同种异体骨复合自体骨髓干细胞移植治疗良性骨肿瘤和瘤样病变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：同种异体骨是临床常用的骨移植材料，但缺乏诱导成骨能力是最大的问题。
目的：评价良性骨肿瘤及瘤样病变刮除或切除后应用同种异体骨复合自体骨髓干细胞修复骨缺损的效果。
方法：65例良性骨肿瘤(包括瘤样病变)患者，根据植骨情况分为2组。复合骨髓干细胞植骨组35例患者根据预计植骨量从每位患者两侧的髂前上棘或髂后上棘抽取红骨髓20-40 mL，经体外分离、纯化、培养扩增骨髓基质干细胞备用，在植骨前将同种异体骨颗粒与骨髓基质干细胞充分混匀。肿瘤刮除或切除后，将混匀的骨髓基质干细胞与同种异体骨颗粒，植入骨缺损区内。单纯植骨组将用生理盐水浸泡半小时的同种异体骨植入骨缺损区内。分别于治疗后1，3，6，12个月进行植骨区X射线检查，比较两组病例同种异体骨颗粒界限模糊、消失的时间，同时观察术后并发症发生情况。
结果与结论：62例患者均获得12个月以上随访。复合骨髓干细胞植骨组移植骨界限模糊时间和消失时间均短于单纯植骨组(P < 0.05)。复合骨髓干细胞植骨组1例出现排异反应，使用免疫抑制剂治疗2周后痊愈，两组病例均未出现感染。结果表明同种异体骨复合自体骨髓干细胞植骨能明显促进骨融合和骨缺损的愈合。

关键词: 器官移植, 细胞移植, 同种异体骨, 骨髓干细胞, 移植, 良性骨肿瘤, 瘤样病变, 骨融合, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Allogenic bone is a clinical commonly used bone graft material, but the osteoinductive capacity is the biggest problem.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of allogeneic bone combined with autologous bone marrow stem cells on the repair of bone defects after scraping or resection of benign bone tumors and tumor-like lesions.
METHODS: Sixty-five cases of benign bone tumors (including patients with tumor-like lesions) were divided into two groups according to bone graft. There were 35 cases in the composite bone marrow stem cells for bone graft group, and 20-40 mL red bone marrow were extracted from anterosuperior iliac spine or iliac spine on both sides according to the expected amount of bone graft, then the bone marrow stem cells were isolated, purified, cultured and amplified for standby, and the bone marrow stromal stem cells and allogeneic bone particles were fully blended before bong graft. After tumor scraping or resection, the blended bone marrow stromal stem cells and allogeneic bone particles were implanted into the bone defect region. In the bone graft group, the bone defect was implanted with allogeneic bone soaked with saline for half an hour. X-ray examination was performed at 1, 3, 6 and 12 months after treatment to compare the fuzzy boundary and the time for disappear, and the postoperative complications were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: All the 62 patients were followed-up for more than 12 months. The fuzzy boundary time and disappear time in the composite bone marrow stem cells for bone graft group were shorter than those in the bone graft group (P < 0.05). In the composite bone marrow stem cells for bone graft group, one case appeared rejection and healed after treated with immunosuppressive agents for 2 weeks, and no complication observed in two groups. The results indicate that allogeneic bone composite autologous bone marrow stem cells for bone graft can promote bone fusion and bone defect healing.

Key words: organ transplantation, cell transplantation, allogeneic bone, bone marrow stem cells, transplantation, benign bone tumors, tumor-like lesions, bone fusion, bone defect

中图分类号:

R318

刘英飞，王涛，张平德. 同种异体骨复合自体骨髓干细胞移植治疗良性骨肿瘤和瘤样病变[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.012.

Liu Ying-fei, Wang Tao, Zhang Ping-de. Allogeneic bone combined with autologous bone marrow stem cell transplantation for the treatment of benign bone tumors and tumor-like lesions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.012.

图/表（结果） 2

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引言

良性骨肿瘤(包括瘤样病变)外科治疗的选择是根据肿瘤的分期、部位、年龄及患者的病情来确定。原则上，手术既要彻底切除肿瘤，又应尽可能保存正常的骨结构和关节功能。主要治疗方法是将肿瘤刮除或切除后用植骨材料填充骨缺损。
移植骨有两个主要功能，即促进骨形成和提供结构性支持。单从生物学的角度考虑，理想的骨移植材料应能同时提供骨传导基质、骨诱导因子和骨生成细胞这三大要素，也就是说，骨移植应能实现骨传导、骨诱导和骨生成3项功能。天然材料中只有自体骨复合这个要求。目前认为最安全、融合率最高、临床应用最多的植骨材料仍是自体髂骨。但是由于采用自体髂骨有诸多并发症，所以使用人工骨替代自体髂骨具有重要的临床意义。
植骨材料主要有自体骨、同种异体骨、异种骨和无机盐类材料。应用异体骨植骨是一个目前应用较广且行之有效的方法，同种异体骨经过加工已去除其中所含之细胞，可减轻受体的免疫反应，但同时因缺乏活细胞，就不能像自体骨那样具有骨生成功能，缺乏诱导成骨能力是其存在的最大问题，术后延迟愈合、不愈合及骨折等并发症发生率均较高，影响骨缺损的修复。
红骨髓具有成骨能力，其中的骨髓基质干细胞具有成骨作用，骨髓干细胞移植治疗骨不愈合及骨缺损较传统植骨治疗有明显的优势，但是如何获得浓缩、高效的骨髓基质干细胞及其与促进骨缺损愈合的量效关系还需进一步探讨。
文章选择河北北方学院附属第二医院骨科良性骨肿瘤(包括瘤样病变)患者65例，随机数字表法分为复合骨髓干细胞植骨组、单纯植骨组。将肿瘤刮除或切除后，复合骨髓干细胞植骨组骨缺损区内植入混匀的骨髓基质干细胞与同种异体骨颗粒；单纯植骨组骨缺损区内植入同种异体骨颗粒，术后随访12-24个月，疗效满意。

材料方法

设计：回顾性病例对比分析。

时间及地点：于2008年5月至2011年10月在河北北方学院附属第二医院骨科进行。

对象：选择同期本院骨科良性骨肿瘤(包括瘤样病变) 患者65例，其中男34例，女31例，年龄18-35岁，平均年龄25.2岁。术前均经穿刺活检，术后经病理检查明确诊断。

病理诊断：骨囊肿30例，骨巨细胞瘤24例(Ⅰ型14例、Ⅱ型10例)，骨母细胞瘤11例。

肿瘤部位：股骨远端31例，胫骨近端22 例，桡骨远端5例，肱骨近端7例。

按不同病理诊断随机分为两组：复合骨髓干细胞植骨组35例，采用同种异体骨复合自体骨髓干细胞植骨；单纯植骨组30例采用单纯异体骨植骨。本试验经医院伦理委员会批准及患者家属同意，并签署知情同意书。

诊断：术前均经穿刺活检，术后经病理检查明确诊断。

纳入标准：①骨科良性骨肿瘤(包括骨囊肿、骨巨细胞瘤、骨母细胞瘤)。②肿瘤切除后采用同种异体骨复合自体骨髓干细胞植骨或单纯异体骨植骨治疗者。

排除标准：排除伴有内科疾病患者。

植骨材料：采用山西医用组织库生产的同种异体骨冻干骨松质骨颗粒，室温下保存。

方法：

骨髓抽取及骨髓干细胞的分离纯化：患者在无菌条件下，从两侧的髂前上棘或髂后上棘进行穿刺，分不同部位抽取骨髓20-40 mL，置于肝素化无菌离心管中，骨髓离心取出脂肪层，用等量含有体积分数10%胎牛血清及L-谷氨酰胺(0.3 g/L)、抗坏血酸(0.05 g/L)、青霉素钾(10×10⁴U/L)、硫酸链霉素(0.1 g/L)的DMEM培养液稀释骨髓，通过利用Percoll密度梯度离心法^[1-2]，分离骨髓干细胞，用生理盐水洗脱制成细胞悬液，镜下计数为4× 10⁹ L^-1时待用^[3]。

肿瘤切除及植骨：麻醉成功后，常规碘酒、乙醇消毒手术区皮肤2遍后，铺无菌巾。于病灶处行纵行切口，显露骨肿瘤部位，将肿瘤于外科边缘彻底刮除或切除后(刮除或切除物送病理)，用电刀烧灼骨缺损腔，冲洗干净后，用体积分数95%的乙醇浸泡创面5 min，再次冲洗干净后，复合骨髓干细胞植骨组根据肿瘤刮除或切除后缺损的大小，将混匀的骨髓干细胞与同种异体骨颗粒打压植入骨缺损区内，单纯植骨组将相同比例的生理盐水与同种异体骨充分混匀后打压植入骨缺损区内。根据刮除或切除后骨质稳定情况，必要时辅以钢板内固定或石膏外固定，见图1-9。

放置引流管1根，依次缝合关闭切口并加压包扎。肿瘤切除后静脉滴注抗生素2 d。肿瘤切除后病理检查结果与肿瘤切除前检查结果一致。

影像学检查：肿瘤切除后第1，3，6，12个月行患病部位X射线片检查，观察骨质融合情况。采用Jorgenson等^[4]提出的方法，在正、侧位X射线片观察融合区域的骨质融合情况，0级：无明显可见骨质或少量不连续骨小梁；Ⅰ级：无定形骨形成；Ⅱ级：连续性骨小梁形成。判断骨性融合的指征：同种异体骨与正常骨组织间界面模糊，异体骨周围可见骨小梁生长入正常骨组织^[5]。

主要观察指标：①两组患者治疗后X射线检查观察移植骨颗粒界限模糊、消失的时间，植骨融合的时间。②患者治疗后并发症如免疫排斥反应、感染等发生情况。

讨论

骨巨细胞瘤是一种原发、良性骨肿瘤，具有局部侵袭性，多发生于四肢长管状骨骨端，好发部位多见于股骨远端、胫骨近端、桡骨远端、肱骨近端等，50%发生在膝关节周围。20世纪40年代Jaffe对骨巨细胞瘤做了组织病理学分级，主要根据肿瘤内的单核间质细胞与多核巨细胞的相对数量，间质细胞的异型性、核分裂象及巨细胞的大小、核数的多少来划分，分为3级：Ⅰ级为良性，Ⅲ级为恶性，Ⅱ级介于良恶性之间。目前国内广为应用的标准是：具有典型骨巨细胞瘤组织学图像，即以前属Ⅰ级或Ⅰ-Ⅱ级的骨巨细胞瘤组织学图像，且影像学见肿瘤限于骨内者，可以诊断为骨巨细胞瘤，也可冠之以“良性”，但不排除其潜在恶性；如果肿瘤已穿破骨皮质，则诊断为侵袭性骨巨细胞瘤；主张只对那些曾确诊为典型骨巨细胞瘤，现又复发恶变为肉瘤者，或在肿瘤组织中既有典型骨巨细胞瘤，又有肉瘤组织者才诊断为恶性骨巨细胞瘤；原发的恶性骨巨细胞瘤极为罕见。骨巨细胞瘤因生长活跃，侵袭性强，肿瘤可以向髓腔扩展，行囊内刮除术后容易复发。复发的主要原因是刮除不彻底，残存的肿瘤继续生长，导致复发。多年来，对骨巨细胞瘤是否化疗、放疗一直存在争议，且化疗具有一定危险性，放疗还可导致骨巨细胞瘤恶变，因此目前以手术治疗为主。对于“良性”骨巨细胞瘤，以肿瘤刮除或切除后用植骨材料填充骨缺损为主。

单纯性骨囊肿为一种良性肿瘤样病变。肱骨和股骨近端的单纯性骨囊肿约占总数的2/3，其次为股骨远端，胫腓骨近端等，常因并发病理性骨折后被发现，可使关节变形，影响肢体的发育。治疗的目的在于彻底彻底清除病灶，消灭囊腔，防止病理骨折及畸形的发生，恢复骨的坚固性。骨母细胞瘤是一良性成骨性肿瘤，多见于脊柱附件，也可见于长骨的干骺端，在1期(静止期)或2期(活动期)，可进行病灶内刮除并联合局部辅助治疗。

良性骨肿瘤(包括瘤样病变)外科治疗的选择是根据肿瘤的分期、部位、年龄及患者的病情来确定。原则上，手术既要彻底切除肿瘤，又应尽可能保存正常的骨结构和关节功能。手术后骨残腔的处理：可使用乙醇、石碳酸、过氧化氢或高渗盐水等浸泡残腔，也可用氯化锌烧灼残腔壁的，可杀死残存肿瘤细胞，降低局部复发率^[6]。本组病例采用将骨囊肿、骨巨细胞瘤(均为Ⅰ级、Ⅱ级)、骨母细胞瘤等肿瘤彻底刮除或切除后，用电刀烧灼骨缺损腔，冲洗干净后，用体积分数95%的乙醇浸泡创面 5 min，使残存的肿瘤细胞灭活，降低了肿瘤复发率，随诊期内未发现明显复发。

良性骨肿瘤(包括瘤样病变)行肿瘤刮除或切除后用植骨材料填充骨缺损。根据Muschler和Lane的定义，骨移植材料是这样一种植入材料，在单独应用或与其他材料并用植入体内时，可向受体部位提供骨生成、骨传导或骨诱导活性从而启动骨愈合反应。骨生成材料是指含有可分化形成骨的活细胞材料；骨传导材料可部分地起接纳支架的作用，促进新骨形成并使其沉积黏附于材料表面；骨诱导材料可提供生物性刺激，诱导受体床或移植骨上的细胞分化为成熟的成骨细胞。骨移植材料根据其来源可大致分为自体骨、同种骨、异种骨、人工骨及各种复合材料。移植骨有两个主要功能，即促进骨形成和提供结构性支持。单从生物学的角度考虑，理想的骨移植材料应能同时提供骨传导基质、骨诱导因子和骨生成细胞这三大要素，也就是说，骨移植应能实现骨传导、骨诱导和骨生成3项功能。天然材料中只有自体骨复合这个要求^[7]。目前认为最安全、融合率最高、临床应用最多的仍是自体髂骨，自体骨移植优点是：①自体骨表面生存的骨细胞在移植的早期产生新骨，通过骨基质中的骨形成蛋白的骨诱导作用，松质骨的三维结构支持新骨与血管细胞的长入。②无免疫反应，安全性高。但是应用自体髂骨植骨有以下并发症：①延长了手术时间。②增加了患者痛苦(某些患者取骨区有长期慢性疼痛)。③失血量增多。④增加了感染概率。⑤供骨区感觉麻木。此外还有髂骨骨折、异位骨化、骨盆稳定性破坏等，而且骨源有限，儿童不宜采用自体骨移植等缺点。因此自体髂骨移植仍不是理想方法。所以使用人工骨替代自体髂骨具有重要的临床意义。

理想的植骨材料具有良好的生物相容性，有骨诱导性和骨传导性，力学性能和天然骨相近，能支持血管化、降解率和新组织形成速率相互匹配的材料^[8]。应用同种异体骨植骨是一个目前应用较广且行之有效的方法。同种异体骨应用于良性骨肿瘤(包括瘤样病变)刮除或切除后填充骨缺损，其主要作用是骨传导和爬行替代的支架。同种异体骨具有较强的骨传导作用，因植入骨为松质骨，保存了骨的网状支架，其骨小梁容易被新骨爬行覆盖，血管很快长入骨小梁之间，经骨渗入、骨小梁增粗、爬行替代达到骨性融合，促进骨愈合。同种异体骨与宿主骨紧密接触，为爬行替代过程创造了良好的条件。同种异体骨经过加工已去除其中所含的细胞，可减轻受体的免疫反应，而在去除细胞碎屑的同时也减少了携带细胞内病毒颗粒的危险。但同时因缺乏活细胞，就不能像自体骨那样具有骨生成功能，所以诱导成骨能力较弱且没有成骨潜能是其最大问题。术后延迟愈合、不愈合及骨折等并发症发生率均较高。同种异体骨移植的免疫排斥反应是其存活的主要障碍。经过深冻、成型、冻干及γ射线辐照(15-20 kGy)的同种异体骨，保留了天然活性骨形态发生蛋白，天然孔隙结构及机械强度，免疫原性较低。

早在1869年，Comjon就认为红骨髓具有成骨能力，已在动物实验中得到证实^[9-12]。红骨髓中的骨髓干细胞主要包括骨髓基质干细胞和骨髓造血干细胞，其中骨髓基质干细胞具有成骨作用，但是其在骨髓中的含量极少。许多研究表明，存在于骨髓中的骨髓基质干细胞可以在特定诱导条件下分化成成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等^[13-14]。目前认为红骨髓是治疗骨不连及骨缺损首选的移植材料。临床报道较多应用红骨髓移植治疗骨不连或骨缺损。自体骨髓基质干细胞治疗骨缺损的实验研究，大多局限于动物试验，通过取动物骨髓，体外分离培养扩增骨髓基质干细胞，与生物材料混合后植入体内修复骨缺损^[15-22]，观察自体骨髓干细胞移植促进骨愈合的能力。因为研究多为动物试验，故研究结果不可能与临床情况完全吻合，目前趋向有严格设计的和大规模的临床试验。

本组病例通过初步分离、纯化，取出血清及血细胞，经培养扩增得到密度相对较高的骨髓干细胞，将其与同种异体骨混合植骨应用于良性骨肿瘤(包括瘤样病变)刮除或切除后填充骨缺损，促进骨质融合，取得良好疗效，较对照组有明显差异性。如果能够分离出骨髓中起主要作用而含量极少的骨髓基质干细胞并培养、扩增，应用临床疗效会更好。

实验室研究表明，在使用坚固的固定装置时，骨融合率较高，融合骨块强度增强^[23]。同种异体骨颗粒为松质骨，在干燥后属于脆性材料，复水后为塑性材料，容易因受力而变形，使用前在生理盐水中浸泡复水后的松质骨，主要用于填充和融合，并不是负重。本组病例根据刮除或切除后骨质稳定情况，辅以钢板内固定或外固定。牢固的内固定或外固定，使同种异体骨与宿主骨融合的骨质条件得以改善。因此，对植骨融合技术操作的前提是保持骨肿瘤刮除或切除后骨质的稳定。

通过对这组病例的比较发现，同种异体骨复合自体骨髓干细胞植骨应用于良性骨肿瘤刮除或切除后填充骨缺损，具有明显的优势：①操作简单、安全，减轻了患者的心理及经济负担。②同种异体骨复合自体骨髓干细胞来源相对丰富，抗原性减弱。③创伤小，痛苦少，治疗后并发症少，能明显促进骨融合和骨缺损的愈合。

文章快阅

延伸阅读

印卫锋等（2009年）评价了良性骨肿瘤及瘤样病变刮除或切除后应用同种异体骨复合自体红骨髓修复骨缺损的效果。选择良性骨肿瘤及瘤样病变108例患者，男58例，女50例：年龄10-58岁，平均32岁。其中采用异体骨复合白体浓缩红骨髓植骨52例（复合红骨髓植骨组）；单纯异体骨植骨56例（单纯植骨组）。复合红骨髓植骨组患者根据预计植骨量从每位患者两侧的髂前上棘或髂后上棘抽取红骨髓40-100mL，在植骨前将同种异体骨与红骨髓充分混匀。肿瘤刮除或切除后，用电刀烧灼骨缺损腔，将同种异体骨剪成细小的短棒状或修成2mm见方的块状，植入骨缺损区内。单纯植骨组将相同比例的生理盐水与同种异体骨充分混匀后植入骨缺损区内。主要观察指标：术后定期进行植骨区X射线检查及骨密度检测，比较两组间移植骨颗粒界限模糊、消失的时间及不同时间骨密度的情况。同时观察术后并发症如免疫排斥反应、感染等发生情况。结果显示：100例患者达骨性融合（复合红骨髓植骨组49例，单纯植骨组51例），并获得24个月随访，数据进入结果分析。复合红骨髓植骨组移植骨界限模糊时间和消失时间均短于单纯植骨组（P〈0．05-0．01）。术后3，6，12个月时复合红骨髓植骨组骨密度高于单纯植骨组（P〈0．05-0．01）。复合红骨髓植骨组2例，单纯植骨组3例出现排异反应，使用免疫抑制剂治疗两三周后痊愈。说明同种异体骨复合自体红骨髓来源相对丰富，抗原性减弱，能明显促进骨融合和骨缺损的愈合。
作者采用手工检索及联机检索等手段在以下范围内进行检索：中国学术期刊网络出版总库；中国博士学位论文全文数据库/中国优秀硕士学位论文；全文数据库（2012年版）中国重要会议论文全文数据库（2012年版）；中国重要报纸全文数据库；中国专利全文数据库（1985-2012）；互联网资源库。同种异体骨复合自体骨髓干细胞移植治疗良性骨肿瘤和瘤样病变除本文外，在国内文献中未见相同报道。