xiao. Effects of cyclic stretch on in vitro culture-tensile stimulation models of myoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(5): 669-674.

图/表（结果） 4

2.1 成肌细胞体外培养力学刺激模型的构建 对体外培养的成肌细胞加载频率相同但持续时间不同的周期性张应力，倒置相差显微镜下观察成肌细胞的形态学改变，有利于在体外深入研究应力对骨骼肌的力学效应。结果发现，加力后成肌细胞生长稳定无脱落，连续加力时，成肌细胞在周期性牵张应力作用下具有顺应应力方向改建的特性，并且随着加力时间的延长这种作用趋势越明显(图1)；随着加力时间的延长，可见凋亡细胞(细胞体积减小，染色质浓缩，染色质边集，可见凋亡小体形成)逐渐增多，上述结果证明：成肌细胞体外培养力学刺激模型构建成功，这为后续实验奠定了基础。

2.2 GPR78 mRNA在周期性张应力诱导下的表达变化 随加力时间延长，GRP78 mRNA的表达量呈一致上升趋势，并在加力24 h达到峰值，加力组与对照组(0 h)相比差异有显著性意义(图2，3)。上述结果提示：在周期性张应力下，大鼠成肌细胞发生内质网应激，并随着时间的延长内质网应激逐渐增强。

2.3 GPR78 蛋白在周期性张应力诱导下的表达变化 对照组L6细胞GRP78蛋白表达很弱，随着应力时间延长，GRP78蛋白表达水平开始增强，加力6 h后，GRP78蛋白表达水平显著升高，并在24 h达到峰值。加力组与对照组之间差异均有显著性意义(P < 0.05，图4，5)。上述结果提示：内质网应激，可能参与应力介导的L6成肌细胞凋亡的调控过程。综上所述，随着加力时间的延长，成肌细胞内质网应激越明显，应力引起了内质网应激，内质网应激可能参与了应力介导的成肌细胞凋亡。

参考文献

[1] Owtad P, Potres Z, Shen G,et al.A histochemical study on condylar cartilage and glenoid fossa during mandibular advancement.Angle Orthod. 2011;81(2):270-276.

[2] Barnouti ZP, Owtad P, Shen G,et al.The biological mechanisms of PCNA and BMP in TMJ adaptive remodeling. Angle Orthod. 2011;81(1):91-99.

[3] 王昕,罗颂椒,周秀坤,等.功能矫形前伸下颌后幼年大鼠下颌前伸肌的组织化学研究[J].华西口腔医学杂志,1992,10(3):220-223.

[4] Yagci A, Uysal T, Kara S,et al.The effects of myofunctional appliance treatment on the perioral and masticatory muscles in Class II, Division 1 patients.World J Orthod. 2010;11(2): 117-122.

[5] Erdem A, Kilic N, Eröz B.Changes in soft tissue profile and electromyographic activity after activator treatment.Aust Orthod J. 2009;25(2):116-122.

[6] 倪琳,刘洪臣,徐娟,等. 功能矫形前伸青春期大鼠下颌对翼外肌Na+/K+-ATPase功能活性的影响[J]. 口腔颌面修复学杂志,2009,10(6):324-326.

[7] 黄宁,陈开云,罗颂椒. 青春期大鼠前伸下颌后浅层嚼肌细胞膜乙酰胆碱受体研究[J].华西口腔医学杂志,2008,26(4): 365-367.

[8] Cucina A, Fuso A, Coluccia P,et al. Nicotine inhibits apoptosis and stimulates proliferation in aortic smooth muscle cells through a functional nicotinic acetylcholine receptor.J Surg Res. 2008;150(2):227-235.

[9] 赵云罡,徐建兴.线粒体,活性氧和细胞凋亡[J].生物化学与生物物理进展,2001,28(2):168-171.

[10] Hikim AP, Lue Y, Swerdloff RS.Separation of germ cell apoptosis from toxin-induced cell death by necrosis using in situ end-labeling histochemistry after glutaraldehyde fixation. Tissue Cell. 1997;29(4):487-493.

[11] Strasser A, Huang DC, Vaux DL.The role of the bcl-2/ced-9 gene family in cancer and general implications of defects in cell death control for tumourigenesis and resistance to chemotherapy.Biochim Biophys Acta. 1997;1333(2):F151- F178.

[12] Liu J, Liu J, Mao J,et al.Caspase-3-mediated cyclic stretch-induced myoblast apoptosis via a Fas/FasL- independent signaling pathway during myogenesis.J Cell Biochem. 2009;107(4):834-844.

[13] So J, Warsh JJ, Li PP.Impaired endoplasmic reticulum stress response in B-lymphoblasts from patients with bipolar-I disorder. Biol Psychiatry. 2007;62(2):141-147.

[14] Wei J, Rahman S, Ayaub EA,et al.Protein misfolding and endoplasmic reticulum stress in chronic lung disease.Chest. 2013;143(4):1098-1105.

[15] Wang Q, He Z, Zhang J,et al.Overexpression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 and GRP78 in human lung cancer tissues and its significance.Cancer Detect Prev. 2005;29(6):544-551.

[16] Matsumoto H, Miyazaki S, Matsuyama S,et al.Selection of autophagy or apoptosis in cells exposed to ER-stress depends on ATF4 expression pattern with or without CHOP expression.Biol Open. 2013;2(10):1084-1090.

[17] Yoshida H, Okada T, Haze K,et al.ATF6 activated by proteolysis binds in the presence of NF-Y (CBF) directly to the cis-acting element responsible for the mammalian unfolded protein response.Mol Cell Biol. 2000;20(18):6755-6767.

[18] Safra M, Ben-Hamo S, Kenyon C,et al.The ire-1 ER stress-response pathway is required for normal secretory-protein metabolism in C. elegans.J Cell Sci. 2013; 126(Pt 18):4136-4146.

[19] Jaasma MJ, Jackson WM, Tang RY,et al.Adaptation of cellular mechanical behavior to mechanical loading for osteoblastic cells.J Biomech. 2007;40(9):1938-1945.

[20] Brunig M.Numerical simulation of the large elastic-plastic deformation behavior of hydrostatic stress-sensitive solids. International Journal of Plasticity,1999;15(11):1237-1264.

[21] Liu J, Wang Y, Yuan X,et al.Cyclic-stretch induces the apoptosis of myoblast by activation of Caspase-3 protease in a magnitude-dependent manner.Int J Biochem Cell Biol. 2010; 42(12):2004-2011.

[22] Tetsunaga T, Furumatsu T, Abe N,et al.Mechanical stretch stimulates integrin alphaVbeta3-mediated collagen expression in human anterior cruciate ligament cells.J Biomech. 2009;42(13):2097-2103.

[23] Brink NG, Spragg JH, Roberts DB.The binding of antibodies to Drosophila embryonic cells and their effect on in vitro cell differentiation.Cell Differentiation.1981;10(3):183-191.

[24] Du J, Zhou L, Chen X,et al.IFN-γ-primed human bone marrow mesenchymal stem cells induce tumor cell apoptosis in vitro via tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand.Int J Biochem Cell Biol. 2012;44(8):1305-1314.

[25] Yasuharu Yamazaki,Koichi Nakakuki, Masahiko Ozeki,et al. Multidisciplinary Treatment for Correction of Malocclusion due to Maxillofacial Deformity from Fractures: a Report of 2 Patients.Asian Journal of Oral and Maxillofacial Surgery.2009; 21(3-4):114-119.

[26] Chen Y, Liu CP, Xu KF,et al.Effect of taurine-conjugated ursodeoxycholic acid on endoplasmic reticulum stress and apoptosis induced by advanced glycation end products in cultured mouse podocytes.Am J Nephrol. 2008;28(6): 1014-1022.

[27] 谭家莉.应力条件下成肌细胞增殖、分化和凋亡的调控及其分子机制的探讨[D].西安:第四军医大学, 2010.

[28] Hiyama S, Ono PT, Ishiwata Y,et al.Neuromuscular and skeletal adaptations following mandibular forward positioning induced by the Herbst appliance.Angle Orthod. 2000;70(6): 442-453.

[29] 阎潇,李菲菲,刘丽娟,等. 核转录因子κB信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用[J].中国组织工程研究,2012,16(24): 4441-4446.

[30] Yoshida H.ER stress and diseases.FEBS J. 2007;274(3): 630-658.

[31] Daugaard M, Rohde M, Jäättelä M.The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions.FEBS Lett. 2007;581(19):3702-3710.

[32] Yu F, Feng J, Harada JN,et al.B cell terminal differentiation factor XBP-1 induces reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.FEBS Lett. 2007;581(18): 3485-3488.

[33] Okamoto A, Koike M, Yasuda K,et al.Maintaining ATP levels via the suppression of PERK-mediated rRNA synthesis at ER stress.Biochem Biophys Res Commun. 2010;394(1):42-47.

[34] Chen WT, Zhu G, Pfaffenbach K,et al. GRP78 as a regulator of liver steatosis and cancer progression mediated by loss of the tumor suppressor PTEN.Oncogene. 2013. doi: 10.1038/onc.2013.437. [Epub ahead of print]

[35] Roller C, Maddalo D.The Molecular Chaperone GRP78/BiP in the Development of Chemoresistance: Mechanism and Possible Treatment.Front Pharmacol. 2013;4:10.

[36] Brewer JW.Regulatory crosstalk within the mammalian unfolded protein response.Cell Mol Life Sci. 2013. [Epub ahead of print]

[37] Duan X, Zhou Y, Teng X,et al.Endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis is activated in vascular calcification.Biochem Biophys Res Commun. 2009;387(4): 694-699.

[38] Friedman AD.GADD153/CHOP, a DNA damage-inducible protein, reduced CAAT/enhancer binding protein activities and increased apoptosis in 32D c13 myeloid cells.Cancer Res. 1996;56(14):3250-3256.

[39] Chen YY, Sun LQ, Wang BA,et al.Palmitate induces autophagy in pancreatic β-cells via endoplasmic reticulum stress and its downstream JNK pathway.Int J Mol Med. 2013; 32(6):1401-1406.

[40] Lien YC, Kung HN, Lu KS,et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress and activation of MAP kinases in beta-lapachone-induced human prostate cancer cell apoptosis.Histol Histopathol. 2008;23(11):1299-1308.

[41] Schroder M, Kaufman RJ.The mammalian unfolded protein response.Annu Rev Biochem. 2005;74:739-789.

[42] Ohyama H, Yamada T, Ohkawa A,et al.Radiation-induced formation of apoptotic bodies in rat thymus.Radiat Res. 1985; 101(1):123-130.

引言

功能矫形治疗是现代口腔正畸医学用于矫治生长发育期、生长发育高峰期前儿童及青少年错颌畸形的一种有效治疗手段，但其机制尚不十分明确。研究发现，在功能矫形治疗过程中下颌前伸时可以有效刺激下颌髁突的生长^[1-3]，进而使口周围肌和咀嚼肌系统也发生形态与功能的适应性改建^[4-6]，最终达到功能矫形的目的。深入研究功能矫形的机制，必须从微观层次开始，研究发现，肌肉中存在一小群干细胞(成肌细胞，myoblast)，它们在应力条件下发生增殖、分化、凋亡等改变，在面颌部肌肉的适应性改建中发挥极其重要的作用，成肌细胞凋亡是目前研究的热点^[7-9]，前期研究已经证明：功能矫形治疗中应力诱导的成肌细胞凋亡时，不依赖经典的Fas/FasL凋亡途径^[10]。

细胞凋亡广泛存在于多细胞生物的各种组织中，是细胞内的一个积极主动的程序性生理过程，死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途(内源性途径)是细胞内两条经典的凋亡途径，内质网应激是近年来发现的一条新途径^[11]。内质网在真核细胞的蛋白质合成、折叠和分泌的过程中起着极其重要的作用。当细胞内外环境的改变引起内质网内未折叠或错误折叠蛋白质聚集，钙稳态失衡，从而导致内质网功能紊乱，发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。为了减轻内质网应激，真核细胞激活一系列自身保护机制，称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)^[12]。

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78 ku， GRP78)又称为免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip)^[13]，是一种重要的内质网伴侣蛋白。无应激时，GRP78与内质网表面的3个感受蛋白PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase)^[14]、ATF-6 (activating transcription factor 6)^[15]、IRE-1 (inositol-requiring kinase 1)结合^[16]，其中PERK是一个内质网Ⅰ型跨膜蛋白，属于eIF-2α蛋白激酶家族成员，N端感受ER 应激信号；ATF6 是内质网上Ⅱ型跨膜蛋白，哺乳动物细胞有ATF6α(90 ku)和ATF6β(110 ku)两种亚型，具有内质网腔内区、跨膜区和胞质区3 个结构域；需肌醇酶(IRE-1)是内质网应激状态下激活的一种重要的Ⅰ型跨膜蛋白激酶受体。当发生内质网应激时，伴侣蛋白与感受蛋白解离，参与未折叠蛋白反应，从而缓解内质网应激；但是，持续或严重的内质网应激可触发内质网凋亡信号通路，引起细胞凋亡。本实验在构建L6大鼠成肌细胞体外培养力学刺激模型的基础上，应用自主研发的应力加载系统^[17-18]，对成肌细胞在不同作用时间施以引起凋亡最明显的力^[19-22]，研究成肌细胞在不同应力刺激时间下GRP78的表达，从而揭示应力刺激与内质网应激的关系。

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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2013年4至9月在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。

材料：

实验细胞：L6大鼠成肌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

实验方法：

L6大鼠成肌细胞株的培养：将成肌细胞按1×10⁷ L^-¹的浓度接种于细胞培养瓶中，加入含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液(含100 U/mL的青霉素/链霉素)，置于CO₂孵箱(37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂、体积分数为95%空气)中培养，每2 d换液1次，每三四天传代1次。

成肌细胞体外培养-力学刺激模型的构建：取传至第3代生长良好的L6大鼠成肌细胞，胰酶消化后吹散，以 3×10⁸ L^-¹的浓度接种于Ⅰ型胶原包被的BioFlex 6孔细胞培养板上，每孔加2 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24-48 h后，将生长培养基换为低浓度培养基(含体积分数为3%胎牛血清的DMEM培养液)继续培养1 d，让细胞充分融合(细胞融合接近85%)，并同步化，避免细胞融合对实验结果的影响。

将细胞分为加力组(1，6，12，24 h)和对照组，待细胞同步化后加力组以10 cycles/min的加载频率(每一循环包括3 s的牵张和3 s的放松)和15%的细胞拉伸变形幅度进行培养。对照组与实验组都在同一孵箱内进行培养，对照组不加力。实验组与对照组同时种板，各重复3次。

RT-PCR 检测GRP78 mRNA的表达情况：RT-PCR采用Trizol试剂盒提取各组细胞的组织总RNA，检测A₂₆₀/A₂₈₀值进行RNA定量，利用反转录试剂盒合成cDNA，反转录反应体系为：37 ℃、15 min；85 ℃， 5 s，以各组cDNA 为模板进行PCR 检测。GAPDH引物序列：上游5’-TAT GAC AAC TCC CTC AAG AT-3’，下游5’- GAT CCA CAA CGG ATA CAT T-3’；GRP78 引物序列：上游5’-ATT TCA CAG CCA GCC TTC TTA CT-3’，下游5’-CAT TTT GTC CTT CTC TGC TTC AG-3’， PCR反应体系：95 ℃、5 min，1个循环；95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、50 s，37个循环；72 ℃、10 min。每个样本取3 μL PCR 产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用Quantity One图像分析软件，扫描凝胶中各条带灰度值，测量3次取平均值，以GAPDH mRNA 为参考进行标准化处理，计算并比较各组目的基因的表达量。

Western Blot免疫印迹检测GRP78蛋白的表达情况：使用RIPA裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100，现配现用)提取总蛋白，BCA法蛋白定量，各组取等量蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，电转移至PVDF膜上，室温下以封闭液封闭PVDF膜1 h，与兔抗大鼠GRP 78、小鼠抗大鼠GAPDH抗体(1∶500) 4 ℃孵育过夜，用PBST冲洗3遍，每遍10 min，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠IgG (1∶1 000)室温下孵育2 h，用PBST冲洗3遍，每遍 10 min，将PVDF膜放入计算机显影仪中，观察、拍照并保存，照片经扫描后应用Bio-rad凝胶成相系统采集GRP78及GAPDH蛋白免疫印迹图像，Quantity one图像分析软件进行灰度分析，目的条带与内参照条带的比值表示GRP78的相对表达量。

主要观察指标：①细胞形态学观察。②周期性张应力作用下内质网应激标志蛋白GRP78 mRNA的表达情况。③周期性张应力作用下内质网应激标志蛋白GRP78蛋白的表达情况。

统计学分析：每一个样本重复3次，采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计处理，实验结果以x(_)±s表示，对RT-PCR及Western Blotting免疫印迹数据进行方差分析和配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

口腔颌面部的畸形严重影响患者的身心健康和家庭幸福，功能矫形治疗成为重要的治疗手段^[23-24]。功能矫形通过矫治器牵拉引起肌肉收缩，将力学信号传递到牙、牙弓及颌骨等需要矫治的部位，同时使功能过度或功能不足的肌肉恢复正常，引导口颌系统正常生长发育。在矫形治疗中，肌肉组织不仅是力传导的主要器官，同时当肌肉完成适应性改建，并与硬组织的形态改建相协调，才能保持疗效，防止复发^[25-26]。由此可见，正畸治疗正是通过施加生物力的作用来引起肌肉形态和功能的改变，但其机制尚不明确，成肌细胞如何感受这种力学信号并发生适应性改建成为当今研究的热点^[27]。内质网应激是一条新兴的信号通路，内质网应激参与多种疾病的发生发展过程，如动脉粥样硬化，糖尿病，阿尔茨海默病^[28]。研究周期性张应力是否能引起内质网应激以及内质网应激是否参与应力介导的成肌细胞凋亡对于揭示功能矫形的分子机制具有重要的价值。

GRP78蛋白属于热休克蛋白70(heat shock protein70， Hsp70)家族的一员^[29-31]。热休克蛋白70家族分子具有保守的结构域，即N端ATP酶功能域、蛋白酶敏感域、C端多肽结合域以及可变区，但是人GRP78分子在其N 末端还另含有内质网定位信号肽，因此GRP78分子主要分布于细胞内质网上。GRP78是一种重要的内质网伴侣蛋白，在内质网应激过程中起着极为重要的作用，主要有两方面：①作为内质网伴侣分子调节蛋白的折叠并防止蛋白的聚积^[32]。②通过与内质网表面的感受蛋白(ATF-6，PERK，IRE-1)调节未折叠蛋白反应^[33-35]。GRP78在生理情况下存在于真核生物的细胞内质网膜上，当内质网应激时，未折叠和错误折叠的蛋白增多，GRP78经跨膜运动从内质网膜释放，从而激活ATF-6，PERK和IRE-1，其中ATF6通过内质网应激基因启动子ERSE元件，诱导应激基因的转录表达，活化的PERK 能特异性的磷酸化eIF-2α，使蛋白翻译水平下降，下调胞内蛋白合成的整体水平，而IRE-1则其与Bip分离形成二聚体而被激活，一旦被激活就会启动非正常的剪接反应，来缓解细胞内的应激状况。内质网应激时，细胞通过以上3条途径共同促进未折叠蛋白的转运和错误折叠蛋白的降解，从而缓解内质网应激^[36]；但是严重或持续的内质网应激则会引起细胞凋亡^[37]。内质网应激诱导的凋亡途径主要有3条：CHOP (growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153)通路，JNK(c-Jun NH2-terminal kinase)通路和Casepase-12通路^[38-40]。GRP78在内质网应激的过程中发挥着极为重要的作用，因此，GRP78被广泛的用作内质网应激和未折叠蛋白反应的标志分子^[41]。

本研究采用RT-PCR和Western blot方法检测分析周期性张应力刺激对内质网应激标志分子GRP78 mRNA 和蛋白表达的变化，初步探讨内质网应激与周期性张应力诱导成肌细胞凋亡的关系。结果显示：①倒置相差显微镜观察显示，随着应力加载时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增加^[42]，说明周期性张应力引起了细胞凋亡且呈时间依赖趋势。②加力0 h GRP78 mRNA表达量低，随着加力时间的延长，GRP78 mRNA逐渐升高，GRP78 mRNA是内质网应激的标志性因子，其表达水平的高低反映内质网应激的程度，此实验结果说明应力引起内质网应激，并且随着时间的推移逐渐增强。③在加力1 h，GRP78蛋白表达升高不明显，从6 h开始显著升高，并在24 h达到峰值，提示可能是在加力6 h以内，应力引起的内质网应激较缓和，成肌细胞通过自身的调节可缓解内质网应激，但是当持续的应力引起严重的内质网应激，可能引起GRP78的表达增加并有大量GRP78从内质网表面解离，从而激活未折叠蛋白反应，进而激活内质网应激的凋亡通路导致成肌细胞的凋亡，但其凋亡机制有待进一步深入研究。

综上所述，对大鼠成肌细胞给以持续的周期性张应力，GRP78的表达明显增强。本研究证明：周期性张应力可诱导大鼠成肌细胞发生内质网应激，且内质网应激的程度随着时间的延长逐渐增强。以上结果提示：内质网应激参与了功能矫形过程中应力引起的面颌肌细胞的适应性改建，为继续深入研究面颌肌细胞适应性改建的分子机制奠定了基础。但内质网应激的凋亡通路是否也参与了周期性张应力介导的成肌细胞凋亡，尚需进一步深入研究。

成肌细胞体外培养-力学刺激模型与周期性张应力的影响

Effects of cyclic stretch on in vitro culture-tensile stimulation models of myoblasts

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[1]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[2]	杨新华, 闫银弟, 罗旭光, 杨艳萍, 李海荣, 崔慧林, 曹锡梅. 钟基因Bmal1、Clock参与调节骨骼肌的发育分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3130-3137.
[3]	税晓平, 李春莹, 曹艳霞, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠周围神经内质网应激相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1693-1698.
[4]	张煦坚, 赵振群, 刘万林. 激素性股骨头缺血坏死发病机制中的内质网应激[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1759-1765.
[5]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[6]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[7]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[8]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[9]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[10]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[11]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[12]	刘群, 孙东东, 高丽兰, 何志江, 孙明林. 经皮椎体后凸成形后再发骨折相关因素的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 976-984.
[13]	和雨洁, 王海燕, 李志军, 李筱贺, 蔡永强, 戴丽娜, 许阳阳, 王一丹, 徐雪彬. 学龄期儿童胸椎经“椎弓根-肋骨”单元内固定的数字化测量[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 869-876.
[14]	严舒, 卢岩, 欧阳昭连. 中国组织工程领域2013至2018年国家自然科学基金资助项目分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 731-735.
[15]	宋世雷, 陈跃平, 章晓云. PI3K/AKT信号通路调控股骨头坏死的相关机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(3): 408-415.