木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 177-182.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.003

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木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描

汪宗保^{1, 2, 3}，徐亚林¹，廖威明²，陆晴友⁴，陈朝晖³，吴向阳³，孙旭³，段文秀³，鲍永军³，代月兰³

1中山大学博士后流动站开平市中心医院科研基地，广东省开平市 529300；2中山大学附属第一医院骨科，广东省广州市 510080；3安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽省合肥市 230038；4同济大学附属东方医院创伤外科，上海市 200120

收稿日期:2013-10-30 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 徐亚林，教授，硕士生导师，中山大学博士后流动站开平市中心医院科研基地，广东省开平市 529300 并列通讯作者：廖威明，教授，博士生导师，中山大学附属第一医院骨科，广东省广州市 510080
作者简介:汪宗保，男，1973年生，安徽省枞阳县人，汉族，中山大学博士后，主治医师，主要从事关节软骨、骨科运动医学及康复医学的研究。
基金资助:
中国博士后科学基金(2011M501355)

Cartilage surface of early osteoarthritis in rats induced by papain under scanning electron microscope

Wang Zong-bao^{1, 2, 3}, Xu Ya-lin¹, Liao Wei-ming², Lu Qing-you⁴, Chen Zhao-hui³, Wu Xiang-yang³, Sun Xu³, Duan Wen-xiu³, Bao Yong-jun³, Dai Yue-lan³

1Science Research Base of Kaiping City Central Hospital, Postdoctoral Mobile Station of Sun Yat-sen University, Kaiping 529300, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics, the First Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 3Clinical School of Acupuncture and Orthopaedics, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, Anhui Province, China; 4Department of Traumatic Surgery, East Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200120, China

Received:2013-10-30 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Xu Ya-lin, Professor, Master’s supervisor, Science Research Base of Kaiping Central Hospital, Postdoctoral Mobile Station of Sun Yat-sen University, Kaiping 529300, Guangdong Province, China Liao Wei-ming, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080 Guangdong Province, China
About author:Wang Zong-bao, M. D., Attending physician, Science Research Base of Kaiping Central Hospital, Postdoctoral Mobile Station of Sun Yat-sen University, Kaiping 529300, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, the First Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; Clinical School of Acupuncture and Orthopaedics, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230086, Anhui Province, China
Supported by:
Postdoctorate Science Foundation in China, No. 2011M501355

摘要/Abstract

摘要：

背景：木瓜蛋白酶注射建立骨性关节炎动物模型是用于骨关节炎防治研究的常用方法之一。
目的：观察木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射诱导大鼠膝早期骨关节炎进程中扫描电镜下软骨表面形态学变化。
方法：2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸按2∶1比例混匀，取0.15 mL注射至SD大鼠右膝关节腔诱导骨关节炎模型，左膝注射等量生理盐水为对照组，另取2只4膝不做处理为正常对照组，于注射后第2，4，6周后分别使用扫描电镜观察股骨内侧髁关节软骨表面形态学变化。
结果与结论：正常和对照组可见表面分布较均匀的浅坑。木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射2周后大鼠软骨表面出现凹凸不平，皱缩扭曲变形；4周表面变薄，局部出现小裂纹；6周出现深大裂纹，软骨缺损。提示2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸混合注射诱导的早期骨关节炎模型的时间节点可以定在4-6周。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 骨关节炎, 关节软骨, 木瓜蛋白酶, 半胱氨酸, 电镜, 软骨表面

Abstract:

BACKGROUND: Osteoarthritis animal models induced by papain are commonly used for studying osteoarthritis.
OBJECTIVE: To observe the morphology of articular cartilage surface during early osteoarthritis process in rats induced by papain and L-cysteine under scanning electron microscope.
METHODS: The right knees of Sprague-Dawley rats were given 0.15 mL mixed solution of 2% papain and 0.03 mol/L L-cysteine in the ratio of 2:1. The left knees were given injections of 0.15 mL 0.9% NaCl, as the control group. Another two rats (four knees) maintained untreated, as the normal control group. All the rats were observed with scanning electron microscope at 2, 4, 6 weeks after injection, to explore the surface morphology of medial condyle of femur.
RESULTS AND CONCLUSION: The condyles of normal and control groups revealed numerous shallow pits on the surface of articular cartilage. At 2 weeks after injection, the surfaces of condyles were unsmooth, presenting the shrinkage and distortion. The thinner articular cartilage and local tiny cracks were seen at 4 weeks. The deep and great cracks and cartilage defect were observed on the surface of cartilage at 6 weeks. The time of 4- 6 weeks is a reference point for establishing early osteoarthritis model in rats through injections of 2% papain and 0.03 mol/L L-cysteine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoarthritis, papain, L-cysteine, cartilage, articular

中图分类号:

R318

汪宗保，徐亚林，廖威明，陆晴友，陈朝晖，吴向阳，孙旭，段文秀，鲍永军，代月兰. 木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 177-182.

Wang Zong-bao, Xu Ya-lin, Liao Wei-ming, Lu Qing-you, Chen Zhao-hui, Wu Xiang-yang, Sun Xu, Duan Wen-xiu, Bao Yong-jun, Dai Yue-lan. Cartilage surface of early osteoarthritis in rats induced by papain under scanning electron microscope[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 177-182.

图/表（结果） 1

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引言

骨关节炎是一种退行性病变，是临床的一种常见疾病，主要由于年老、肥胖、劳损、创伤等诸多因素引起的关节软骨退变性损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。随着人口老龄化的上升，必然出现较多的该类疾患，开展如何控制和延缓骨关节炎发生发展的相关研究有着重大的价值。

事实证明，骨关节炎早期阶段是临床对于骨关节炎预后最寄予希望的治疗阶段。如果早期损坏的软骨可以修复逆转对根治和防止骨关节炎的进一步发展有着至关重要的意义。关节软骨表面形态的改变是骨关节炎的重要证据之一。建立哺乳动物骨关节炎模型是研究该疾病的关键步骤，木瓜蛋白酶注射建立骨性关节炎动物模型是常用的方法之一。

文章所描述的骨性关节炎模型为木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射诱导，该模型已有不少研究报道诱导成功后的干预性研究^[1-2]，也有诱导进程中组织化学、组织病理学、光镜、透射电镜观察切片中的细胞特点的研究^[3-5]。但是利用扫描电镜观察软骨表面的变化文献报道极少^[6-8]。

目前这些研究尚未见到有关扫描电镜对骨性关节炎发展进程的表述。实验基于对软骨表面进行环境扫描电镜观察，探讨2%浓度的木瓜蛋白酶诱导大鼠早期骨关节炎过程中关节软骨表面形态的变化特点，以期在大体观察到软骨大量破坏之前寻找骨关节炎早期状态的节点模型依据，以期为骨关节炎的早期干预研究提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年8至12月在安徽中医药大学针灸经络研究所动物实验室完成。

材料

实验动物：健康8周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠8只，体质量330-350 g，由安徽医科大学动物实验中心提供。

动物分组：8只大鼠分2组：一组2只不干预，正常活动，左、右膝关节共4侧膝关节；另一组6只左膝注射生理盐水(对照组)，右膝注射药物(实验组)，各6侧膝关节。饲养环境：分笼饲养于实验室大鼠专用自动送风系统鼠笼内，进食及饮水符合实验动物标准。

木瓜蛋白酶诱导大鼠膝骨关节软骨表面的电镜扫描实验所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸	美国Sigma公司生产
环境扫描电子显微镜(XL30 ESEM-TMP)	荷兰飞利浦公司

2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液：称取适量木瓜蛋白酶和 L-半胱氨酸溶于生理盐水中，充分混匀后静置 30 min。

实验方法：

骨关节炎模型制备方法：预先在无菌条件下将木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸粉剂与生理盐水分别配成2%、 0.03 mol/L的浓度，储存于冰箱4 ℃冷藏室，实验时提前 4 h取出常温下放置。实验前将2%的木瓜蛋白酶、 0.03 mol/L的L-半胱氨酸按2∶1的比例混匀，半小时后进行膝关节腔注射(图1)，取大鼠的右后肢建立模型，对SD大鼠行1%氯胺酮腹腔注射(50 μg/g)麻醉后，仰卧位固定于木板上，剪去所要注射的膝关节腔周边1 cm区域的腿毛，络合碘消毒。将大鼠膝关节屈曲45°以髌骨下极白色髌腱外缘的膝眼为进针点，向髁间窝方向穿刺进针，抵达股骨髁后回撤2 mm，以1 mL注射器将混合液注射0.15 mL至右侧膝关节腔(实验组)，左侧膝关节腔注射0.15 mL生理盐水(对照组)。4 d后再重复注射1次。
观察方法：分别将注射药物后2，4，6周结束作为取材的时间节点，取材时按照注射药物时同样的麻醉方法，麻醉满意后剪毛，剪毛区域包括膝关节周围2 cm，消毒，铺洞巾。戴手套、口罩，将消毒好的器械在股骨远端上方0.8-1.0 cm处用咬骨钳将其咬断，将断端用刀切平以便作

为底部置于扫描的小支架上处于稳定状态，取材后用注射器以生理盐水反复冲洗软骨，大体观察软骨表面无污物。即可置于环境扫描电镜下，待放置标本的密闭暗室抽出一定程度的空气后，开始观察股骨内侧髁表面、摄片，即刻观察避免了以往文献中使用多种药物(戊二醛、乙醇等氧化剂)处理后对软骨表面脱水的影响^[7,9]。

扫描场所：中国科技大学力学实验室。

电镜工作方式：环境方式0.1-20 Torr。

主要观察指标：扫描电镜观察大鼠软骨表面的变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

从关节软骨形态结构的变化可以发现更多疾病所处的状态，了解关节软骨的结构对于理解骨关节病中的一些问题。哺乳动物的关节软骨表面形态已有文献说明^[10-39]，以往有许多方法被用来评价透明软骨的形态学^[40-42]。20世纪60年代随着扫描电子显微镜诞生，人们开始用来观察关节软骨表面形态学变化。
实验应用了环境扫描电镜，与常规扫描电镜有所不同，常规电镜需要对标本进行固定处理，环境扫描电镜其中的一个优势就是可以直接检测样本，而不需要物理化学固定技术，它提供了更理想的形态学图像^[43-47]。而且，放置标本的空间无需绝对的真空，因此，可以用来观察潮湿的标本，保存了湿度而无扭曲其本来面目，而还原标本的较真实状态^[48-50]。

环境方式下最适宜观察的生物样品应是那些表面有角质层覆盖的样品和含水量很低的样品，比如植物的叶片、动物中的昆虫、作物的籽粒等，这类样品易于保持新鲜度;环境方式下对样品的观察和图像的记录等操作应尽快完成，这样可减少样品内水分蒸发而使样品变形降至最低。

在环境扫描电镜的软骨观察历史发展中，有研究者对其进行了初步探索。Jurvelin等^[51]使用新西兰兔的髌骨借助环境扫描电镜描述了一个评估关节表面的形态学标准。但是，由于他们不能定量反应观察者之间和之外的差异性，后来被认为不具有有效性。而且，他们通过扫描电镜观察的评价标准并没有设计用来评价因不同样本保存手段所产生的表面变化，也没有包括由于样本固定方法可能产生有关假象的任何特征或符合条件的特征。

Hong和Henderson等^[52]改良了Jurvelin等^[51]的提出的评价标准目的是为了研究大鼠膝关节制动后髌骨软骨表面的变化，但是，他们也不能有效评价观察者之间或之内的差异性。

O’Connor等^[53]使用常规扫描电镜技术在低温下描述了狗的前交叉韧带切断后股骨髁的变化，尽管这些研究描述了可能暗示早期退变的变化情况，但是，他们没有使用一个有效的分类系统，所以，该表述也被认为是主观上的。曾经确实很少报道使用环境扫描电镜研究软骨组织^[54]。

目前实验动物中的骨性关节炎模型主要依赖手术、力学、化学反应等方式进行。木瓜蛋白酶或monosodium iodoacetat(MIA)用来改变关节的组织形态学^[55-57]，关节不稳定是部分半月板切除结合侧副韧带和交叉韧带交互切断的手术造模方法^[58-60]，挤压技术和制动技术也是用来在实验动物中让其关节长时间的固定于一种体位而造成退变性的骨性关节炎^[61]，等等，但是，这种方法所花的时间较长。而木瓜蛋白酶造成骨关节炎模型可以根据浓度对关节软骨的作用进行造模的时间控制，高浓度最短可以在数十小时内完成。

本实验是利用环境扫描电镜通过人们常用的骨关节炎木瓜蛋白酶诱导模型的建立方法从不同连续时间的发展节点探索早期骨关节炎的软骨表面变化依据，这一点较以往的研究存在一定的不同之处。

研究显示木瓜蛋白酶在动物关节腔内注射可引起迅速进展的骨性关节炎发生，时间短，重复性好，与人类骨性关节炎类似。

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，其引起骨性关节炎的机制被认为是分解软骨基质中蛋白多糖，去除软骨细胞膜上有丝分裂抑制因子，使蛋白多糖其从软骨基质中丢失。而研究者认为人类骨关节炎软骨最早发生的显著变化之一是水分的增加和蛋白多糖的减少。

研究表明木瓜蛋白酶在兔、豚鼠的颞颌关节、髋关节或膝关节腔内注射时可引起迅速进展的骨关节炎。

国外Havdrup等^[10]研究了高浓度20%木瓜蛋白酶溶液注射0.2 mL至兔膝关节2周后即可见关节软骨退变、成骨细胞活动、骨赘形成，另研究注射浓缩液后2 d见关节软骨退变，1周见骨赘形成。

国内韩冠英等^[5]研究了不同浓度组织病理、大体标本等比较观察，软骨退变程度具有浓度高低成正比关系。

鉴于以往文献中提及浓度和考虑骨性关节炎是一个慢性发病过程^[10-39]，作者选择了2%木瓜蛋白酶和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合液作为关节腔注射液。

据文献报道，有些观察表面形态结果存在一定的差别：垄、沟或圆形浅坑)及隆突^{[6-8, 40]}。实验中，电镜所观察到的软骨表面：生理盐水对照组与正常未干预组未见有明显的区别，软骨表面分布了大小、形态相似的浅坑，这与Clarke^[41]、Ghadially^[8]和戴国钢等^[40]所描述的结果类似，他们认为浅坑是位于其下的软骨细胞及其陷窝形成的，陷窝即是细胞存在的空腔及其周围的纤维，并认为未成年的动物会出现平行的沟垄出现，成年后被浅坑代替，本实验所用的是成年大龄大鼠。

实验结果观察到：从第1次注射2%木瓜蛋白酶和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合液2周后出现软骨表面皱缩扭曲垄沟，呈现出犹如坑洼凹凸不平的路面。并出现散在较多的微小圆颗粒样物质，这与药物的分解作用效应有关。当然，也不排除垄沟的存在，可能与所用环境扫描电镜未经多种药物处理而直接观察软骨表面的方法有关，与以往的某些研究有些争议，需要进一步比较。

实验中软骨表面随着时间的延长，到第4周后木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液的作用持续，使得软骨表面扭曲和皱缩垄沟消失，变平，软骨表面开始出现小的裂纹，撕裂代表着关节软骨的早期变性, 即关节软骨的结构和力学特征的改变, 并释放软骨分子引起免疫和炎性反应^[42]。到第6周后裂纹加深较大，增多，裂纹边缘胶原纤维有翻起，并出现了部分区域软骨缺损。而据此大体观察仍未能明显看出，给早期骨关节炎的定性提供了参照。

从实验结果看来，使用2%的木瓜蛋白酶和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合液4周后通过500倍的环境扫描电镜观察发现裂纹开始出现，也就是早期变性。到6周后扫描电镜下软骨裂纹较为明显，说明退变加重。据此，作者认为2%浓度的木瓜蛋白酶溶液造成早期软骨变性的时间节点在4周左右，6周较为明显，在4-6周的时间节点均可以作为早期骨关节炎的模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描

Cartilage surface of early osteoarthritis in rats induced by papain under scanning electron microscope

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