RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.012

中国组织工程研究

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响

丁洁¹，梁炳生²，达志峰²，朱志祥²，韦建²，贾英伟²，冯勇³

1山西医科大学，山西省太原市 030001；2山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001；3上海市第六人民医院骨科，上海市 200030

收稿日期:2013-02-06 修回日期:2013-04-11 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 梁炳生，主任医师，硕(博)士生导师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001 liangbs707@yahoo.com
作者简介:丁洁★，男，1982年生，山西省吕梁市交口县人，汉族，2013年山西医科大学毕业，硕士，医师，主要从事肢体修复与功能重建方面的研究。 dingjie3541@sina.com
基金资助:
国家自然科学青年基金(81000805)，课题名称：联合MuRF1与FOXO3a基因治疗延缓失神经肌萎缩的实验研究。

RNA interference affects the feak-headbox 3a gene expression in myoblast cell line L6

Ding Jie¹, Liang Bing-sheng², Da Zhi-feng², Zhu Zhi-xiang², Wei Jian², Jia Ying-wei², Feng Yong³

1Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 3Department of Orthopedics, 6th Hospital of Shanghai, Shanghai 200030, China

Received:2013-02-06 Revised:2013-04-11 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Liang Bing-sheng, Chief physician, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China liangbs707@yahoo.com
About author:Ding Jie★, Master, Physician, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China dingjie3541@sina.com
Supported by:
Youth Fund of National Natural Science Foundation of China, No. 81000805*

摘要/Abstract

摘要：

背景：最近的研究发现，一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用，其中“feak-headbox”(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。
目的：探讨RNA干扰技术体外抑制FOXO3a基因表达的效果。
方法：6孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系L6，使用pEGFP-N1与siRNA重组质粒等比例在Lipofectamine2000介导下转染，优化与检测系统的转染效率；将2 μg FOXO3a基因siRNA重组质粒转染L6，转染48 h与72 h。
结果与结论：①pEGFP-N1与siRNA重组质粒转染后48 h，荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达，显示系统有较高的转染效率。②实时定量PCR分析结果显示，转染后48 h和72 h，干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a mRNA的抑制率与未转染对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，转染72 h与48 h相比，抑制效应更为明显，并以FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显。③Western印迹灰度分析结果显示，转染后48 h和72 h，干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a蛋白表达的抑制率与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，转染72 h与48 h相比，抑制效应更为明显，与mRNA水平的影响一致。结果可见RNA干扰技术在体外能够明显抑制叉头蛋白转录因子FOXO3a基因的表达，FOXO3a基因siRNA重组质粒转染其干扰序列对FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明确，这可为RNA干扰介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供一种新的思路。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 肌萎缩, FOXO3a, L6, 失神经, RNA干扰, 基因表达, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies found that some factors play important role in the process of denervated muscle atrophy, especially the feak-headbox transcription factor, is the key element to regulate the denervated muscle atrophy.
OBJECTIVE: To investigate the effect of RNA interference on inhibiting feak-headbox 3a gene expression in vitro.
METHODS: The myoblast cell line L6 were cultured in the 6-well cell culture plates, then pEGFP-N1 and small interfering RNA recombinant plasmid with the same ratio was transfected under the Lipofectamine2000 mediation to optimize the transfection efficiency of the detection system; 2 μg small interfering RNA recombinant plasmid of feak-headbox 3a gene were transfected with myoblast cell line L6 for 48 and 72 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: At 48 hours after pEGFP-N1 and siRNA recombinant plasmid transfection, a large number of bright green fluorescent displayed under fluorescence microscope with higher transfection efficiency. Real-time quantitative PCR analysis showed that there were significant differences in the sequences of feak-headbox 3a-Ⅰ, feak-headbox 3a-Ⅱ, feak-headbox 3a-Ⅲ, feak-headbox 3a-Ⅳ on feak-headbox 3a mRNA when compared with the control group at 48 and 72 hours after trasfection (P < 0.05), and the inhibition effect was more significant at 72 hours after transfection when compared with that at 48 hours after transfection. Western Blot gray analysis showed that there were significant differences in sequences of feak-headbox 3a-Ⅰ, feak-headbox 3a-Ⅱ, feak-headbox 3a-Ⅲ, feak-headbox 3a-Ⅳ on feak-headbox 3a mRNA when compared with the control group at 48 and 72 hours after trasfection (P < 0.05), and the inhibition effect was more significant at 72 hours after transfection when compared with that at 48 hours after transfection, which was same with the effect on mRNA level. RNA interference in vitro can significantly inhibit the fork-head transcription factor feak-headbox 3a gene expression, and the inhibition effect of feak-headbox 3a gene small interfering RNA recombinant plasmid transfected with the sequence on the mRNA and protein level of feak-headbox 3a is not clear, which can provide new idea for the gene therapy of RNA mediated denervated skeletal muscle atrophy.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, muscle atrophy, feak-headbox 3a, L6, denervation, RNA interference, gene expression, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

丁洁，梁炳生，达志峰，朱志祥，韦建，贾英伟，冯勇. RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.012.

Ding Jie, Liang Bing-sheng, Da Zhi-feng, Zhu Zhi-xiang, Wei Jian, Jia Ying-wei, Feng Yong. RNA interference affects the feak-headbox 3a gene expression in myoblast cell line L6[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.012.

图/表（结果） 6

2.1 获取FOXO3a 基因的siRNA重组质粒
2.1.1 根据大鼠FOXO3a(Gene ID: 294515)的基因序列分别设计并合成miRNA oligo 见表2。

2.1.2 测序分析由上海锐赛生物技术有限公司完成，结果显示均正确无误，见图1。

2.2 细胞培养及转染结果 pEGFP-N1与siRNA重组质粒按1∶1共转染后24 h，荧光显微镜于498 nm激发波长下所见L6细胞系中有大量明亮的绿色荧光表达，显示系统有较高的转染效率，见图2。

2.3 转染后48 h与72 h采用实时定量PCR检测siRNA重组质粒对FOXO3a 基因的抑制效果转染后48 h，FOXO3a基因siRNA重组质粒干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a的mRNA的抑制率分别为54%，25%，22%，27%，明显抑制了FOXO3a的表达，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3。转染后72 h，FOXO3a基因siRNA重组质粒干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a mRNA的抑制率分别为 81%，52%，46%，55%，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，与48 h相比，抑制效应更为明显。但是4对序列的抑制效果存在明显差别，以FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显，见图4。

2.4 转染后48 h与72 h使用Western印迹检测siRNA重组质粒对FOXO3a 蛋白水平的抑制效果转染后 48 h，干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a蛋白表达的抑制率分别为46%，12%，11%，23%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5，6。

转染后72 h， FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a蛋白表达的抑制率分别为72%，48%，38%，44%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，与48 h相比，抑制效应更为明显，与mRNA水平的影响一致，见图7，8。

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引言

周围神经损伤发生率和致残率高，尤其是臂丛神经损伤，可导致严重的肢体功能障碍，给患者造成了巨大的痛苦^[1]。手内肌肌萎缩的防治是周围神经领域亟待解决的一大难题。世界范围内为攻克这一难题已进行了大量的基础研究和临床实验，主要集中在3个方向：即缩短神经再生距离、加快神经再生速度和延缓肌肉萎缩。针对前两者已经进行了大量的基础研究，而且成功的应用于临床。不断发展的各种神经移位术，显著缩短了再生神经与靶肌肉的距离；成熟的显微外科技术，高质量的神经修复，加快了再生神经通过吻合口的速度；人工神经的应用使再生神经绕过阻碍轴突生长的瘢痕组织，并取得了比较满意的效果^[2]。而失神经骨骼肌萎缩的防治研究不多，且仅限于基础实验阶段，目前尚无突破性的进展，这极大的影响了臂丛神经损伤的治疗效果，成为臂丛损伤治疗进展的瓶颈。越来越多的实验研究和临床研究证实：骨骼肌蛋白合成减少和降解增多是导致肌萎缩发生的主要原因之一。而在失神经骨骼肌细胞内，蛋白降解起着非常重要的作用^[3]。叉头蛋白(forkhead protein)转录因子是一个超家族蛋白，最早发现于果蝇细胞内，该家族成员如果发生点突变就会引起叉头样外观的改变，因而得名，至今已有多于100个家族成员已经被发现。在骨骼肌，它有3种亚型：FOXO1、FOXO3和FOXO4。FOX蛋白家族是脊椎动物叉头样转录因子的总称^[4]，由于其在生物体内具有重要作用，已迅速成为国内外生命科学的研究热点。目前研究较多的FOXO3a(FKHRL1)是forkhead转录因子家族中的重要成员，主要通过转录调控在细胞的生长、分化、代谢、凋亡和免疫等方面起关键的作用。基于以上提出构想：在失神经损伤后，通过基因技术特异性地阻断在失神经骨骼肌萎缩过程中起重要作用的因子(FOXO因子)进行基因治疗，为迟滞失神经肌萎缩的进程、神经的再支配赢得时间。

材料方法

设计：体外对比观察实验。

时间及地点：实验于2011年8月至2012年8月在山西医科大学第二临床医学院骨科实验室完成。

材料：

细胞和试剂：大鼠骨骼肌成肌细胞系L6(ATCC公司)，质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(上海锐赛生物科技公司)，胎牛血清、DMEM(高糖)细胞培养液、胰蛋白酶(Gibco公司)，Genelute Plassmid Miniprep Kit(Sigma公司)，Lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen公司)，其他一般试剂(乙醇、异丙醇等)为市售分析纯级。

仪器：高速离心机和冷冻高速离心机(Eppendorf公司)，Hera Cell细胞培养箱、Heraeus高温干燥消毒箱(德国Heraeus公司)，IMT-2型倒置显微镜(Olympus公司)，超净工作台(上海净化设备厂)，蛋白电泳系统(Bio-Rad公司)，凝胶成像扫描仪(Phamarcia公司)，正置荧光显微镜(Leica公司)。

实验方法：

获取FOXO3a基因的siRNA重组质粒：查阅相关文献获取目的基因miRNA干扰序列，构建并鉴定siRNA重组质粒。

细胞培养：25 mL细胞培养瓶中培养大鼠成肌细胞系L6，转染前1 d将培养瓶中细胞转移到6孔细胞培养板中，细胞浓度(0.5-2.0)×10⁸ L^-1，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液培养，2 mL培养液/孔，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃条件下正常孵育过夜。

转染条件及方法：采用Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂盒，将重组质粒导入大鼠成肌细胞系L6中，具体操作步骤如下：①于245 μL无血清无抗生素培养液中，加入5 μL Lipofectamine2000脂质体，轻轻混匀后，室温下静置5 min，得A液。②于 240 μL无血清无抗生素培养液中，加入10 μL(2 μg) FOXO3a基因siRNA重组质粒，轻轻混匀后，室温下静置5 min，得B液。③将A液与B液混合，轻轻混匀后，室温下静置20 min，以形成脂质体-DNA复合物。④将脂质体-DNA复合物加入6孔细胞培养板中，再加入无血清无抗生素培养液至每孔2 mL。37 ℃，体积分数为5% CO₂条件下培养4 h。⑤PBS冲洗2次后，每孔加入无抗生素但含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液 2 mL，37 ℃，体积分数为5% CO₂条件下培养过夜。⑥转染24 h后，荧光显微镜下观察。其间可以给细胞更换培养液，于转染后48 h和72 h检测。

瞬时转染系统效率的检测：报告基因质粒pEGFP-N1与重组质粒等比例共转染，48 h后于498 nm激发波长的荧光显微镜下观察绿色荧光的表达变化，优化与检测系统的转染效率。将细胞用胰酶消化，收集细胞装入离心管内。1 000 r/min离心5 min。弃上清液，PBS清洗2次。重复1次离心清洗。弃上清液，各离心管加入500 μL PBS。用流式细胞仪测定转染效率，转染率大于30%可以表明转染有意义。

FOXO3a基因siRNA重组质粒瞬时转染实验：转染前 1 d，将培养瓶中细胞转移到6孔细胞培养板上，细胞浓度(0.5-2.0)×10⁸ L^-1，2 mL培养液/孔，体积分数为5%CO₂、37 ℃正常孵育过夜；转染当天，取2 μg siRNA重组质粒DNA加入Opti-MEM培养液中，终体积为 120 μL，轻柔混匀；使用前轻柔混匀Lipofectamine 2 000，取5 μL稀释于Opti-MEM培养液中，终体积为 120 μL，轻柔混匀，室温孵育5 min；孵育后将质粒DNA与转染试剂混合，终体积为240 μL，室温孵育20 min，以便形成DNA-脂质体复合物；吸取细胞培养板中的培养液，将DNA-脂质体复合物转移入6孔细胞培养板中(即含带转染细胞的培养板)，240 μL/孔，轻柔混匀，加培养液至终体积2 mL；体积分数为5%CO₂、37 ℃孵育48-72 h，其间24 h可以更换细胞培养液，于转染后48 h和72 h检测。

转染后PCR检测：转染后48 h与72 h采用实时定量PCR检测siRNA重组质粒对FOXO3a基因的抑制效果，PCR软件分析扩增曲线和溶解度曲线并记录达到荧光阈值时的循环次数(Cycle threshold，Ct值)，用2^-ΔΔCt来计算各组标本FoxO3a基因的表达强度。实时定量PCR引物，见表1。

转染后Western印迹检测：转染后48 h与72 h使用Western印迹检测siRNA重组质粒对FOXO3a 蛋白水平的抑制效果，经过蛋白提取、蛋白定量、蛋白质电泳、蛋白质电转移、染色、封闭及与抗体(一抗：兔抗大鼠FOXO3a多克隆抗体1∶300，兔抗大鼠MuRF1多克隆抗体1∶100；二抗：山羊抗兔IgG 1∶4 000；内参照：GAPDH)结合后用ECL法化学发光法显色，用BIO-RAD图像处理软件进行灰度测定，以各因子灰度与内参照灰度之比代表组织内FOXO3a、pFOXO3aser253蛋白的含量，以各时间点的灰度比与对照组灰度比的比值作为各时间点各蛋白因子的表达强度。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计软件处理各组数据，单因素方差分析方法和LSD法进行各组比较和组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤发生率和致残率高，尤其是臂丛神经损伤，可导致严重的肢体功能障碍，给患者造成了巨大的痛苦。日益成熟的显微外科技术，以及反复改进的神经修复方法，使周围神经损伤的治疗有了革命性的变化，也使臂丛神经损伤的治疗成为可能。臂丛损伤患者肩、肘、腕的功能恢复有了突破性的进展，但手内肌功能却依然不见好转，这是因为臂丛神经修复后再生距离长，再生速度慢，再生轴突到达手内肌所需时间长达1年以上，而手内肌肌肉短小，功能精细，一旦失去神经支配，半年内即发生不可逆的组织变性，即使重新获得神经支配，也难以恢复有效的功能。因此，臂丛神经损伤所致的手内在肌萎缩的防治是周围神经领域亟待解决的一大难题。

骨骼肌在失神经支配后早期出现快速萎缩的事实表明：骨骼肌中蛋白代谢的动态平衡被打破了，蛋白降解超过了蛋白合成，由此可见，采取有效措施调节失神经骨骼肌的蛋白代谢，促进蛋白合成，抑制蛋白水解，抑制甚至逆转失神经骨骼肌代谢的负平衡，将是延缓失神经骨骼肌萎缩，为失神经骨骼肌重获神经支配争取时间，促进骨骼肌功能恢复的有效途径。

迄今为止，虽然人类对于失神经肌萎缩的机制仍未完全阐明，也尚无有效措施可以阻断失神经肌萎缩，但一般的结论认为失神经肌萎缩是由多基因调控的快速发展的主动过程。现有研究发现一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用，调控这些因子可以一定程度上延缓失神经肌萎缩的进程。最新研究发现 “feak-headbox”(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。图9为肌萎缩蛋白合成与降解示意图。

近几年不同的研究表明：在肌萎缩蛋白降解过程中至少有4种不同的降解系统在发挥作用。其中有Lys蛋白酶系统、钙活化蛋白酶系统、细胞凋亡蛋白酶系统、泛素蛋白酶体系统。但大量研究证实在许多生物学过程中，泛素蛋白酶体系统在肌萎缩中发挥了及其重要的作用，所以泛素依赖的蛋白水解作用在调节蛋白含量中就起到了中心调控作用。最新很多国外研究证实了P38/MAFbx信号通路的存在，在肌萎缩中发挥重要作用。

最新很多国外研究还证实了P13K/AKT/FOXOS/ MAFbx信号通路的存在，大量研究表明P13K/AKT通路促进蛋白合成起非常主要的作用，除可刺激骨骼肌肥大外，P13K与AKT的激活还可明显抑制萎缩信号的诱导，使上调的FOXOS、MAFbx、MuRF1等肌萎缩相关因子表达明显下降。P13K/AKT通路是构成促进蛋白合成抑制蛋白降解两大途径的重要组成部分。证明FOXO与MAFbx因子之间存在相互作用。

大量研究证明了以下结论：① FOXO因子尤其是FOXO3a对骨骼肌萎缩有明显的促进作用，它是通过调节MAFbx的表达起作用的，而MAFbx因子也可促进FOXO的蛋白合成与其作用的发挥，构成正反馈机制。②P13K/AKT通路对蛋白合成有重要的调节作用，它通过磷酸化FOXO因子，抑制其功能并进一步抑制了P38/MAFbx通路，延缓了肌萎缩的发生，FOXO因子成为连接蛋白合成与蛋白降解的重要桥梁。

基于以上研究，课题组提出构想：如果在失神经损伤后，通过基因技术特异性地阻断在失神经骨骼肌萎缩过程中起重要作用的因子FOXO进行基因治疗，通过基因技术特异性地阻断FOXO因子的入核通路，这样就阻断了两个重要的蛋白水解通路FOXOS/MAFbx信号通路，为迟滞失神经肌萎缩的进程、维持骨骼肌形态和功能单位、神经的再支配赢得时间。进一步推测，干预在失神经骨骼肌萎缩过程中起重要作用的因子成肌调节因子进行基因治疗，可能会有更好的疗效。

在失神经骨骼肌过程中，核转录因子调控下的骨骼肌蛋白降解是导致肌萎缩发生的主要原因之一^[5]，较多研究证实FOXO3a可参与细胞周期调控^[6]，使细胞周期停滞在G1-S和G2-M期“限制点”，从而抑制细胞生长，具有上游调控作用并且在分化晚期调控基因表达^[7]。FoxO3a的转录调控作用主要由其253位丝氨酸的磷酸化水平决定，而当253位的丝氨酸去磷酸化后，FoxO3a就进入细胞核，作用于MAFbx基因的增强子，促进骨骼肌蛋白的降解，从而促进肌萎缩^[8-9]。有学者发现Forkhead转录因子家族成员是PI3K/Akt信号途径下游最重要的转录因子^[10]。在哺乳动物中，各种外界刺激以及生长、细胞因子的作用均可激活PI3K，从而活化Akt/PKB，而活化的Akt能够磷酸化转录因子FOXO3a，使其从细胞核中排除，易位到细胞浆中，从而降低转录激活靶基因的活性，促进细胞的生长和增殖^[11]。骨骼肌萎缩有着复杂的分子机制，其中 FoXO3a/MAFbx信号通路是肌萎缩重要的分子机制之一，研究表明在大鼠骨骼中转染并活化FoXO3a能促进MAFbx表达上调引起肌萎缩，而RNA干扰抑制FOXO3a和MAFbx表达能有效延缓肌萎缩^[12-13]。

RNA干扰是一种阻抑基因表达的新方法，是一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，已成为基因功能研究极其重要的工具^[14]。

课题研究采用RNA干扰技术在体外抑制叉头蛋白转录因子FOXO3a基因的表达，借此为失神经骨骼肌萎缩寻找新的治疗方法。结果显示：采用RNA干扰技术特异性的敲除掉与失神经骨骼肌萎缩有密切关系的基因FOXO3a，在48 h后检测各转染组与对照组FOXO3a因子的mRNA及蛋白表达量均被明显抑制，在转染72 h后

FoxO3a因子的mRNA及蛋白表达量被抑制的更加明显。由此可见RNA干扰技术在体外能够明显抑制FOXO3a基因的表达。实验结果又提示：所构建的4对干扰序列对FOXO3a因子的mRNA及蛋白表达量抑制效果不同，在4对干扰序列中以FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显，这为将来活体实验奠定了理论基础。综上所述，失神经骨骼肌萎缩可以通过这一思路进行基因治疗。

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RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响

RNA interference affects the feak-headbox 3a gene expression in myoblast cell line L6

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