全膝关节置换假体松动时滑膜液中的诊断性标志物

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.26.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：人工关节置换后的无菌性假体松动一直是全膝关节置换后常见的并发症，是否与骨性关节炎的发生时的腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子等许多细胞因子的作用密切相关？
目的：观察全膝关节置换后无菌性假体松动发生时假体滑膜液中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和腱糖蛋白c的表达。
方法：实验组选择45例全膝关节置换翻修患者，对照组为25例首次进行膝关节置换的患者。实验排除炎性关节炎、二次关节炎感染至全身或自身免疫病以及合并肝炎、恶性肿瘤、服用激素、免疫抑制剂等疾病史的患者。取各组患者假体滑膜液，Western blot检测腱糖蛋白c剪切变异体的表达，ELISA分析假体滑膜液中白细胞介素6，肿瘤坏死因子α和腱糖蛋白c水平的变化。
结果与结论：Western blot结果显示假体松动后假体滑膜液中存在大的腱糖蛋白c突变体。假体松动后滑膜液中白细胞介素6、腱糖蛋白c的水平大约是对照组的3倍，肿瘤坏死因子α水平大约是对照组的2.5倍。证实假体松动后假体滑膜液中腱糖蛋白c的含量升高，提示腱糖蛋白c可以作为诊断假体松动有效的标志物。

关键词: 骨关节植入物, 人工假体, 关节置换, 无菌性松动, 滑膜液, 腱糖蛋白c, 白细胞介素6, 肿瘤坏死因子α, 标志物, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Aseptic loosening of the prosthesis is a common complication after total knee arthroplasty. Whether the loosening of the prosthesis has relationship with the levels of tenascin-C, interleukin-6 and tumor necrosis factor is not clear.
OBJECTIVE: To observe the expressions of interleukin-6, tumor necrosis factor α and tenascin-C of the patients with aseptic prosthesis loosening after total knee arthroplasty.
METHODS: Forty-five patients treated with total knee arthroplasty and revision surgery were selected as the experimental group, and 25 patients treated with initial total knee arthroplasty were selected as the control group. In the experimental group, the patients with history of inflammatory arthritis, systemic secondary arthritis infection, autoimmune disease and combined hepatitis, malignant tumors, hormones or immunosuppressants administration were eliminated. Synovial fluid samples of the prostheses in each group were obtained, and the expression of tenascin-C shear variants in synovial fluid was tested with Western-blot. The levels of interleukin-6, tumor necrosis factor α and tenascin-C were analyzed with enzyme-linked
immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot results showed the presence of large tenascin-C variants in the synovial fluid of prostheses with loosening. The interleukin-6 and tenascin-C levels in the synovial fluid of prosthesis loosening were approximately three times higher than those in the control group, and tumor necrosis factor α level in the synovial fluid of prosthesis loosening was approximately 2.5 times higher than that in the control group. Levels of tenascin-C including large variant subunits are elevated in synovial fluid of prosthesis loosening, indicating that tenascin-C is a useful novel biochemical marker of prosthesis loosening.

Key words: bone and joint implants, artificial prosthesis, arthroplasty, aseptic loosening, synovial fluid, tenascin-c, interlenkin-6, tumor necrosis factor α, marker, cytokine

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析实验组45例与对照组25例均进入结果分析。

2.2 参与者基线资料全膝关节置换后假体松动患者与首次进行关节置换患者性别构成和年龄的差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性，所有参与者基线资料见表1。

2.3 假体松动后假体滑膜液中腱糖蛋白c表达水平的变化通过Western blot检测，发现全膝关节置换后假体松动时滑膜液中存在大的腱糖蛋白c可变体(包含FNIIIC结构域，相对分子质量为350 000)，有比较明显的条带。

4F10TT抗体能够特异性的结合表皮生长因子样结构域，可检测到假体滑膜液中相对分子质量在所有210 000-350 000的所有腱糖蛋白c可变体[12]。最大的腱糖蛋白c可变体(L)相对分子质量为350 000。而最小的可变区(S)，缺乏可选择性剪接FNIII重复结构域，相对分子质量为210 000[12]，在实验中标记的效果很差。19C4MS能够特异性的结合较大的腱糖蛋白c可变，可检测到相对分子质量在350 000-240 000之间和 200 000之下的蛋白[12]。没有检测到19C4MS标记相对分子质量在210 000的腱糖蛋白c可变体，见图1。

这些结果显示，由于假体松动导致翻修手术的患者，假体滑膜液中大的腱糖蛋白c可变体的表达水平明显升高。

2.4 假体松动后假体滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达水平的变化 ELISA定量检测患者全膝关节置换后假体松动时假体滑膜液中腱糖蛋白c的水平为(160.8±20.5) μg/L，大约是全膝关节置换后对照组的3倍，为(53.3±9.1) μg/L(P=0.036)；假体滑膜液中白细胞介素6的水平为(130.1±19.6) ng/L，也是对照组的3倍(40.7±19.8) ng/L，(P=0.000 1)；假体滑膜液中肿瘤坏死因子a的水平为(23.1±11.3) μg/L，大约为对照组的2.5倍(9.2±3.1) μg/L(P=0.000 3)。

在松动的人工关节的假体滑膜液中，腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α质量浓度见表2-4，这些因子的水平不受患者性别，年龄以及从首次置换手术至翻修手术时间的影响。

ELISA结果显示，全膝关节置换后假体松动时假体滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α含量与对照组相比都明显升高，见图2。

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引言

人工关节置换是治疗晚期关节病变的一种有效的手段，全世界每年大约有100万患者接受此类手术^[1]。全膝关节置换是目前比较成熟的一种关节置换方法，成功率很高，但是无菌性假体松动一直是全膝关节置换后最常见的远期并发症^[2]。

无菌性假体松动主要是由于人工周围关节组织在抵抗超高分子量的聚乙烯、金属和骨接合物的磨损产物时产生的机械应力和生物反应所导致的^[3]。但目前由于缺乏有效的检测手段和指标，临床上对假体置换后感染的诊断和治疗仍然非常困难。了解关节假体置换后假体松动发生时假体滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的变化，为进一步寻找高特异性的检测指标提供理论依据，具有非常重要的意义。

骨性关节炎的发生与腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子等许多细胞因子的作用相关^[4-5]。已有大量证据表明在关节置换假体松动时的滑膜液中除了可以检测到层粘连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白^[6-7]，还可以检测到高表达的腱糖蛋白c^[8]。正常人的关节滑膜液中白细胞介素6的含量很低，但处于早期的骨性关节炎患者关节滑液中白细胞介素6的含量明显增加，而随着骨性关节炎的发展，关节滑液中白细胞介素6水平呈下降趋势，说明白细胞介素6与关节软骨的代谢和增殖有关系^[9-10]。

另有研究证明，肿瘤坏死因子α对骨性关节炎的破坏主要体现在滑膜的炎性变方面，肿瘤坏死因子α刺激纤维细胞所释放的黏附分子与血液中的白细胞相互作用，进而聚集到关节腔内对关节软骨细胞造成破坏^[11]。目前对于全膝关节置换后发生假体松动时，假体滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的变化和相关机制研究甚少，有学者证实全膝关节置换后松动假体表面生物膜中表达腱糖蛋白c^[12]、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α^[13]。

实验旨在通过检测总膝关节置换翻修手术患者的假体滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达水平，与首次进行膝关节置换的患者进行比较，明确假体松动时腱糖蛋白c、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达变化，为假体感染的早期诊断和有效治疗提供理论依据。

材料方法

设计：非随机同期对比分析。
时间及地点：于2010年1月至2011年8月在解放军空军总医院骨科完成。
假体滑膜液检测的主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments:

对象：全膝关节置换后假体松动组(实验组)选择2010年1月至2011年8月在在空军总医院骨科施行关节置换翻修患者。
诊断标准：①有膝痛。②有骨摩擦音。③晨僵< 30 min。④年龄>38岁。⑤有骨性膨大关节。满足①+②+③+④或①+②+⑤或①+④+⑤条即可诊断。由专业医生按膝关节X射线轴位片骨关节炎Kellgren & Lawrence分度要点阅片评分[14]，同时，通过血清中的白细胞介素6以及C-反应蛋白的水平也可辅助确定关节炎的严重程度。
纳入标准：①符合诊断标准。②首次翻修患者。③患者对实验表示知情理解，同意将自己的假体滑膜液用于实验，并签署知情同意书配合研究。
排除研究：排除炎性关节炎、二次关节炎感染至全身或自身免疫病以及合并肝炎、恶性肿瘤、服用激素、免疫抑制剂等疾病史的患者
实验组最终纳入45例关节置换翻修患者，其中男20例，女25例；年龄55-69岁，平均(58.1±7.6)岁。45例患者进行全膝关节置换的原因分别是骨性关节炎(n=31)及类风湿性关节炎(n=14)。所有患者均为首次翻修，从首次膝关节置换手术至第1次翻修手术时间为4.1-25.3年，平均9.8年。研究获得北京市伦理学会的同意。
同时选择同时期由于骨性关节炎施行首次关节置换的患者作为首次进行关节置换组(对照组)，排除置换前有严重内科疾病以及凝血机制障碍、感染的患者。最终选择25例患者，其中男13例，女12例，年龄46-58岁，平均年龄(51.4±2.7)岁。
方法：
膝关节置换方法：所有患者膝关节置换均由同一组医生完成。
置换方法：手术常规选取膝关节正中切口，切开关节囊，清理关节后，根据关节不同的破坏情况行截骨及软组织平衡处理，采用抗生素骨水泥固定假体。
翻修方法：取出膝关节所有部件，进行滑膜液病检。脉冲冲洗枪清洗膝关节，采用后稳定型膝关节假体置换，抗生素骨水泥进行假体固定。
Western blot分析检测滑膜液中腱糖蛋白c的表达水平：参照文献[15]的方法进行，采用吸引术提取患者的滑膜液，8倍稀释的滑膜液样品在2%-15%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并转染到硝酸纤维素膜上，转移膜用封闭液(TBS缓冲液，pH 7.6和0.5%的脱脂牛奶)在室温条件下封闭60 min，冲洗后加入抗腱糖蛋白c的单克隆抗体(4F10TT，抗上表皮生长因子样结构域或19C4MS抗FNIIIC结构域)在4 ℃下孵育过夜。再用封闭液冲洗膜3次，加入过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶400)室温下孵育1 h，洗涤膜2次后用二氨基联苯胺/H2O2溶液染色，将胶片进行扫描或拍照，凝胶图像处理系统分析目标带的分子量。实验重复3次。
ELISA定量检测滑膜液中腱糖蛋白c水平：收集患者的滑膜液，于15 000 r/min离心15 min，取上清-80 ℃储存备用。应用ELISA试剂盒和2种单克隆抗体(4F10TT和19C4MS)检测包含FNIIIC结构域的腱糖蛋白c大亚基的表达水平。样品10倍稀释后接种于涂有19C4MS 抗体的96孔ELISA平板中37 ℃孵育1 h。冲洗96孔板2次，加入由辣根过氧化物酶标记的抗腱糖蛋白c碎片的抗体4F10TT Fab 4 ℃孵育30 min，ELISA酶联仪在450 nm处测定吸光度，结果取相同孔的平均值。
作者所在实验室冻存的人胶质瘤细胞的选择性培养基中纯化出腱糖蛋白c蛋白制作标准曲线。这个实验的检测限度是0.4 μg/L，批内变异系数为0.5%-13%。
ELISA定量检测滑膜液中白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平：收集患者的滑膜液4 mL，离心去除细胞和碎片，留取血清-80 ℃保存或进行后续分析。白细胞介素6和肿瘤坏死因子α质量浓度的测定应用双抗夹心酶联免疫吸附测量法测定，所有操作均按照相应检测试剂盒的说明书，在免疫分析仪上完成。白细胞介素6的正常参考值范围为0.00-1 500 ng/L。
主要观察指标：翻修患者与首次关节置换患者滑膜液中腱糖蛋白c、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子α的表达水平。
统计学分析：所有计量资料均以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0软件(美国SPSS公司)进行分析，组间比较采用单因素ANOVA方差分析，组内比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

人工全膝关节置换是中国20世纪90年代开展的一项新的关节成形手术，已成为治疗晚期膝关节病变的非常有效的手段，由于新材料假体的使用和手术操作技术的改进，成功率很高。但是关节置换后常常会发生假体松动^[3^，^16]，从而引发一系列的炎症反应。

炎症反应主要通过一系列化学因子的介导而实现，这些化学因子根据其作用和产生时间可以分为2类^[17]：促炎症细胞因子或前炎症细胞因子，如白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子等，主要介导组织损伤，刺激继发性炎症递质的释放^[18]。

假体松动后，假体滑膜液中肿瘤坏死因子α的表达含量仍然很高，肿瘤坏死因子α是由单核巨噬细胞系统产生的一种肽类激素，是一种强有力的促炎症细胞因子，是集体炎症和免疫反应的调节因子。肿瘤坏死因子α作为炎症反应的枢纽，可以诱导白细胞介素6协同作用因子的释放。在松动的假体滑膜液中白细胞介素6，肿瘤坏死因子α水平都上调^[19]，这些细胞因子的变化可以诱导腱糖蛋白c的表达增加^[20]。

人工关节假体周围组织中腱糖蛋白c的表达意味着在周围组织中存在持续的伤口愈合及修复过程，膝盖人工假体的微动对相邻的结缔组织产生机械压力，这些压力能够影响腱糖蛋白c的表达^[21-22]。

在有效的连接空间内，局部产生的腱糖蛋白c受细胞因子和机械压力刺激，能够导致假体松动。在假体松动的早期，腱糖蛋白c导致细胞和胞外基质的黏附松弛，能够有效的减少由于机械压力导致的细胞损坏，促进组织修复。但是，高表达的腱糖蛋白c能够提高金属蛋白激酶的表达，已有证据显示，在假体滑膜液中金属蛋白激酶的含量升高^[23-25]，这些高表达的金属蛋白激酶促使假体松动。因此，高表达的腱糖蛋白c导致周围组织过度的组织重塑，加速了假体的松动。腱糖蛋白c拥有FN III结构域，因此很容易发生蛋白裂解^[26]，并且能够与不同的配体相互作用，包括整合素、肝素，并且能与其他的细胞外基质分子发生作用^[27-28]，比如纤连蛋白^[29]。前期已有研究发现全长的腱糖蛋白c蛋白能够参与骨性关节炎患者的伤口修复^[30-31]，Sofat等^[32]发现，腱糖蛋白c降解以后，蛋白片段拥有蛋白水解活性，能够调节关节软骨的异化途径。但是腱糖蛋白c在骨性关节炎中的具体作用机制的研究还不是很清楚，需要进一步的试验炎症。

总之，实验证明了在全膝关节置换后假体松动时假体滑膜液中腱糖蛋白c大的突变体的含量明显提高，揭示这些突变体可以作为诊断全膝关节置换后假体松动的有效的生物标志物。为了阐明这些标志物的重要性，需要进一步研究腱糖蛋白c在假体松动中的双向作用。