Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.021

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4515-4520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.021

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型

董刚^{1, 2}，郑建金¹，李涛¹，徐欣²，卢恕来¹

1 青岛市市立医院口腔科，山东省青岛市 266011
2 山东大学口腔医学院种植中心，山东省济南市 250012

收稿日期:2012-09-12 修回日期:2012-10-08 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 郑建金，教授，硕士生导师，主要从事口腔颌面外科的研究。 ZHjj19631016@sina.com
作者简介:董刚☆，男，1974年生，山东省滨州市人，汉族，山东大学在读博士，主治医师，主要从事颌面部肿瘤与种植修复的研究。 donggangann@sina.com
基金资助:
青岛市科技局项目(08-2-1-5-nsh，11-2-3-2-(7)-nsh)；青岛市卫生局项目(2008-wsj024，2012-wsj051)

A Wistar rat model of radiation-induced masseter injury

Dong Gang^{1, 2}, Zheng Jian-jin¹, Li Tao¹, Xu Xin², Lu Shu-lai¹

1 Department of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China
2 Implant Center, Stomatological Medical College of Shandong University，Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2012-09-12 Revised:2012-10-08 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Zheng Jian-jin, Professor, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China ZHjj19631016@sina.com
About author:Dong Gang☆, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China; Implant Center, Stomatological Medical College of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China donggangann@sina.com
Supported by:
Key Project of Qingdao Science and Technology Bureau, No. 08-2-1-5-nsh*, 11-2-3-2-(7)-nsh*; Project of Qingdao Health Bureau, No. 2008-wsj024*, 2012-wsj051*

摘要/Abstract

摘要：

背景：构建稳定可靠的咬肌放射损伤模型对颌面部肿瘤放疗的相关研究有重要意义。
目的：以放射剂量40 Gy照射后Wistar大鼠咬肌构建大鼠咬肌放射损伤模型。
方法：成年Wistar大鼠20只，随机分成正常对照组和放射损伤组。放射损伤组采用直线加速器照射大鼠咬肌区累积40 Gy制造咬肌放射损伤。在28 d后，在光镜及电镜下观察咬肌放射区病理改变，RT-PCR检测转化生长因子β1的基因表达。
结果与结论：40 Gy照射后28 d大鼠咬肌区出现结构受损、血管密度减低(P < 0.01)等放射损伤表现，同时引起转化生长因子β1的基因表达升高(P < 0.001)等机体被动修复表现。结果证实Wistar大鼠咬肌区直线加速器40 Gy照射可以作为咬肌放射损伤模型。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 放射损伤, 动物模型, 转化生长因子β1, 血管密度, 咬肌, 放射疗法, 颌面部, 超微结构, 基因表达, 病理改变, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Construction of a stable animal model of radiation-induced masseter injury is significant for the research of maxillofacial region tumor.
OBJECTIVE: To establish the animal model of Wistar rats with radiation-induced masseter injury after irradiated with the radiation dose of 40 Gy.
METHODS: A total of 20 male adult Wistar rats were selected and randomly divided into radiation injury group and control group. Radiation injury group was radiated with linear accelerator at a dose of 40 Gy in the masseter tissue. After irradiated for 28 days, pathological changes in the masseter tissue of the radiation injury group and control group were observed by light microscope and electron microscope; the gene expression of transforming growth factor-β1 was detected by reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After irradiated for 28 days at the dose of 40 Gy, the irradiation injury of structural damage and reduced vascular density were observed in the masseter tissue (P < 0.01), and the gene expression of transforming growth factor-β1 was increased (P < 0.001). The result indicates that masseter tissue irradiated with linear accelerator at a dose of 40 Gy can be considered as the model of radiation-induced masseter injury.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, radiation injury, animal model, transforming growth factor-beta 1, vascular density, masseter, radiation therapy, maxillofacial, ultrastructure, gene expression, pathological changes, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

董刚，郑建金，李涛，徐欣，卢恕来. Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4515-4520.

Dong Gang, Zheng Jian-jin, Li Tao, Xu Xin, Lu Shu-lai. A Wistar rat model of radiation-induced masseter injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4515-4520.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2008年4月至2009年4月在青岛市市立医院中心实验室完成。

材料：SPF级雄性Wistar大鼠20只(东鲁抗- SLXK鲁20080002)，300-350 g，10只作为放射损伤组，10只作为对照组。

建立Wistar大鼠咬肌放射损伤模型实验所需试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

放射损伤：放射源采用直线加速器6 MeV电子线，500 cGy/次，2次/周，总剂量40 Gy (4 000 cGy)。源皮距SSD 100 cm ，剂量率DR 500 Mu/min，组织补偿垫0.5 cm厚。1.2 cm厚铅模防护周围正常组织，设4孔每孔照射视野1.6 cm×2.8 cm。照射孔经剂量检测：每孔中心点剂量差≤±5%，相同照射深度条件下，照射对称性≤±3%。

建立Wistar大鼠咬肌放射损伤模型：放射损伤组大鼠用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后将大鼠侧卧位束缚于实验动物固定板上实施照射，事先在咬肌区表面中心做染色标记，以减小多次放射视野标偏差。放疗后室温20-25 ℃下侧卧位苏醒，防止窒息。对照组不进行照射处理，同标准饲养。

损伤结果的鉴定：

样本采集及处理：累计照射总剂量40 Gy后第28天，取放射损伤组放射视野中心区咬肌组织和对照组咬肌组织，于体积分数10%甲醛溶液中固定，脱水，浸蜡，苏木精-伊红染色制片以便光学显微镜下观察病理改变；将相同部位的放射损伤组和对照组咬肌组织块置于1.5 mL EP管中-80 ℃冻存，以备分子生物学检测；将相同的放射损伤组及对照组咬肌组织块约1 mm× 1 mm×1.5 mm大小，40 g/L戊二醛固定，进行丙酮梯度脱水，利用环氧树脂包埋，以备利用透射电镜超微结构的病理改变观察。

咬肌毛细血管密度定量分析：将放射损伤组及对照组组织片，置于倒置显微镜及Leica Q500显微成像系统，每组织片在200倍视野下，随机选取10个视野进行毛细血管计数。

mRNA 提取：参照华舜反转录试剂盒说明提取转染细胞的总RNA。进行RT-PCR扩增目的基因转化生长因子β1，上游引物：GAC TCT CCA CCT GCA AGA CCA T ，下游引物: GGG ACT GGC GAG CCT TAG TT，采用上海华舜W5211回收试剂盒回收目的基因。将带有照射及非照射条件的cDNA作为模板，RT-PCR扩增目标基因转化生长因子β1，采用2%琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测。

主要观察指标：放射损伤组及对照组毛细血管密度情况；放射损伤组及对照组扩增目标基因转化生长因子β1的表达差异。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件对实验和对照组目标区毛细血管密度、转化生长因子β1的表达差异进行分组资料的t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

放射线治疗是口腔颌面恶性肿瘤的重要治疗手段。放疗过程中不可避免地导致邻近组织器官放射损伤影响其功能^[6]。骨骼肌相较于黏膜有较高的辐射抵抗性，以往对其研究较少，但研究表明随时间和剂量累积，肌纤维将出现炎症、纤维化及功能萎缩，其对远期功能的影响十分明显。Nichol等^[7]发现，患者在接受56 Gy放射治疗两三年后，照射区肌群有明显萎缩。头颈部放疗患者中也发现，最终都因软组织放射性损伤而影响口腔活动度，严重影响生活质量^[8-9]。其病理改变可能与放射线损伤肌纤维间隙中的毛细血管网，影响软组织的血供有关^[10-11]，深层次的机制及预防或治疗等问题的待研究需要一个稳定的动物模型。这样一个模型应当要具备以下特点：①模拟放射治疗过程，产生典型的放射损伤。②损伤后机体组织仍有一定的修复能力，以便为预防或治疗提供干预基础。③剂量和控制条件准确、副损伤小、可重复性强，以保证模型的稳定性。

实验参考目前口腔颌面部肿瘤常用的放射视野，以咬肌作为照射目标，模拟患者在放疗后咬肌的辐射损伤，并观察临床反应、组织形态学及分子生物学方面的改变。以期获得一定剂量和照射条件下稳定的辐射损伤结果和并引起一定的机体修复反应。从而建立于咬肌放射损伤模型，为相关放疗损伤与修复研究提供平台。

3.1 麻醉与放射条件控制 放射线剂量参照快速生物学估算方法确定^[12]。实验中模拟患者分割放疗，固定体位照射，目标区中央标记，照射前投影下确认照射野，以提高照射视野的准确性和多次操作的可重复性。实验中，参考相关动物麻醉研究^[13]，单次5 Gy，共照射8次，以减少多次照射时多次麻醉药物蓄积呼吸抑制的风险。实验动物无一例死于照射前麻醉，明显降低实验中麻醉风险。

在大鼠照射侧覆盖一层1 cm厚保护垫,以虑过低能射线，使放射剂量集中于骨骼肌，减少表层皮肤损伤；经测算确定设备参数，并在模拟野实测有效剂量，以保证目标区照射剂量的准确性。实验中放疗后，大鼠进食正常，放射区没有出现皮肤溃疡或糜烂，说明剂量的选取和控制可以达到要求。

3.2 放射损伤的病理学确认 放射损伤组40 Gy照射后出现纤维之间隙增大，毛细血管肿胀、玻璃样病理改变，管腔内可见血栓形成，结缔组织离散，炎症细胞浸润等组织放射损伤改变；毛细血管数较对照组明显少意味着放射损伤影响了新生血管的形成，组织的代谢和修复能力受到削弱^[14]。电镜下发现，其毛细血管内皮结构及肌细胞的三联管，肌浆网，线粒体等出现异常。说明在40 Gy照射后，组织超微结构也出现损伤，严重影响了咬肌细胞的功能，将导致整体组织器官的功能障碍^[15-16]。上述表现说明目前条件下导致了典型的放射治疗损伤。

3.3 放射损伤后修复反应 目前认为转化生长因子β1能参与组织放射后修复的过程，其主要通过因损伤导致组织间炎症反应引发的细胞外基质及间质细胞的增生，迁移及累积；在刘慧等^[17]研究发现，转化生长因子β1可以调节和抑制细胞生长据有免疫抑制活性，促进细胞外基质沉积，如间质细胞或成纤维细胞增殖，在组织细胞的损伤和愈合过程中有着重要的作用,当组织损伤后修复过程中可能触发转化生长因子β1信号通路，继而增加其生物学活性，促进组织修复但也同时增加了组织纤维化的可能。在实验中放射损伤组咬肌组织内转化生长因子β1 mRNA表达高于对照组，这与在Liu等^[5]及Gervaz 等^[18]实验中组织经放射线照射后组织中转化生长因子β1的mRNA及蛋白均呈现高表达的发现是一致的。说明实验在放射治疗损伤的基础上出现了被动修复表现。

上述证据表明，本实验条件下，不仅能够形成典型的放射损伤，并能激发一定程度的被动修复反应，并且剂量准确、控制条件准确、可重复性强，可作为放射损伤与修复相关研究的模型。

Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型

A Wistar rat model of radiation-induced masseter injury

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