中药骨康调控成骨细胞核内结合因子α1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：中药骨康在临床上治疗骨质疏松疗效明确，但其具体作用途径尚不清晰。
目的：假设中药骨康通过调节核内结合因子a1水平，控制其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护素表达，起到调控成骨细胞生长发育的作用。
方法：新生24 h内的SD乳鼠用于成骨细胞的分离培养。成年SD雌性大鼠用于制备药物血清，随机分为正常血清组和中药骨康组。2组大鼠按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物和生理盐水灌胃，连续给药1周。最后一次用药后2 h行心脏采血，分离血清。原代培养并传至第3代经碱性磷酸酶鉴定取得的大鼠成骨细胞，消化计数铺板并分为2组，以上述血清处理72 h，MTT法检测成骨细胞的增殖率，ELISA方法检测碱性磷酸酶分泌量并以相应吸光度值进行纠正，运用RT-PCR检测2组成骨细胞核内结合因子α1及其下游核因子κB受体活化因子配体和骨保护素mRNA表达情况。
结果与结论：中药骨康组成骨细胞骨保护素和核内结合因子a1 mRNA水平显著高于正常血清组，核因子κB受体活化因子配体蛋白和mRNA水平显著低于正常血清组(P < 0.01)。实验结果证实，中药骨康可通过影响核内结合因子a1表达，调控其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护蛋白表达和分泌，进而发挥治疗骨质疏松的作用。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 骨质疏松, 中药骨康, 核内结合因子a1, 核因子κB受体活化因子配体, 骨保护蛋白, 成骨细胞, 细胞培养, 中药血清学

Abstract:

BACKGROUND: Chinese medicine Gukang prescription has a clear effect on clinical treatment of osteoporosis, but the therapeutic pathway is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Chinese medicine Gukang on the expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin by regulating core binding factor alpha 1 expression to control the growth and development of osteoblasts.
METHODS: Sprague-Dawley neonatal rats within 24 hours after delivery were used for the separation and culture of osteoblasts. Adult Sprague-Dawley rats were used to prepare drug-containing serum, and then divided into two groups randomly: normal control group and Gukang group. Rats in the normal control and Gukang groups were intragastrically administrated with extract of Gukang prescription and normal saline based on rat’s body surface area, for 1 consecutive week. Two hours after the last administration, blood samples were taken from the heart. Then the serum was collected. Osteoblasts at passage 3 were confirmed with alkaline phosphatase assay and digested. After counting and planting, all osteoblasts were divided into two groups and treated with collected serum for 72 hours. Proliferative rate of osteoblasts was detected by using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide test. Secretion of alkaline phosphatase was detected by using enzyme linked immunosorbent assay and corrected with the corresponding absorbance value. mRNA expression of core binding factor alpha 1, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin were detected by using reverse transcription-PCR in all groups.
RESULTS AND CONCLUSION: mRNA expression of osteoprotegerin and core binding factor alpha 1 in the Gukang group was significantly higher than that in the normal control group, but protein and mRNA expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand were dramatically lower in the Gukang group compared with the normal control group (P < 0.01). These findings indicate that Chinese medicine Gukang prescription can modulate the expression of core binding factor alpha 1, thereby adjusting the expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin, which may be one of the mechanisms underlying Gukang treatment for osteoporosis.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, osteoporosis, Chinese medicine Gukang presciption, core binding factor alpha 1, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, osteoprotegerin, osteoblasts, cell culture, serum pharmacology

中图分类号:

R318

赵可伟，邱俊林，潘旭枫，梁秀珍，陈小华. 中药骨康调控成骨细胞核内结合因子α1的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.005.

Zhao Ke-wei, Qiu Jun-lin, Pan Xu-feng, Liang Xiu-zhen, Chen Xiao-hua . Chinese medicine Gukang prescription modulates core binding factor alpha 1 expressing in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.005.

图/表（结果） 5

2.1 成骨细胞生长情况正常血清组成骨细胞呈三角形、纺缍形或菱形，胞浆丰富并向外伸展，伸出几个突起与邻近细胞伸出的突起相连。胞核大而清楚，呈圆形或卵圆形，含一两个核仁，生长旺盛，可见细胞呈集落样生长，见图1。中药骨康组成骨细胞生长形态与正常血清组相似，但细胞生长更加健康和旺盛，细胞集落样生长趋势更加明显，见图2。

2.2 成骨细胞增殖率中药骨康组和正常血清组MTT法检测结果显示，培养48 h后，中药骨康血清明显促进大鼠成骨细胞增殖。与正常血清组相比，细胞数提高80.2%，见表2。

2.3 成骨细胞上清液骨保护素、核因子κB受体活化因子配体和碱性磷酸酶蛋白浓度检测见表3。

ELISA法检测中药骨康组和正常血清组骨保护素、核因子κB受体活化因子配体和碱性磷酸酶蛋白浓度结果显示，培养72h后，中药骨康含药血清有明显促进大鼠成骨细胞表达骨保护素和碱性磷酸酶的作用，与正常血清组相比，骨保护素表达提高37.32%，碱性磷酸酶提高76.2%。骨康含药血清对核因子κB受体活化因子配体表达有显著抑制作用，与正常血清组相比，表达量减少56.7%。中药骨康组和正常血清组3个指标差异均有显著性意义(P < 0.05-0.01)。
2.4 RT-PCR方法检测大鼠成骨细胞核内结合因子a1、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达见表4。

RT-PCR检测两组骨保护素、核因子κB受体活化因子配体和核内结合因子a1mRNA表达结果见图3。

结果显示，中药骨康含药血清有明显促进大鼠成骨细胞表达骨保护素和核内结合因子a1 mRNA的作用，与正常血清组相比，骨保护素表达提高37.39%，核内结合因子a1提高达4倍，差异均有显著性意义。骨康含药血清对核因子κB受体活化因子配体mRNA表达有抑制作用，与正常血清组相比，表达量减少71.96%，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。

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引言

成骨细胞调节的骨形成和破骨细胞调节的骨吸收，组成一个动态平衡，保持骨密度稳定。各种原因导致这种动态平衡失稳，骨吸收过强或是骨形成受抑制，均会导致骨质疏松的形成。

中药骨康是根据“肾主骨”、“脾肾相关论”、“血瘀论”，在中医平衡观、整体观和辨证施治的观点指藿、熟地黄、白芍补肾滋阴益精为臣药，此乃“善补阳者，必于阴中求阳”和“壮水之源，以制阳光”之意；同时配以黄芪补中益气，丹参当归活血通络，共为佐药，此既培补后天生化之源以充肾精，又达到补中寓通，补而不滞的目的。本研究所在过去的十几年里对中药骨康防治骨质疏松进行了大量而系统的研究。这些体外或整体实验与临床研究均证实该方具有类激素作用，能够增强骨密度，促进雌二醇等激素的分泌，提高骨生物力学性能，改善骨质量，促进骨形成等^[1-3]，但具体作用的途径尚未明确，需进一步的研究。

核内结合因子为一族核内特异转录激活因子，该基因的表达、活化对骨形成过程中起关键作用，多种与骨质疏松有关的信号通路(骨形态发生蛋白2、维生素D3途径等)均是通过该因子而发挥作用，而在下游骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素配基这条极其重要的成骨-破骨调节轴亦受其控制。在骨质疏松治疗中，核内结合因子a1起到了一个承上启下的作用，是治疗骨质疏松的关键节点。

破骨细胞的形成受骨保护蛋白/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子配体受体的调控。核因子κB受体活化因子配体受体是核因子κB受体活化因子配体的惟一受体，核因子κB受体活化因子配体介导的信号是破骨细胞分化、活化的一道关键闸门。核因子κB受体活化因子配体在成骨细胞表面表达，与破骨细胞前体细胞中表达的核因子κB受体活化因子配体受体结合，促进破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化。骨保护素可与核因子κB受体活化因子配体受体结合，从而阻断核因子κB受体活化因子配体与核因子κB受体活化因子配体受体的相互作用^[4]。核因子κB受体活化因子配体与骨保护素的比例是骨吸收的重要决定因素之一^[5]。由于前者增加或后者减少或两种情况并存导致的核因子κB受体活化因子配体与骨保护素比例的增大，都可能导致破骨细胞数目和活性增加，从而导致骨质疏松。

体内骨源性碱性磷酸酶，来自成骨细胞，成骨活跃时, 成骨细胞分泌大量碱性磷酸酶，一部分释放到血液中使血中酶活性升高，骨源性碱性磷酸酶约占总碱性磷酸酶的50%；另一部分参与骨的钙化。当骨内磷酸钙沉积增加时，成骨细胞合成分泌骨源性碱性磷酸酶增加，因此，它既可作为成骨细胞的功能标记物，又可反映其分化成熟程度并促进细胞成熟、钙化，碱性磷酸酶活性的提高是成骨细胞分化的重要标志^[6]，也是成骨代谢敏感而特异的指标，常用于评价骨形成和骨转换。

文章旨在以往研究基础上，从分子生物学角度观察补肾健脾活血中药血清对离体成骨细胞核内结合因子a1及其下游骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子配体受体基因表达和骨保护蛋白/核因子κB受体活化因子配体、骨碱性磷酸酶蛋白分泌的影响，探讨中药骨康对成骨细胞的调控途径和作用靶点，以期从细胞分子学角度进一步阐明补肾健脾活血方防治骨质疏松的生物治疗和分子作用机制。

材料方法

设计：细胞学水平，体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年12月在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级4月龄SD雌性大鼠32只，体质量280-320 g，用于中药骨康含药血清制备。新生24 h内的SD乳鼠，用于成骨细胞的分离培养。SD大鼠成骨细胞，原代培养，取材自SD大鼠新生乳鼠。动物均由广州州中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(粤)2008-0001。

中药骨康对成骨细胞核内结合因子α1调控实验的主要试剂及仪器：

方法：

含药血清的制备^[7]：中药骨康方组成：补骨脂、制淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣。该方的提取药物含生药量1.43 g/mL。根据临床用药剂量及新药研究中动物用药剂量要求，以 4.8 g/kg配制，相当于临床剂量的10倍药物以蒸馏水定容至所需浓度。将32只雌性大鼠按随机数字表法分2组，即正常血清组、中药骨康组，每组16只。按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物和生理盐水灌胃，灌胃给药容积为17.5 mL/kg，2次/d，间隔5 h，连续灌胃7 d。各组SD大鼠于最后一次用药后2 h行心脏采血。离心 3 000 r/min，20 min，取上清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.2 μm滤膜抽滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

成骨细胞的分离与培养^[8]：取24 h内新生SD乳鼠, 麻醉后拉颈处死置入盛有体积分数75%乙醇的容器中，消毒5-10 min，取出放入平皿中。于无菌条件下取出颅骨，放入4 ℃预冷的PBS(pH 7.2)中，去除附着的骨膜及周围的结缔组织，用PBS洗2次后，将洗净的颅骨剪成 1 mm×1 mm小片，移入0.25%胰蛋白酶中37 ℃下预消化15-20 min，再将骨片移入另一含1 g/L Ⅱ型胶原酶的溶液中37 ℃消化60 min，使细胞从基质中解离出来。置上述胶原酶消化液于离心管中，1 000 r/min离心 3 min，弃上清液，用DMEM培养液将沉淀洗一两次后制成细胞悬液,重复以上步骤，将2次消化获得的细胞混匀,以终浓度1×10⁷ L^-1接种于培养瓶内。在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，24 h后换液，除去未贴壁的细胞，以后每两三天换液1次。传代培养：培养5-7 d，细胞长成致密单层, 铺满培养瓶底, 即可进行传代。以0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解,轻摇培养瓶,细胞即脱壁，以终浓度1×10⁷ L^-1接种于培养瓶内，进行传代培养，取第3代细胞供实验用。

MTT检测：取第3代成骨细胞，以5×10⁷ L^-1细胞悬液浓度，接种于96孔板，每孔100 μL，体积分数5%CO₂，37 ℃孵育12 h，再加入中药骨康含药血清和对照组血清。每组设8孔。体积分数5%CO₂，37 ℃孵育48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L，0.5%MTT)，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值(A)。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

细胞分组和药物干预：实验分为2组，正常血清组和中药骨康组。取第3代形态良好，生长旺盛的成骨细胞，20×10⁴/瓶接种于50 cm²培养瓶中，待细胞汇合80%-90%时加入即配的药液。干预之前24 h开始用不含血清的培养液培养细胞。各组细胞分别加入相应血清干预培养，24 h后收集细胞。

相关蛋白检测：取第3代成骨细胞，以5×10⁷ L^-1细胞悬液浓度接种24孔板，每孔0.5 mL，体积分数5%CO₂，37 ℃孵育12 h，再加入中药骨康含药血清和正常血清。每组8孔，体积分数5%CO₂，37 ℃孵育72 h，倒置显微镜下观察。取上清液，用ELISA方法，按试剂盒说明书，用ELISA法检测骨保护素、核因子κB受体活化因子配体和碱性磷酸酶蛋白含量。

Trizol法提取细胞总RNA：吸尽培养基，按照每10 cm²细胞加入1 mL TRIZOL(如果用的是六孔细胞培养板，每个孔加入1 mL trizol)，用移液器上下吹打细胞，使细胞全部溶解，然后将细胞吸至1.5 mL离心管；将样品在室温下静置5-15 min，使核酸蛋白复合物完全分离；每管加入0.2 mL氯仿盖上盖子，剧烈摇匀15 s，然后室温静置3 min；4 ℃ 12 000×g离心15 min，RNA溶解在上层的水层里边，体积大约为50%；将无色层转移到1.5 mL的离心管；重新重复5-6步；向其中加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min；4 ℃12 000×g离心10 min，移除上清，底部会有白色的RNA；加入无RNA酶的水配制体积分数75%的乙醇，放在漩涡仪上漩涡20 s，然后7 500×g离心5 min；移除上清，空气中静置5-10 min，待底部RNA刚好变无色；加入20 μL无RNA酶的水，60 ℃水浴或者金属浴15 min；进行反转录。

RT-PCR检测核内结合因子a1、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体的mRNA表达：通过GenBank检索核内结合因子a1、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体序列，根据引物设计原则，用Primer引物设计软件进行引物设计，设计结果见表1。

以GAPDH为内参照，检测核内结合因子、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平。将按照Trizol法提取的成骨细胞总RNA，加入DEPC处理水溶解RNA后，用紫外分光光度计测量260 nm和280 nm处的A值，计算出样本的纯度和RNA浓度。加入Oligo(dT)15引物、M-MLV反转录酶等试剂合成cDNA，然后进行定量PCR反应，每组做3个复孔，取平均值。

主要观察指标：中药骨康含药血清对成骨细胞核内结合因子a1、骨保护素和核因子κB受体活化因子配体基因转录和表达的影响。

统计学分析：由第四、五作者采用SPSS 13.0数据统计软件包处理，结果表示为x(_)±s，采用单因素方差分析(Oneway-ANOVA)，组间两两比较采用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨代谢是维持骨组织不断更新，保持生命活力的基本过程，这一过程是依靠骨重建(bone remodeling)完成的。成骨细胞和破骨细胞是骨重建的主要细胞，如果成骨细胞功能减弱，或是破骨细胞功级增强，均会导致骨吸收增强，最终形成骨质疏松。在绝经后女性表现得更为明显，女性绝经后雌激素迅速减少，成骨功能减弱，骨量丢失加快，形成高转换型病理特点，引发骨质疏松症。

在绝经后骨质疏松治疗中，雌激素替代疗法曾是一个主要方法，虽然可以提高患者骨密度，但其引起乳腺癌、子宫癌等严重副反应而阻碍了其使用^[9]。寻找药物，能保护骨组织的同时，减少子宫内膜癌和乳腺癌的风险，一直是国际上研究的热点。在西医方面雌激素受体调控剂是个热门研究方向，而在中医植物激素亦是一个极为重要的研究方向。本院中药骨康是淫羊藿、补骨脂、丹参、黄苠等10味中药组成，以往研究表明，该药能提高血清活性维生素D含量, 增强羟化酶活性，对人成骨细胞骨保护素和核因子κB受体活化因子配体有调节作用^[10-11]，与雌激素作用一致。现代药理研究亦发现，淫羊藿、补骨脂等补肾中药中含有黄酮类物质，具有植物雌激素的作用特点，其中异黄酮具有雌激素受体调控剂的作用。Qian等^[12]利用淫羊藿提取物淫羊藿总黄酮对成骨细胞干预培养，认为该提取物对核内结合因子a1mRNA的表达有促进作用，从而促进成骨细胞的分化。翟远坤等^[13]认为淫羊藿苷较强的促骨形成活性与淫羊藿苷促进与成骨相关转录因子Runx-2和Osterix mRNA的表达有关。骨重建的过程是通过成骨细胞的骨形成作用和破骨细胞的骨吸收作用耦合协调来实现的^[14]，一旦二者间的平衡遭到破坏，则会导致骨代谢的紊乱、骨疾患的发生。为了更符合体内骨微环境的要求，有研究趋向于成骨细胞与破骨细胞共培养观察淫羊蕾对骨形成和骨吸收的综合调节作用。王建钧等^[15]建立成骨-破骨细胞共育体系，观察应用淫羊藿后碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶的变化，结果显示淫羊藿可显著提高碱性磷酸酶活性，降低抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，提示淫羊藿可增强共育体系中成骨细胞活性、抑制破骨细胞的功能。体外血清药理学研究结果显示，淫羊藿总黄酮对细胞增殖无明显影响，而其含药血清却表现出强烈的刺激细胞增殖活性并显著提高骨钙素的分泌量、矿化结节数和钙盐沉积量，延长骨保护素mRNA的表达，抑制骨保护素配体mRNA的表达，推测作用的直接物质基础并非淫羊藿总黄酮，而与其吸收入血的淫羊藿总黄酮代谢产物及其诱生物有关^[16-17]。此外，淫羊藿苷经口服后的代谢产物可抑制大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，但可促进其成骨性分化，提示淫羊藿苷可通过口服途径给药，其代谢物是发挥抗骨质疏松活性的主要成分^[18-19]。

核内结合因子属于Runt结构域基因家族, 因此又称Runx2 (Runt related gene 2)。核内结合因子是一种转录因子，主要在成骨细胞和肥大化软骨细胞中表达，能特异识别并结合许多靶基因启动子上的PyGPyGGTPy序列，影响靶基因转录。

DNA结合试验中发现在成骨分化相关基因，如碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白，核因子κB受体活化因子配体等启动子序列中均存在OSE(osteoblast specifie elements)序列，而OSE序列正是核内结合因子a1的结合位点^[20]，因此核内结合因子a1能直接调节核因子κB受体活化因子配体等基因的表达。骨保护素是由成骨细胞分泌的破骨细胞分化和功能的抑制因子, 其在体外培养细胞中的表达也同核内结合因子a1密切正相关^[21]。

核内结合因子a1表达和活性亦受到多种与骨质疏松相关的信号通路调控，包括Wnt/β-catenin途径、VitD3途径、骨形态发生蛋白2途径等。体外实验表明，骨形态发生蛋白2可以促进成骨细胞中核内结合因子a1蛋白的表达，致人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化^[22]。骨形态发生蛋白2的DNA5’端侧存在1a，25-(OH)₂D₃、雌激素和糖皮质激素的结合位点。雌激素能够通过BMP-2途径来调控核内结合因子a1。过氧化物酶体增殖物激活受体γ2是核内结合因子a1的抑制剂，能够抑制核内结合因子a1的表达，阻断基质干细胞向成骨细胞分化^[23]，而雌激素能够抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ2表达。别一个比较有趣的是选择性雌激素受体调节剂与雌激素受体结合后，能跨膜激活AP-1基因，导致核内结合因子a1与OSE-2结合能力增强，从而促进核内结合因子a1的表达^[24]。由此可见，雌激素能通过多种途径来调控核内结合因子a1表达。

实验分别应用ELISA和RT-PCR技术探究中药骨康对成骨细胞骨源性碱性磷酸酶、核内结合因子a1、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体的mRNA表达和蛋白分泌的影响，进而探查其分子机制，其目的是为中药的现代化研究和进一步开发提供实验依据。本实验结果表明，中药骨康能够显著提高成骨细胞中核内结合因子a1表达，与正常血清组相比升高4倍，效果显著，这与Qian和其他学者采用淫羊藿提取物或是体外血清学的研究结果相一致^{[12, 18]}，其药理机制是骨康方中淫羊藿经人体吸收其代谢产物促进核内结合因子a1表达。本实验中观察到受核内结合因子a1调控的下游基因骨保护素和核因子κB受体活化因子配体其mRNA表达随核内结合因子a1变化而发生相应，且这2个指标蛋白表达亦与其mRNA变化相一致，说明不存在翻译调控。从实验结果分析中药骨康主要是通过淫羊藿调控核内结合因子a1，进而通过骨保护素-核因子κB受体活化因子-核因子κB受体活化因子配体轴来达到调控成骨细胞功能，促进骨形成，抑制骨吸收的作用。综合以往研究结果，作者初步估计中药骨康治疗骨质疏松的可能作用途径如下：

综上所述，实验在分子水平观察了中药骨康对成骨细胞代谢调控的影响，发现其主要是通过植物激素作用，调控核内结合因子a1，促进干细胞向成骨转化，增强骨形成能力；增加骨保护素mRNA的表达，抑制核因子κB受体活化因子配体表达，利用骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子调节轴，抑制破骨细胞的分化合成，达到其抑制骨吸收，治疗骨质疏松症的目的。但是否只是植物激素起作用，或是还有其他成分和途径亦起到相应作用，仍需要进一步的研究证实。