低结晶性碳酸磷灰石团块骨移植材料的合成及性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：作为优良的生物吸收性骨移植材料，碳酸磷灰石团块通常通过烧结过程来制备，然而，烧结过程中造成的碳酸含量流失将导致其生物吸收性明显下降，低于生体骨，从而影响新骨的生成。
目的：合成低结晶性碳酸磷灰石团块作为骨移植材料并研究其性能。
方法：通过氢氧化钙团块的碳酸化生成碳酸钙团块，浸泡在60 ℃、1 mol/L磷酸二氢铵盐溶液中1-14 d，并对各样本通过径向抗拉强度测试进行生物力学性能分析，通过X射线衍射分析、红外吸收光谱测定、扫描电子显微镜观察与碳酸含量、钙磷元素测定等进行理化性能分析。
结果与结论：结果发现，经过磷酸二氢铵盐溶液处理14 d后，碳酸钙已几乎完全转化成为结晶度较低的B型碳酸磷灰石；最终生成物的径向抗拉强度值为(10.27±1.08) MPa，满足骨缺损移植材料的机械强度要求；其碳酸含量为(4.80±0.50)%，与生体骨的碳酸含量极其接近；钙磷摩尔比为1.63±0.01，提示为贫钙型碳酸磷灰石。结果证实，实验将碳酸钙团块浸泡在60 ℃，1 mol/L的磷酸二氢铵盐溶液中，成功合成了具有足够强度的低结晶性B型碳酸磷灰石团块，方法简单可行。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 骨移植, 碳酸磷灰石, 碳酸钙, 磷酸二氢铵, 生物力学, 低结晶性

Abstract:

BACKGROUND: As a good candidate for bioresorbable bone graft, carbonate apatite monolith can be prepared by sintering procedure; however, sintering can cause carbonate loss and result in a much lower rate of biodegradation compared to the human bone, thereby influencing the formation of new bone.
OBJECTIVE: To fabricate low-crystallinity carbonate apatite monolith as bone graft and test its properties.
METHODS: Calcium carbonate monolith prepared by carbonation of Ca(OH)₂ monolith was treated in 1 mol/L ammonium dihydrogen phosphate solution at 60 ℃ up to 14 days. Diametral tensile strength was examined for biomechanical properties; X-ray diffraction analysis, Fourier transform infrared spectroscopy, scanning electron microscope observation and chemical analyses (carbonate, calcium and phosphate content) were also performed for physical and chemical properties.
RESULTS AND CONCLUSION: The calcium carbonate completely transformed into low-crystallinity B-type carbonate apatite after treated for 14 days. Diametral tensile strength of the final product was (10.27±1.08) MPa, which is adequate as a reconstruction material for bone defect. The carbonate content was (4.80±0.50)%, similar to that of the nature bone. The molar Ca/P was 1.63±0.01, indicating the Ca-deficient carbonate apatite is obtained. The present method allows an easy fabrication of low-crystallinity B-type carbonate apatite block with adequate strength and without sintering process.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, bone graft, carbonate apatite, calcium carbonate, ammonium dihydrogen phosphate, biomechanics, low-crystallinity

中图分类号:

R318

林欣，侯敏. 低结晶性碳酸磷灰石团块骨移植材料的合成及性能[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6067-3072.

Lin Xin, Hou Min. Fabrication and properties of low-crystallinity carbonate apatite monolith bone graft[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6067-3072.

图/表（结果） 4

2.1 碳酸钙样本径向抗拉强度 图1显示处理前及处理1，4，7，14 d后径向抗拉强度的变化。处理前样本的强度为3.3 MPa，处理2 d后的样本的径向抗拉强度开始增大直至14 d后达到(10.27±1.08) MPa。

2.2 碳酸钙试件超微结构 图2为经磷酸氢二铵溶液处理前及分别处理1，7，14 d后样本的表面与断面的扫描电镜照片，可见样本表面与断面的变化有明显差异。处理1 d后样本的表面可见较大片状结晶，但断面未见明显变化。处理7，14 d后，样本的表面可见针状结晶，而断面也可见微小的针状结晶。

2.3 各组样本X射线衍射分析结果 图3显示样本经过各时间处理后的X射线衍射测试结果。标志碳酸钙特征峰的(01-4)与(110)处峰值随着时间逐渐降低，而标志磷灰石峰值的(211), (112), (300)与(202)处在处理1 d后出现并随着时间逐渐增强，显示碳酸钙逐渐转化成为磷灰石，并在处理7 d后，基本完全转化。表1显示在反应过程中不同时间点生成的结晶相，并按生成量排序表示。处理1 d后，碳酸钙部分转化成二水磷酸氢钙(DCPD；CaHPO₄?2H₂O)与磷灰石，处理2 d后，同时有少量β-磷酸三钙(β-TCP；β-Ca₃(PO₄)₂)生成。处理4 d后，二水磷酸氢钙全部转化成磷灰石，磷灰石生成量大于碳酸钙，处理7 d后碳酸钙完全转化成磷灰石，虽然仍有微量β-磷酸三钙残留，主要是磷灰石。

2.4 傅里叶红外吸收光谱分析结果 图4显示以压片法测得的红外光谱图在1 450，1 410，875 cm^-1共3处可见B-CO₃基团的特征性增强峰，PO₄^3-被CO₃^2-所取代，说明最终生成物中含有B-CO₃基团。1 050，600，570 cm共3处可见PO₄^3-集团的特征性增强峰。 2.5 各样本化学组成分析结果 最终反应物的碳酸含量为(4.80±0.50)%，与骨矿物质的碳酸含量相符(4%-8%)，但偏低。钙磷摩尔比为1.63±0.01，提示为贫钙型碳酸磷灰石。反应前溶液的pH值为3.89，反应后增至6.20。

有学者采用湿化学法以四水硝酸钙、磷酸氢二铵和碳酸氢钙为原料制备出碳酸磷灰石粉体，将其压成块体后于自制的石英管式炉内通入湿二氧化碳气体，在 800 ℃热处理2 h，经分析后生成的碳酸磷灰石样本是以B型替代为主，碳酸根质量分数为5.4%，结晶度较低。进一步通过细胞培养实验，得出以下结论：碳酸根的B型替代导致表面能的升高，有利于细胞的早期吸附，因此以B型替代为主的碳酸磷灰石细胞相容性好，成骨细胞能够在材料表面良好黏附和增殖。而实验中在低温下采用了较之更简便的方法即合成了块状碳酸磷灰石，同样是以B型替代为主的低结晶度样本，所含碳酸含量(4.80±0.50)%与之很接近。因此，可以预见实验中合成的碳酸磷灰石同样具有较好的生物相容性，但还需进一步的细胞实验与动物实验来进行验证，来明确作为骨组织工程支架的可能性。

参考文献

[1]LeGeros RZ. Calcium phosphates in oral biology and medicine. Monogr Oral Sci. 1991;15:1-201.

[2]郝强,赵丽,关继奎,等.人工骨材料在骨缺损修复中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(34):6475-6478.

[3]Browaeys H, Bouvry P, De Bruyn H. A literature review of biomaterials in sinus augmentation procedures. Clin Implant Dent Relat Res. 2007;9(3):166-177.

[4]王迎军,杜昶,赵娜如,等.仿生人工骨修复材料研究[J].华南理工大学学报,2012,40(10):51-58.

[5]Sasso RC, LeHuec JC, Shaffrey C. Iliac crest bone graft donor site pain after anterior lumbar interbody fusion: a prospective patient satisfaction outcome assessment. Spinal Disord Tech. 2005;18(Suppl):S77-S81.

[6]张亮.复合磷酸钙骨水泥改性研究进展[J].陕西医学杂志,2010, 39(11):1532-1534.

[7]符晓红,阮晓豪,曾忠友.椎弓根螺钉系统固定并椎体成形术治疗胸腰椎骨折2年以上随访结果[J].中国医药指南,2012,10(5): 98-100.

[8]Ehrler DM, vaccaro AR. The use of allograft bone in lumbar spine surgery. Clin Orthop Relat Res. 2000;(371):38-45.

[9]陈东,张鹏,刘国辉.人工骨生物材料的研究进展[J].临床骨科杂志,2007,10(4):366-368.

[10]张永光,王志强.骨移植替代材料研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2008,22(10):1264-1268.

[11]Giannoudis PV, Dinopoulos H, Tsiridis E. Bone substitutes: an update. Injury. 2005;36 Suppl 3:S20-27.

[12]Strocchi R, Orsini G, Iezzi G, et al. Bone regeneration with calcium sulfate: evidence for increased angiogenesis in rabbits. J Oral Implant. 2002;28(6):273-278.

[13]郭亚平,周玉,贾德昌.以Ti6A14V为基体制备介孔碳酸根型羟基磷灰石/聚苯铵复合涂层[J].稀有金属材料与工程,2011,40(8): 1317-1322.

[14]张爱娟,王卫伟,李成峰.不同条件下碳酸羟基磷灰石的合成及吸附性能研究[J].硅酸盐通报,2012,31(6):1371-1375.

[15]朱庆霞,徐琼琼,罗民华.碳酸羟基磷灰石的生物矿化研究[J].陶瓷学报,2010,31(2):234-239.

[16]朱庆霞,徐琼琼,刘欣.羟基磷灰石和碳酸羟基磷灰石结构和细胞相容性的对比研究[J].陶瓷学报,2010,31(1):59-64.

[17]Rey C, Renugopalakrishnan V, Collins B, et al. Fourier transform infrared spectroscopic study of the carbonate ions in bone mineral during aging. Calcif Tissue Int. 1991;49(4): 251-258.

[18]Doi Y, Shibutani T, Moriwaki Y, et al. Sintered carbonate apatites as bioresorbable bone substitutes. J Biomed Mater Res. 1998;39(4):603-610.

[19]Roy DM, Linnehan SK. Hydroxyapatite formed from coral skeletal carbonate by hydrothermal exchange. Nature. 1974; 247(438):220-222.

[20]李云胜,唐中英.珊瑚人工骨材料的结构与性能研究[J].中国实用医药,2007,2(6):15-16.

[21]李俊,孟志斌,周键强,等.珊瑚羟基磷灰石人工骨移植修复良性骨肿瘤骨缺损32例[J],中国组织工程研究与临床康复,2008,12(36): 7085-7088.

[22]Lin X, Matsuya S, Udoh K, et al. Effect of molding pressure on fabrication of low-crystalline calcite block. J Mater Sci Mater Med. 2008;19(2):479-484.

[23]Matsuya S, Lin X, Udoh K, et al. Fabrication of porous low crystalline calcite block by carbonation of calcium hydroxide compact. J Mater Sci Mater Med. 2007;18(7):1361-1367.

[24]Takatoshi O, Koji I, Ikubo Y, et al. The effect of the microstructure of β-tricalcium phosphate on the metabolism of subsquently formed bone tissue. Biomaterials. 2007;28(16): 2612-2621.

[25]胡红涛,许国华,刘继春,等.原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强ß-磷酸三钙多孔支架的生物安全性[J].中国组织工程与临床康复, 2011,15(51)9575-9579.

[26]王臻,郭征,李靖.多孔磷酸三钙人工骨修复腔隙性骨缺损的随机对照研究[J].中华骨科杂志,2011,31(6):564-570.

[27]Fleet ME. The carbonate ion in hydroxyapatite: recent X-ray and infrared results. Front Biosci (Elite Ed). 2013;5:643-652.

[28]Ren F, Ding Y, Leng Y. Infrared spectroscopic characterization of carbonated apatite: A combined experimental and computational study. J Biomed Mater Res A. 2013.

[29]唐佩福,黄晋香,王继芳,等.多孔碳酸化羟基磷灰石骨水泥的生物相容性研究[J].北京生物医学工程,2005,24(6):401-404.

[30]Rezwan K, Chen QZ, Blaker JJ, et al. Biodegradable and biozctive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 2006;27(18): 3413- 3431.

[31]俞耀庭,张兴栋.生物医用材料[M].天津:天津大学出版社,2000.

[32]张飞,李奇,林荔军,等.新型去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究[J].广东医学,2010,31(6):688-690.

引言

口腔临床中，因肿瘤、外伤和各种先天性畸形常造成口腔颌面部骨质缺损，严重影响患者的生存质量，而由于各种原因造成骨量不足从而影响种植或牙周手术效果的病例也很多。同时牙列缺失后剩余牙槽嵴的吸收导致剩余牙槽嵴高度、宽度不足，从而影响义齿的修复效果。因此，骨质缺损的修复重建研究很有意义，进行骨移植治疗是非常必要的，而寻找合适的骨移植材料一直是研究十分活跃的领域。口腔临床中所用的骨移植材料主要包括自体骨、同种异体骨、异种骨与人工骨4类。自体骨移植被称为“金标准”，但其来源有限，而且存在二次创伤与感染的缺点^[1-3] 。同种异体骨的愈合主要靠骨传导与骨诱导作用，不能自行成骨，而且移植骨的抗原性会影响愈合。异种骨易产生免疫排斥反应，影响临床效果^[4-6] ，无法完全满足临床需要。因此研制理想的骨移植材料成为骨修复领域的一项重要课题^{[3, 7-10]} 。
理想的人工骨材料应具有以下特点：容易获取、生物相容性好、可吸收、足够的机械强度、骨传导性、可塑性^[11] 。在骨移植区，人工骨材料植入后的理想模式是：当新生的血管及骨组织长入材料内部后，植入的人工骨材料随着骨组织的再生而逐渐吸收，并保持与骨组织再生相适应的吸收率，如果该人工骨吸收速度快于新生组织的生长速度，则在植入区出现空洞，无法为细胞和新组织提供生长空间；而如果该人工骨的吸收速度慢于新生组织的生长速度，则会阻碍新生组织的生长。在新生骨组织完成了结构和功能重建后，人工骨材料完全被骨组织替代，完成骨组织的修复^[12] 。
其中碳酸磷灰石因其优异的生物吸收性备受关注^[13-14] 。粉末状碳酸磷灰石较易在低温下通过反应制备，而医疗领域中常用的团块状、颗粒状骨移植材料通常只能将粉末状碳酸磷灰石先加压成形后再通过烧结过程来制备。然而，600 ℃以上高温的烧结过程将造成碳酸含量大量流失，明显降低生物吸收性^[15-17] 。Doi 等^[18]发现在二氧化碳气体中完成烧结过程可以减少其碳酸含量的流失，但是操作非常繁琐，可行性差。因此，如能够在低温的液态环境中合成碳酸磷灰石团块是很理想的。Roy等^[19-21]发现通过在磷酸盐溶液中进行水热处理，使珊瑚碳酸钙转变成羟基磷灰石，而其原有多孔结构保持不变，可见通过磷酸盐溶液水热处理可使碳酸钙转变成磷灰石。但直接用碳酸钙粉末加压成形得到的团块在水热处理过程中将使团块不断崩解，不能保持原有形态，无法合成磷灰石团块，因此需要寻找其他方法来合成碳酸钙团块。课题组以往研究成功通过氢氧化钙粉末加压成形为氢氧化钙团块，并置于二氧化碳气体中合成了需要的碳酸钙团块^[22-23] 。
实验将碳酸钙团块浸泡在60 ℃、1 mol/L的磷酸二氢铵盐溶液中，并对生成的磷灰石进行了各项理化性能分析。

材料方法

设计：材料学人工合成实验。

时间及地点：于2009年1月至2012年6月在日本九州大学齿学研究院与南开大学口腔医院完成。

材料：

低结晶性碳酸磷灰石团块骨移植材料的合成相关试剂及仪器：

方法：

碳酸钙试件制备：将0.2 g的氢氧化钙粉末置入不锈钢模具中通过单柱油压机在2 MPa的压强下进行成型，制成直径10 mm，厚度2 mm的氢氧化钙试件，室温下置于充满二氧化碳气体与饱和水蒸气的5 L容器中，二氧化碳气体流速为0.15-0.20 L/min，反应72 h后制成碳酸钙团块，共制备30个团体^[22-23]。

碳酸钙试件的化学处理：将30个碳酸钙试件平均分为6组，1组作为对照组，将其他5组试件分别放入25 mL加热至60 ℃的1 mol/L NH₄H₂PO₄溶液后，在1，2，4，7，14 d后分别取出样本，蒸馏水清洗，37 ℃电热恒温干燥箱中干燥24 h。

径向抗拉强度测试：测量每个样本的直径、厚度后，用生物力学试验机(日本岛津试验机株式会社)对样品进行强度测试，对样本施加轴向正向负载至断裂，加载速度为1 mm/min，通过公式计算后得到径向抗拉强度值，并与材料初始强度相比较，绘制曲线，观察材料的强度随时间变化情况。每个径向抗拉强度值为5个样本的平均值。

X射线衍射分析：将样本精细研磨成粉末，用X射线衍射仪在Cu靶辐射、管电压40 kV、电流100 mA、扫描速度2 (°)/min的条件下对样本粉末进行X射线衍射物象分析(10°≤2θ≤60°)。并对反应过程中不同时间点生成的结晶相进行简易定量分析。

傅里叶红外吸收光谱测定：制得的各样品以KBr压片，用Fourier变换红外光谱仪在室温下分析样品的分子基团，特别是碳酸根的振动，波数范围为370-7 800 cm^-1。

扫描电子显微镜晶体形貌分析：经过磷酸氢二铵溶液处理前及处理1，7，14 d后样本经过喷金处理后，用扫描电子显微镜在15 kV的加速压下对样本表面及断面进行观察。

化学分析：将样本研磨成粉末，CHN含量分析仪分析并计算出碳酸含量(表示为质量分数CO₃)；进行钙、磷离子浓度分析，每3个样本取其平均值，钙离子浓度分析通过原子吸收光谱仪，磷离子浓度分析通过比色分析，根据两者结果计算出各样本的钙磷比值。

主要观察指标：各组样本超微结构，径向抗拉强度、X射线衍射分析结果，傅里叶红外吸收光谱分析结果及化学分析结果。

讨论

实验采用的合成方法未经以往合成磷灰石常用的高温烧结过程，只是通过将自行合成的碳酸钙团块浸泡于60 ℃较低温度的1 mol/L 磷酸二氢铵溶液中，最终成功合成了低结晶性B型碳酸磷灰石团块。X射线衍射分析结果显示随着反应时间的增加，碳酸钙逐渐转化成为磷灰石，并在处理7 d后，基本完全了转化。由于碳酸钙处于液态环境中不稳定，浸泡于磷酸盐溶液中将溶解出Ca ²⁺与CO₃^2-两种离子，当Ca²⁺及CO₃^2-与磷酸盐溶液中的PO₄ ^3-浓度不断增大以至于相对于碳酸磷灰石来说处于过饱和状态时，3种离子将生成在此液态环境中最稳定的碳酸磷灰石。实验反应速度很快，可能归结于磷酸二氢铵溶液的pH值较低(3.89)，因此溶解碳酸钙的速度相应较快。然而，由于二水磷酸氢钙在pH值低于4.2的环境中会更加稳定，溶液环境的低pH值也导致了二水磷酸氢钙的快速形成，而随着反应过程中溶液的pH值逐渐增加，最终达到6.20，使不稳定的二水磷酸氢钙通过自动催化机制最后转变成热力学的稳定相即磷灰石。二水磷酸氢钙作为生物降解或生物吸收型生物活性材料的原料之一，当它被植入人体后,降解下来的钙、磷两种元素能够进入活体的循环系统，并形成新生骨。因此它可作为人体骨的替代修复材料，具有良好的生物降解性、生物相容性和生物无毒性。而β-磷酸三钙具有良好的骨传导性及生物降解性，常用作复合人工骨材料的基料^[24-26] ，因此即使最终生成物中有微量残留，对人体也是安全的。
反应过程中，生成物的径向抗拉强度随着反应时间的增加不断增强，并最终高于10 MPa，满足作为口腔非承重区域骨移植材料的机械强度要求。并通过X射线衍射分析结果与径向抗拉强度的结果的比较，可以看出生成物的机械强度同碳酸钙向磷灰石的转化率成正比。
扫描电子显微镜照片显示样本呈现出表面要早于断面发生变化，提示出反应是由样本的表面向内部逐步进行。处理7 d后磷灰石样本内部开始生成针状结晶，可能是造成样本的抗拉强度在此时间点明显增强的原因。而结晶尺寸较小，提示生成物的结晶度较低。傅里叶红外吸收光谱分析结果显示最终生成物中PO₄ ^3-格子的位置被CO₃ ^2-所占据，提示生成了B型碳酸磷灰石，即生体骨矿物质的特征^[27-28] 。B型碳酸磷灰石是较理想的人工骨替代材料^[1] 。磷酸根或同时替代而生成的。人体骨中以B型为主，并随着年龄增长A型的含量逐渐增加^[29] 。在体内与体外实验中，B型碳酸磷灰石均会导致磷灰石的结晶性的降低与溶解度的升高。
而磷灰石的生物降解性与其碳酸含量密切相关，碳酸含量越高，磷灰石的生物降解性越大^[30] 。Featherstone 等曾报道，可以将碳酸磷灰石的傅里叶红外吸收光谱分析结果中碳酸基团在1 415 cm^-1处的吸收带吸收强度(A _{1 415 nm})与磷酸基团在575 cm^-1处的吸收带吸收强度(A_{575 nm})按以下公式计算出其所含碳酸含量：

CO₃ content (%) =16.1×(A_{1 415 nm}/A_{575 nm})-0.2

通过以上公式可以得出碳酸钙经过磷酸氢二铵溶液处理后的最终生成物的碳酸含量为5%，与通过CHN分析所得结果(4.8%)很好地吻合。
因人体骨为贫钙型碳酸磷灰石，Ca/P值<1.67，而实验的最终产物的Ca/P值为1.63±0.01，提示也是贫钙型，与生体骨保持一致。
与以往研究将珊瑚碳酸钙在磷酸盐溶液中进行水热处理相比，实验方法的反应物供应源充足、价廉，而且避免了有些研究需要在特制的石英管式炉内通入湿二氧化碳气体等繁琐操作过程，反应在低温下进行，不需控制pH值，以上均为产业化提供有力保证。但是我们也发现最终生成的碳酸磷灰石的碳酸含量4.8%与人体骨的4%-8%的碳酸含量相比偏低，而碳酸含量与碳酸磷灰石生物降解速度密切相关，有可能造成植入后该人工骨的吸收速度慢于新生骨组织的生长速度，则会阻碍新生骨组织的生长^[31-32] 。
实验使用的磷酸氢二铵溶液的pH值较低(3.89)，碳酸含量为(4.80±0.5)%。在今后的研究中将尝试用pH值较高的磷酸氢二铵溶液与磷酸铵溶液处理碳酸钙团块，调整合成的碳酸磷灰石的碳酸含量及生物降解速度，并探讨其在体内与体外的骨再建能力，以尝试合成具有多样化的材料学与生物学特性的碳酸磷灰石骨移植材料，应用于骨科、整形外科、颌面外科临床的骨缺损部位。目前上述研究结果初步证实了其作为临床应用的可能性，实验的设计为研制各种具有多功能的生物材料提供了思路。