设计:整群抽样,1∶1配比的病例对照研究。
时间及地点:实验于2008年8月至2009年10月在新疆奎屯地区采样,样本检测在新疆生产建设兵团疾病预防控制中心检验科完成。
对象:在新疆生产建设兵团农7师123团和128团(改水前水氟含量3.4- 17.0 mg/L,曾经为氟中毒疾病高发区)选择氟暴露组人群。氟中毒诊断根据X射线拍片结合本人居住年限、自觉症状和临床体征,按2009年卫生部下发《饮水型地方性氟中毒监测方案(试行)》进行诊断。从自愿参与调查的人群中选择出11名轻度氟暴露者作为暴露组,男女不限,中位年龄(53.45±14.58)岁。
采用1∶1配比的病例对照研究方法(病区和非病区调查对象具有同性别、年龄相差不超过5岁、相近的生活饮食习惯,均为汉族)。在非病区新疆生产建设兵团农七师131团选择11名健康者作为非暴露组,中位年龄(57.86±12.12)岁。非暴露组为生活在非氟中毒病区10年以上。对于近期患有感冒、发热、感染者予以排除。
以往调查中发现的重度患者和中度患者,基本已经病逝或迁移至内地居住,故这次调查中未能收集到中、重度暴露者的血样。所有志愿者均当面签署了书面知情同意书。
测定暴露组和非暴露组外周血MCM3基因的表达及肝肾功能所用主要试剂和仪器:
方法:
血样的采集与保存:
外周血单个核细胞分离:外周静脉采血后,按照人淋巴细胞分离液说明书进行离心,分离细胞。离心后将白膜层细胞小心吸出,2 500 r/min,离心10 min后获得细胞团块。
保存单个核细胞:在沉淀的细胞团上加入10倍体积的RNAprotect® Cell reagent液体保护剂,用加样器吹打混匀后立即将样品于冰箱-18 ℃冷冻保存。运输过程中用冰袋、冰排覆盖样本,4 h内到达实验室并将样品置于-80 ℃超低温冰箱内贮存。
总RNA提取:分别取各组细胞,加入RNA提取液,按照说明书提取细胞总RNA,用试剂盒提取RNA后,在波长260,280 nm时,紫外可见分光光度计测定吸光度值(A)。当A260/A280比值在1.8-2.1时,表明没有污染。在1%的琼脂糖胶上观察28 s和18 s的亮度比值约为2∶1。取总RNA 1 µg,反转录合成cDNA,置于-70 ℃冰箱。
荧光定量PCR扩增:取cDNA 2 µL,与SYBR®GREEN Ⅰ染料反应,real-time RT-PCR仪上进行定量分析。反应体系:总反应体积25 µL,内含cDNA 2 µL,上、下游引物(20 pmol/L)各0.5 µL,SYBR®Premix Ex TaqTM 12.5 µL(2×),dH2O 9.5 µL。反转录后定量扩增MCM3基因。管家基因采用actin,管家基因和MCM3基因的引物序列及扩增片段大小和Tm值详见表1。以 HL60RNA(500 ng)反转录获得的cDNA作为标准品,用 EASYDilution分别按10倍梯度稀释(100,101,102,103,104倍)和作为模板,分别制作管家基因(Actin)和目的基因(MCM3)的标准曲线。每个样品设2孔,每次扩增均设对照。将反转录所得样品cDNA分别在管家基因、目的基因标准曲线上定量,并进行相对表达量分析。用样品的相对拷贝数与GAPDH相对拷贝数的比值表示基因表达结果。扩增完毕后,进行熔解曲线分析,检测产物的特异性。
计算相对表达量:以目的基因扩增片段灰度/β-actin基因扩增片段灰度比值,为该样品待测基因mRNA水平。
肝功、肾功测定:抽取暴露组和非暴露组的清晨空腹外周静脉血 5 mL,将采集的静脉血3 000 r/min离心 5 min后,吸取血清分装于Ep管中,-80 ℃保存, HITACHI7170A全自动生化分析仪上测定总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶、尿素、肌酐、尿酸水平。
统计学分析:在计算机上用SPSS 12.0统计软件对数据进行统计分析,计量资料方差齐时采用t 检验分析,方差不齐时采用秩和检验。