大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4232-4239.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.008

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大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨

李玲慧¹，丁道芳¹，龚浩²，杜国庆¹，宋奕¹，邓真¹，詹红生¹

1上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海市 201203
2中国中医科学院，北京市 100102

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 詹红生，教授，主任医师，博士生导师，上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海市 201203 zhanhongsheng2010@163.com
作者简介:李玲慧☆，女，1986年生，山东省青岛市人，汉族，上海中医药大学在读博士，主要从事中医药治疗骨质疏松症的机理研究。270641352@qq.com
基金资助:
中医骨伤科学”国家重点学科(100508)；
国家自然基金项目(81073114，81001527，81102603，81173621)；
上海领军人才项目(041)；
上海高校“中医脊柱病损研究”创新团队建设项目(2009-26)；
上海市科委重点项目(09dZ1973800，08411950300，11DZ1973400，11XD 1404600)。

Isolation, culture and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells from the abdominal cavity of rats

Li Ling-hui¹, Ding Dao-fang¹, Gong Hao², Du Guo-qing¹, Song Yi¹, Deng Zhen¹, Zhan Hong-sheng¹

1 Institute of Traumatology & Orthopedics, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
2 China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Zhan Hong-sheng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Institute of Traumatology & Orthopedics, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China zhanhongsheng2010@163.com
About author:Li Ling-hui☆, Studying for doctorate, Institute of Traumatology & Orthopedics, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 270641352@qq.com
Supported by:
National Key Disciplines of China (Orthopedics and Traumatology of Traditional Chinese Medicine), No. 100508*;
the National Natural Science Foundation of China, No. 81073114*, 81001527*, 81102603*, 81173621*;
Shanghai Leading Talents Project, No. 041*;
Spinal Cord Diseases of Traditional Chinese Medicine Innovation Team Construction Program for Universities in Shanghai, No. 2009-26*;
Key Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission, No. 09dZ1973800*, 08411950300*, 11DZ1973400*, 11XD1404600*.

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞取材方便、增殖旺盛、具有多向分化潜能，有望取代骨髓间充质干细胞而成为新一代组织工程的种子细胞。然而，脂肪干细胞的分离培养仍存在诸多困难与不足。
目的：优化脂肪干细胞的分离培养方法，并鉴定其成骨分化潜能。
方法：选取200 g成年雌性大鼠1只，无菌环境下切取大鼠肾脏、子宫周围及腹后外侧白色脂肪组织，多次胶原酶消化法分离消化，低糖培养基培养脂肪干细胞，倒置显微镜下观察脂肪干细胞的形态变化及增殖能力。采用成骨诱导培养液对第3代细胞进行成骨诱导，并采用碱性磷酸酶、茜素红染色方法进行鉴定。
结果与结论：脂肪干细胞形态以长梭形为主，增殖活跃呈旋涡状生长。经成骨诱导10 d后，碱性磷酸酶染色为阳性；成骨诱导28 d后，茜素红染色阳性。提示采用多次酶消化法得到的大鼠腹腔源性脂肪干细胞在体外易于分离培养，可以稳定传代。在一定条件诱导下，可以向成骨细胞分化。采用以上方法进行脂肪干细胞的分离培养可以为组织工程提供大量、优质的种子细胞。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 种子细胞, 分离培养, 成骨分化, 诱导, 腹腔, 矿化结节, 碱性磷酸酶, 矫形外科, 组织工程, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells could be obtained easily with rapid proliferation and multi-directional differentiation potential, so they are promising to be seed cells of tissue engineering instead of bone marrow stromal stem cells. However, the isolation and culture of adipose-derived stem cells still remain lots of difficulties.
OBJECTIVE: To optimize the methods of isolation and culture of adipose-derived stem cells, and identify the ability of osteogenic differentiation.
METHODS: The adipose tissues were obtained from the kidney, peri-uterus and abdominal cavity of one adult female rat weighing 200 g under sterile conditions. Adipose-derived stem cells were isolated by the method of collagenase digestion for several times and cultured with low-glucose medium. The morphologic changes and proliferation of adipose-derived stem cells were observed under inverted microscope. The passage 3 adipose-derived stem cells were cultured in osteogenic medium and then identified with alkaline phosphatase staining and alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells were mainly spindle-shaped and proliferated quickly with whirlpool-shaped arrangement. After osteogenic induction for 10 days and 28 days, the results of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were both positive. Experimental findings indicate that, adipose-derived stem cells isolated from abdominal cavity of rat by the method of collagenase digestion for several times can easily be cultured and passaged in vitro, and allow stable passaging and differentiation into osteoblasts under certain induction conditions. The isolation and culture methods for the adipose-derived stem cells may offer more and better seed cells for tissue engineering.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, seed cells, isolation and culture, osteogenic differentiation, induction, abdominal cavity, mineralization nodules, alkaline phosphatase, orthopedic surgery, tissue engineering, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

李玲慧，丁道芳，龚浩，杜国庆，宋奕，邓真，詹红生. 大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4232-4239.

Li Ling-hui, Ding Dao-fang, Gong Hao, Du Guo-qing, Song Yi, Deng Zhen, Zhan Hong-sheng. Isolation, culture and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells from the abdominal cavity of rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4232-4239.

图/表（结果） 3

2.1 倒置显微镜下脂肪干细胞形态学观察结果 见图1。

倒置相差显微镜下观察培养的原代细胞，接种1 h后，培养基中可见少量漂浮的红细胞，上层液面可见大量脂滴，培养皿中大多数细胞已开始贴壁，折光性良好，但形态尚未展开，呈圆点状或短梭形。
24 h首次换液，PBS清洗1次，观察细胞可见红细胞已大部分被去除，脂滴数量明显减少，培养皿中大部分细胞已完全贴壁，呈长梭形均匀分布于培养皿中，无明显集落形成。72 h后观察，细胞增殖旺盛、形态一致，呈旋涡状生长，已铺满整个培养皿，见图2。原代培养7 d左右，细胞围绕各中心呈集落样生长，见图3。

若继续培养，可见细胞内有少量脂肪颗粒开始聚集，单纯清洗无法清除；随着培养时间的增加，脂滴逐渐增大增多，细胞形态也随之增大。2周左右，细胞培养皿中出现多处局部脂滴堆积及白斑，脂肪细胞成片卷缩、脱离。
以上现象充分说明，此类干细胞具有自发的向脂肪细胞分化的趋势。作者在研究中发现，随着细胞的传代，脂滴出现的量不断减少，约第3代后，细胞逐渐丧失自发向脂肪细胞分化的能力，持续培养3周内并无明显脂滴出现，细胞始终保持梭形。
若将细胞以1∶3进行传代，传代后的细胞约30 min即可贴壁，形态单一，仍保持长梭形；细胞增殖旺盛，密度高时可见局部呈漩涡状或集落样排列，每代细胞约3 d便可生长至汇合状态。传代至第15代后，细胞仍维持长梭状形态，增殖旺盛、排列整齐，未见明显衰老、凋亡或大量脂滴生成。
2.2 脂肪干细胞成骨诱导分化结果 见图4，5。
第3代脂肪干细胞成骨诱导后，细胞由细长的梭形结构逐渐变宽大，继续诱导可见其形态逐渐不规则，呈多角形或多边形。诱导10 d后进行碱性磷酸酶染色，可见细胞核呈蓝紫色，胞浆中亦有深染颗粒，显示为阳性，说明所培养的细胞具有分泌碱性磷酸酶的功能，见图4。
诱导28 d后细胞呈现重叠生长，局部堆积成团块，形成钙结节，茜素红染色呈橘红色，见图5。

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引言

骨骼系统对机体有着支撑、运动和保护的作用，骨缺损的修复是目前临床急需解决的难题。目前常用的修复方法有：自体骨移植、同种异体骨移植及人工合成材料移植等。但以上方法各有局限，自体骨来源严重不足且为患者带来极大痛苦；同种异体骨存在免疫排斥等问题；人工合成材料的组织相容性及力学要求很难与前两者相媲美。
骨组织工程为骨缺损的修复、再生等提供了新的思路。骨组织工程的基本思路是将体外培养的正常细胞吸附于一种组织相容性良好的可吸收生物材料中，将二者联合植入器官缺损的部位，此时细胞便可在此种生物材料中扩增形成新生替代组织。选择来源丰富、容易扩增的理想种子细胞是骨组织工程研究的首要任务。
成体间充质干细胞，是指存在于机体组织中的尚未分化的细胞，其来源可靠且具有多向分化的潜能^[1-2] 。骨髓间充质干细胞是以往被研究得最多的成体干细胞，然而骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量很低，常需对患者进行多次、多部位取材，这无疑制约了它在临床上的应用。脂肪干细胞是从脂肪组织中分离出来、具有多向分化潜能的间充质干细胞。2001年Zuk等^[3]首次从人的脂肪组织中分离出大量的脂肪干细胞，自此之后脂肪干细胞逐渐成为干细胞研究的新热点。De Ugarte等^[4]经过系统地研究发现，骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞在多向分化潜能及转染外源基因效率上并无显著性差异。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞来源充足、易于获取，且不受医学伦理学的制约，是更为理想的骨组织工程种子细胞。
实验采用多次酶消化法对脂肪干细胞进行体外分离培养，并进行成骨性诱导及鉴定，旨在
优化脂肪干细胞的体外培养方法、为脂肪干细胞在骨组织工程中的进一步应用奠定实验基础。

材料方法

设计：细胞体外培养实验。
时间及地点：于2012年6至9月在上海市中医药研究院骨伤科研究所三级实验室完成。
材料：
实验动物：清洁级雌性SD大鼠1只，体质量200 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(沪)2009-0069。实验中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
脂肪干细胞分离培养及成骨诱导分化实验的主要试剂及仪器：
Main experimental reagents and instruments:

实验方法：
脂肪干细胞的体外分离：参照Zachar等^[5-6]的研究方法，取清洁级雌性SD大鼠1只，体质量200 g，0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死。以体积分数75%乙醇逆毛发生长方向擦拭大鼠腹部皮毛进行消毒。将大鼠以仰卧位置于操作台上，腹部覆以无菌洞巾，手术剪分层剪开腹腔，以无菌纱布拨开肠腔组织，切取肾脏、子宫周围及腹后外侧白色脂肪组织，置入含双抗的PBS反复冲洗3次并清除肉眼可见的血管及杂质。将脂肪组织剪成1 mm×1 mm× 1 mm的碎块，置于20 mL的0.1%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃震荡消化30 min，取出含细胞的悬液， 1 000 r/min离心10 min，用LG-DMEM(含体积分数10%胎牛血清)将细胞重悬^[7-8] 。剩余脂肪块继续37 ℃消化2次，每次30 min。
原代与传代培养：将3次所得细胞混匀接种于细胞培养皿中，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。24 h首次换液，以后隔天换液1次。细胞生长至80%汇合时，以PBS冲洗培养皿1次，0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，LG-DMEM完全培养液将细胞重悬，以1∶3传代接种于细胞培养皿，隔天换液1次，倒置相差显微镜摄片记录细胞生长状况^[9] 。
碱性磷酸酶染色：第3代脂肪干细胞以适当浓度接种于六孔板，24 h后更换为成骨诱导培养液 (LG-DMEM， 0.01 μmol/L 1，25-(OH)₂D₃，37.5 mg/L抗坏血酸，10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠)^[10-12] 。成骨诱导10 d后，吸掉培养液，PBS清洗2遍，40 g/L中性多聚甲醛固定3 min，NBT/BCIP染色液于室温下避光孵育30 min，PBS清洗2遍，倒置相差显微镜下观察并摄片^[13-14] 。
茜素红染色：第3代细胞以适当浓度接种于六孔板，24 h后更换为成骨诱导培养液(LG-DMEM，0.01 μmol/L 1，25-(OH)₂ D₃，50 mg/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)，置于体积分数5%CO₂培养箱中37 ℃恒温培养，隔天换液1次。诱导28 d后取出细胞培养板，PBS清洗2遍，体积分数95%乙醇固定10 min，PBS清洗2次，每孔加入1 mL 0.2%茜素红-Tris-HCl 避光孵育30 min，PBS清洗2遍，于倒置显微镜下摄片观察^[15] 。
主要观察指标：脂肪干细胞的形态变化、增殖能力；成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色结果。

讨论

各种疾病及外伤原因导致的组织、器官缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因^[16] 。骨缺损的修复一直困扰着临床医生，每年都有大量患者由于疾病、外伤或手术导致骨骼的缺损，却因缺乏足量合适的骨移植材料而难以治愈。
传统的骨修复方法主要有：①自体骨移植^[17] 。即以患者自身其他部位的非必须骨组织来填充骨缺损区域，这种方法避免了免疫排斥等问题，但其来源有限，取材过程给患者造成了很大的痛苦和畸形，故临床应用受到一定制约。②同种异体骨移植^[18-20] 。可以避免患者自体取材的痛苦，但存在免疫排斥及疾病传播等危险，且保存和复苏的过程较繁琐，也不是临床的最佳选择。③人工合成材料移植^[21-23] ，来源丰富，但塑形较难，生物相容性难以与自体骨相媲美，且力学性能也很难达到临床要求。
随着医学科学的发展，组织器官缺损的治疗理念已经逐步从组织移植模式转向了组织再生模式。骨组织工程在近年来得到了迅速发展，为骨缺损的修复、再生等提供了新的思路和方法。随着组织工程的不断发展，越来越多的研究者将目光聚焦于组织工程化骨上。
骨组织工程的基本思路是将体外培养的正常细胞吸附于一种组织相容性良好的可吸收生物材料中，将二者联合植入器官缺损的部位，此时细胞便可在此种生物材料中扩增形成新生替代组织^[24-25] 。这种方法的优点在于：不受供体来源限制；避免了免疫排斥反应；生物材料便于塑形；可以用最少量的细胞使组织得到长久、彻底性的修复等。选择来源丰富、容易扩增的理想种子细胞便成了骨组织工程研究的首要任务。理想的骨组织工程种子细胞应该具有以下特点^[26-27] ：取材容易，对机体损伤小；增殖能力旺盛、能在较短时间得到较大数量且生物学活性稳定；可定向分化为成骨细胞且成骨活性较高；不会引发较大免疫排斥反应。迄今为止能满足以上条件的只有干细胞。
干细胞相关研究是当今生物医学领域最令人瞩目的热点研究之一。成体干细胞来自成熟个体，这不仅规避了临床应用的伦理学争议，更解决了移植免疫方面的问题，因此成为体外干细胞研究的理想来源。目前属于成体干细胞的间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等研究均获得了突飞猛进的发展^[28-30] 。
脂肪组织的扩展依靠于脂肪细胞的体积增大及脂肪细胞的数量增加。成熟个体内的脂肪具有很强的扩展能力，然而成熟的脂肪细胞属于没有增殖分化能力的终末细胞，因此研究者们推测成熟个体内仍存在着具有增殖发育潜能的前脂肪细胞^[31] 。在这一假设的指导下，Zuk等成功培养出PLA细胞，发现其具有成纤维细胞样形态、增殖能力极强，在适当条件下可定向分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等。有学者研究发现，此种细胞具有与骨髓间充质干细胞非常接近的属性，甚至细胞表面标记物也几乎相同，故而将其归类为脂肪源性干细胞^[32] 。骨髓干细胞及脂肪干细胞均来源于中胚层，然而临床上骨髓的抽取往往给患者造成痛苦，且其来源有限，每个成人只能抽取10-20 mL骨髓，所以其广泛应用受到限制。相比之下，脂肪干细胞更易于获取、体外增殖更快，且培养条件更简单(不像骨髓间充质干细胞对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求)。
曹谊林等^[16]重点开展了脂肪干细胞成骨诱导分化的系列研究工作，主要阐明了ERK通路在调控脂肪干细胞成骨分化中的作用；揭示了地塞米松干扰脂肪干细胞成骨分化的分子机制；证实了扩增后的脂肪干细胞体外免疫抑制作用并初步阐明了其机制；证实了体外冻存的脂肪干细胞可以保持较好的成骨活性，为同种异体干细胞库的建立提供了依据。
脂肪干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞而成为组织工程种子细胞的新来源，因此实验着手于脂肪干细胞培养条件的优化，并对所得细胞进行成骨性诱导和鉴定，以评价细胞活力及定向分化能力。
实验大鼠的选择对于能否获得高活力的脂肪干细胞是十分重要的。幼鼠的细胞活性高，但幼鼠脂肪含量极少，对手术取材及消化都造成了很多不便，故不是合适的选择。通过大量实验的比较，作者发现成年雌性大鼠分化代谢旺盛，脂肪含量相对丰富，细胞活力较好，故研究选择的实验大鼠体质量均为200 g左右。
脂肪组织的取材部位对获得脂肪干细胞的质量有非常重要的影响。传统的大鼠脂肪干细胞培养方法多取材于腹股沟处，作者在多次的预实验后发现，在腹股沟处的脂肪组织中间可见一根较粗的动脉，其分支交叉成网，走形于主干附近；此处脂肪表面被较多的筋膜组织包裹，使得其中的脂肪组织与周围血管等杂质组织互相结合紧密，在手术取材中很难完全剥离；腹股沟处的脂肪内部含有大量淋巴结等组织，容易混杂大量淋巴细胞。综上所述，以腹股沟为取材部位的细胞提取实验所得的细胞往往混杂了筋膜、内皮、淋巴和血细胞等大量杂质，进而影响细胞纯度，使得后续实验效率低下。因此寻找更为理想的脂肪取材部位是目前急待解决的问题。
近年来，先后有研究者报道了取材于背部、颈部、附睾、肠系膜等不同部位的脂肪干细胞培养的相关研究^[33-36] 。作者在研究中发现腹腔是大鼠脂肪含量最丰富的部位，且肉眼下腹腔脂肪纯度高、含筋膜血管等杂质少，很可能是理想的取材部位。以往很多学者采用红细胞裂解液NH4Cl来去除原代细胞中的红细胞污染，然而NH4Cl在去除红细胞的同时，对脂肪干细胞的活性也会造成损伤。实验中并未应用红细胞裂解液，而是采用PBS冲洗3次以清除游离在悬液中的红细胞；细胞接种后亦有部分混杂的红细胞，但因为红细胞不贴壁，故可以通过及时换液而被去除，这样既减轻了对细胞的损伤又可去除杂质细胞。在预实验中，作者对取材于腹股沟区及腹腔内的脂肪干细胞进行了培养及比较，发现同一只大鼠的腹腔源性脂肪干细胞较腹股沟源性脂肪干细胞数量更多、贴壁更早、增殖更快、细胞纯度更高，故实验选取腹腔为脂肪干细胞的取材部位。
在以往的研究中，研究者多选用5-10只大鼠作为取材对象^[37] ，说明实验所得细胞数量有限，难以满足后续实验的需求，在种子细胞数量方面尚有待完善。胶原酶的浓度和消化时间对细胞的获得率及活力有着极为密切的影响，以往的研究一般采用的胶原酶浓度范围为0.1%-0.2%、消化时间由20 min-1 h不等^[38-40] ；作者在研究中发现，消化时间过短时脂肪块未能得到充分利用，所得细胞数量少，难以满足实验需求；消化时间过长则对细胞活力有较大损伤，影响药物干预效果及相关功能蛋白的表达。故实验采用多次胶原酶消化法对脂肪细胞进行分离，既可减少已脱落的细胞在酶中暴露的时间，降低胶原酶对游离细胞的损伤，又可对脂肪块充分利用、提高消化效率。实践证实，文章报道的方法仅用1只200 g SD大鼠即可得到足量细胞，这在很大程度上节约了实验大鼠。
李冬松等^[41]通过研究选取了含高糖及糖基化终末产物的模拟糖尿病环境，观察在高糖条件下人脂肪干细胞的成骨分化情况，发现高糖组脂肪干细胞成骨诱导 21 d时Ⅰ型胶原表达量较正常组低、平均矿化结节数量明显降低。这就证实了高糖会抑制脂肪干细胞向成骨方向的同源分化，提示高糖的存在是导致脂肪干细胞成骨分化能力下降的不利因素，故实验选用低糖培养基LG-DMEM对细胞进行培养及成骨性诱导。
碱性磷酸酶是被普遍认为是成骨细胞分化和功能的标志性酶。体外实验已经证实，若无碱性磷酸酶的存在，钙化就不会发生。目前众多对成骨细胞的研究中已经公认，碱性磷酸酶活性的高表达是成骨分化早期的特异性标志之一。
实验中所获得的细胞经成骨诱导培养10 d后对碱性磷酸酶进行染色，阳性细胞呈深蓝色或蓝黑色，表明经诱导的细胞具有较高的成骨活性。成骨细胞在分泌碱性磷酸酶的同时，还会分泌其他骨基质，并逐步引起细胞的融合以及基质的矿化。矿化结节的形成表明细胞已成骨分化成熟，是成骨分化晚期的特征指标。实验中所获得的细胞成骨诱导4周后，经茜素红染色液对矿化结节进行染色，可见细胞培养皿中散在分布数个橘红色结节，提示染色结果为阳性，说明其具有向成骨细胞分化的潜能，证实为脂肪源性干细胞。
综上所述，实验选取200 g成年雌性大鼠1只，以腹腔内脂肪组织为取材对象，采用多次胶原酶消化法对脂肪组织进行充分消化，所得细胞采用低糖培养基孵育，最终获得的脂肪干细胞纯度高、数量大、活性好。接种后采用改良的成骨诱导方案，使脂肪干细胞的成骨分化效率更高。因此作者认为采用以上方法进行脂肪干细胞的分离培养可以为组织工程提供大量、优质的种子细胞。

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脂肪组织的取材部位对获得脂肪干细胞的质量有非常重要的影响。传统的大鼠脂肪干细胞培养方法多取材于腹股沟处，作者在多次的预实验后发现，在腹股沟处的脂肪组织中间可见一根较粗的动脉，其分支交叉成网，走形于主干附近；此处脂肪表面被较多的筋膜组织包裹，使得其中的脂肪组织与周围血管等杂质组织互相结合紧密，在手术取材中很难完全剥离；腹股沟处的脂肪内部含有大量淋巴结等组织，容易混杂大量淋巴细胞。综上所述，以腹股沟为取材部位的细胞提取实验所得的细胞往往混杂了筋膜、内皮、淋巴和血细胞等大量杂质，进而影响细胞纯度，使得后续实验效率低下。因此寻找更为理想的脂肪取材部位是目前急待解决的问题。近年来，先后有研究者报道了取材于背部、颈部、附睾、肠系膜等不同部位的脂肪干细胞培养的相关研究。作者在研究中发现腹腔是大鼠脂肪含量最丰富的部位，且肉眼下腹腔脂肪纯度高、含筋膜血管等杂质少，很可能是理想的取材部位。以往很多学者采用红细胞裂解液NH₄Cl来去除原代细胞中的红细胞污染，然而NH₄Cl在去除红细胞的同时，对脂肪干细胞的活性也会造成损伤。本实验中并未应用红细胞裂解液，而是采用PBS冲洗3次以清除游离在悬液中的红细胞；细胞接种后亦有部分混杂的红细胞，但因为红细胞不贴壁，故可以通过及时换液而被去除，这样既减轻了对细胞的损伤又可去除杂质细胞。在预实验中，作者对取材于腹股沟区及腹腔内的脂肪干细胞进行了培养及比较，发现同一只大鼠的腹腔源性脂肪干细胞较腹股沟源性脂肪干细胞数量更多、贴壁更早、增殖更快、细胞纯度更高，故本实验选取腹腔为脂肪干细胞的取材部位。

大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨

Isolation, culture and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells from the abdominal cavity of rats

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