浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片修复下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.006

中国组织工程研究

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片修复下颌骨缺损

郭灵雨，刘凯，刘树发

佳木斯大学附属口腔医院颌面外科，黑龙江省佳木斯市 154000

收稿日期:2012-09-14 修回日期:2012-10-09 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 刘凯，硕士，主治医师，佳木斯大学附属口腔医院颌面外科，黑龙江省佳木斯市 154000 lkdx1980@163.com
作者简介:郭灵雨★，男，1984年生，山东省菏泽市人，汉族，佳木斯大学在读硕士，主要从事干细胞支架研究工作。 yuling861012@sina.com

Concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with an autologous periosteum debris scaffold for repair of mandibular defects

Guo Ling-yu, Liu Kai, Liu Shu-fa

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China

Received:2012-09-14 Revised:2012-10-09 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Liu Kai, Master, Attending physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China lkdx1980@163.com
About author:Guo Ling-yu★, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China yuling861012@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：富血小板纤维蛋白支架结构有利于红骨髓中间充质干细胞及各种生长因子的生长，促进最终成骨。
目的：探讨浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片支架材料修复兔下颌骨缺损的可行性。
方法：制备新西兰大白兔双侧下颌骨人工制备骨缺损模型，采用自身对照方法，左侧为实验侧，植入自体浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片与纳米羟基磷灰石支架材料；右侧为对照侧，植入自体骨膜碎片复合纳米羟基磷灰石支架材料。术后2，4，8，12周制备组织标本，行大体观察、影像学分析、苏木精-伊红染色、扫描电镜检测。
结果与结论：影像学检查及组织学染色显示，实验侧骨缺损处愈合程度、成骨速度及质量明显优于对照侧；扫描电镜显示实验侧复合材料与组织相容性好，无炎症刺激反应；牙CT分析数据及新骨形成情况分别证明实验侧骨密度CT值显著高于对照侧(P < 0.05)，实验侧新生骨面积显著高于对照侧(P < 0.05)。表明浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片支架材料具有明显骨诱导作用，可望成为临床应用中修复颌骨缺损的新型材料。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 浓缩红骨髓, 富血小板纤维蛋白, 纳米羟基磷灰石, 骨, 颌骨缺损, 自体骨膜

Abstract:

BACKGROUND: The platelet-rich fibrin scaffold structure is conducive to the growth of red bone marrow mesenchymal stem cells and various growth factors, promoting final osteogenesis.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of the concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with the autologous periosteum debris scaffold for repair of rabbit mandibular defects.
METHODS: Bilateral mandibular bone defect models were prepared in New Zealand white rabbits using self-control method. The left side was the experimental side, and implanted with the concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with the autologous periosteum debris scaffolds; the right side was the control side, and implanted with periosteum fragments and nano-hydroxyapatite composite scaffolds. All experimental animals were sacrificed after 2, 4, 8, 12 weeks to prepare tissue samples for general observation, imaging analysis, hematoxylin-eosin staining and scanning electron microscope detection.
RESULTS AND CONCLUSION: The imaging examination and histological staining showed that the experimental side was superior to the control side in the aspects of bone healing, osteogenesis speed and quality. Under the scanning electron microscope, the experimental side had better compatibility with surrounding tissues and no inflammation reaction. The data of the tooth CT and evidence of new bone formation showed the bone density and new bone area of the experimental side were significantly higher than that of the control side (P < 0.05). These data indicate that concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with the autologous periosteum debris scaffolds has an obvious osteoinductive role, which is expected to be a new-type material for clinical repair of mandibular defects.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, concentrated red bone marrow, platelet-rich fibrin, nano-hydroxyapatite, bone, mandibular defects, autologous periosteum

中图分类号:

R318

郭灵雨，刘凯，刘树发. 浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片修复下颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.006.

Guo Ling-yu, Liu Kai, Liu Shu-fa. Concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with an autologous periosteum debris scaffold for repair of mandibular defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.006.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 36只兔均进入结果分析。

2.2 实验组与对照组术后不同时间点骨缺损处大体观察结果术后2周时，实验组与对照组骨缺损区均有纤维状组织包裹，对照组多见炎性渗出，两组材料均有小部分吸收，与周围骨界限清，探针检测质地较软。术后4周时，实验组材料吸收明显，缺损边缘与周边骨结合较牢固，探测质地较硬；对照组纤维组织充填较多，质地软。术后8周时，实验组材料大部吸收，缺损区与周围骨无明显差异，硬度明显增加；对照组残存材料较多，硬度不及实验组。术后12周时，实验组缺损区骨膜包被，硬度与周围骨相当；对照组表面仍有纤维组织，硬度不明显。

2.3 实验组与对照组术后不同时间点骨缺损处X射线检测结果术后2周时，实验组与对照组低密度影明显，有材料阻射影，与周围骨组织界清。术后4周时，实验组可见絮状高密度影，材料可见吸收，硬度增加，与周围正常骨边界尚清；对照组缺损区材料阻射影依旧清楚，低密度影多，与周围界限清。术后8周时，实验组区域可见均匀骨痂影像，有骨性连接，骨密度增加，与周围界限不清；对照组缺损区可见絮状高密度影，骨密度较低，与周围界限尚清。术后12周时，实验组缺损区与周围骨无差异，界限模糊不清，密度与正常骨大致相等；对照组仍见低密度影，密度依旧较低，与周围界限尚清，见图3。

2.4 实验组与对照组术后不同时间点骨缺损处扫描电镜检测结果术后2周时，两组缺损区材料均与周围骨界限有裂隙。术后4周时，实验组材料与周围骨结合较紧，界限不清，有纤维组织长入，骨痂形成；对照组界限清楚，少量胶原纤维长入。术后8周时实验组材料与周围骨界限模糊，大量骨痂形成；对照组缺损区材料与周围骨界限不明显，少量骨痂形成。术后12周时，实验组材料与周围骨缺损区界限不清，形成大片生长良好的新生骨；对照组界限尚清，仍见残存材料，周缘有钙化，见图4。

2.5 实验组与对照组术后不同时间点骨缺损处组织学检测结果术后2周时，实验组缺损区内可见大量成骨细胞长入，细胞呈多角形，少量成纤维细胞和炎细胞浸润，红染骨基质明显；对照组可见大量成纤维细胞，炎细胞，少量成骨细胞，材料未见溶解吸收。术后4周时，实验组可见材料部分吸收，骨小梁致密成熟，可见丰富骨髓组织及骨陷窝；对照组材料吸收不明显，成骨细胞生成数量少，材料与周围界限清。术后8周时，实验组可见大量新生骨，骨小梁生成，材料吸收明显；对照组缺损区多见纤维组织和散在新生骨。术后12周时，实验组材料基本吸收，骨小梁形成规则，密度增大，皮质骨样结构增多，可见成熟骨外板和哈佛氏系统，生成骨髓组织内可见多样细胞；对照组材料残存，边界不清，材料内部多见纤维组织板状骨少见，多见纤维骨痂，骨小梁形成不规则，新生骨面积小，见图5。

2.6 实验组与对照组术后不同时间点骨缺损区CT值测定比较分析实验中通过以自体浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片与纳米羟基磷灰石支架材料修复骨缺损的实验组，与以自体骨膜碎片复合纳米羟基磷灰石修复骨缺损的对照组骨缺损区CT值测定比较分析，不难发现实验组骨缺损区成骨CT值均高于对照组，说明实验组所选用材料中有效组分在体内成骨方面优于对照组，见表1。

方差分析表明：与对照组比较，实验组各个时期CT值明显增高(P < 0.05)。

2.7 实验组与对照组术后不同时间点新生骨占骨缺损面积的百分比实验中各个时期中以自体浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片与纳米羟基磷灰石支架材料修复骨缺损的实验组，与以自体骨膜碎片复合纳米羟基磷灰石修复骨缺损的对照组新生骨占骨缺损面积的百分比比较中发现，实验组骨小梁及新生骨面积均优于对照组，说明实验组所用材料微观观察结果优于对照组所用材料，见表2。

方差分析表明：与对照组比较，实验组各个时期新生骨面积明显高于对照组(P < 0.05)

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引言

材料方法

设计：自身对照，观察性动物实验。
时间及地点：于2012-02-18/05-19在佳木斯大学动物实验室及基础实验室完成。
材料：
实验动物：3-6月龄健康新西兰大白兔36只，体质量2.0-3.0 kg，雌雄不拘，由佳木斯大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(黑)2010-002。采用自身对照的方法，在每只动物左右两侧下颌骨建立骨缺损模型，左侧为实验组，植入自体浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片与纳米羟基磷灰石复合材料，右侧为对照组，植入自体骨膜碎片复合羟基磷灰石材料。
浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片修复兔下颌骨缺损实验的试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
实验组浓缩红骨髓的制备^[15-16]：术中自兔耳缘静脉20%乌拉坦麻醉成功后，取俯卧位，无菌条件下，16 G骨穿刺针穿刺双侧髂嵴和髂后上棘，抽取1 mL骨髓，置入预先肝素湿化的EP管中，1 000 r/min离心10 min，离心半径13.5 cm，抽取底层0.2 mL浓缩红骨髓，备用。
实验组富血小板纤维蛋白的制备：自兔耳缘静脉抽取血液 8 mL，收集到不添加抗凝剂的无菌试管中迅速离心， 1 200 r/min离心10 min，离心半径13.5 cm，即分为3层，中间层即为富血小板纤维蛋白，用无菌纱布挤压富血小板纤维蛋白，使其成为膜状结构，眼科剪剪成碎片植入普通培养液备用，见图1，2。

下颌骨缺损模型的制作及分组干预：取兔称质量后，20%乌拉坦(5 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉。麻醉显效后常规术区备皮消毒铺巾，沿左侧下颌骨下缘做平行切口，长度3.0-4.0 cm，分层切开皮肤皮下组织，暴露下颌骨下缘及颊面，剥离子去除部分骨膜置于培养皿中，眼科剪剪碎备用，而后用裂钻于左侧下颌骨体颊侧中下处制备骨缺损，直径1.2 cm，深度0.3 cm，手术中生理盐水降温，右侧同上。实验侧植入复合材料及自体骨膜碎片，在实验侧中将自体骨膜碎片与富血小板纤维蛋白以1∶1 比例植入后，注射自体浓缩红骨髓0.2 mL，再植入纳米羟基磷灰石。对照侧植入自体骨膜碎片复合羟基磷灰石材料，充填完毕，分层严密缝合切口，分笼饲养。术后肌注庆大霉素预防感染，剂量为2×104 U/次，2次/d，持续5 d。术后2，4，8，12周处死实验动物，每次9只，并行以下检查。

大体观察：观察骨缺损区表面情况、新骨形成情况及探测骨表面硬度。
影像学分析：X射线观察骨缺损区密度影的改变及材料与周围组织接触情况。牙CT扫描骨缺损区内6个不同位点，并记录CT值，取均值并进行统计分析。

组织学观察：于骨缺损区周围0.5 mm处取材，40 g/L多聚甲醛固定24 h后脱钙处理，常规标本浸蜡，包埋，切片，苏木精-伊红染色，光镜观察。
扫描电镜观察：将组织块置于4%戊二醛固定液24 h取出，PBS冲洗3次，梯度乙醇脱水，醋酸异钨酯中置换15 min，JSM-6360LV扫描电镜检测材料与周围组织密合情况及生物相容性。
计算机图像分析：术后4个时间段所有组织连续切片，并进行系统选片，每块组织选5张，光镜100倍下每张切片系统随机选取6个视野，在图像分析仪下进行组织学形态分析，测定术后各个时间点上新生骨小梁面积所占修复区面积的比值。
主要观察指标：两组大体观察、影像学分析、苏木精-伊红染色、扫描电镜检测结果。
统计学分析：使用SPSS 17.0统计软件对CT值及新生骨小梁面积进行统计分析。数据以x(_)±s表示，组间、组内差异比较采用t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

富血小板纤维蛋白是由机体自身血液中分离形成的，属于天然生物材料，结构完整并具有极丰富的纤维蛋白网，能提供细胞贴附生长于其中，提供良好的细胞支架结构，有利于红骨髓中间充质干细胞及各种生长因子的生长，促进最终成骨[17-19]。富血小板纤维蛋白是区别于传统富血小板血浆技术的富含血小板的生物材料，最早是由Choukroun等[20]提出，其制备简单，不需要添加任何人工制剂，通过细胞因子的调节及纤维蛋白的支架作用具有良好的促进软、硬组织再生的能力。此外，富血小板纤维蛋白中含有大量白细胞，在降解过程中持续释放免疫调节相关的细胞因子，减轻了局部不良的免疫反应，增强了抗感染的能力。

红骨髓是一个具有多种细胞成分的复杂器官，具有造血和成骨功能[21-25]；其也是许多细胞因子的发生场所，如骨形态发生蛋白、转化生长因子、类胰岛素生长因子，且这些因子都充分复合利用了富血小板纤维蛋白中的转化生长因子β1、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子等的调节作用，使多能间充质细胞向成骨细胞分化调节，促进组织修复过程。

实验中分别选择以自体骨膜碎片为支架材料结合富血小板纤维蛋白/浓缩红骨髓置于骨缺损处，在对照组和实验组术后4，8，12周均可见类骨质形成，而且随着植入时间的延长，类骨质的形成逐渐增加，这说明两种材料在体内具有良好的成骨能力。实验证实了早期成骨从材料交接的部位最先开始，这也表明了以骨膜碎片为支架材料复合富血小板纤维蛋白/浓缩红骨髓的生物学特性有利于新骨的形成。组织学观察及扫描电镜检测结果显示，在术后各周期，实验组具有明显成骨活性，对照组滞后于实验组。实验组具有较强的刺激成骨作用，有利于骨缺损愈合。随实验周期的延长，实验组中的成骨越明显，在影像学中骨缺损成骨区域中的表现和扫描电镜及组织学的观察也证实了实验组所选材料的成骨作用优于对照组。

骨缺损修复实验中对骨膜所具有的自主成骨和诱导早期血管再生作用也有大量研究[26-31]。骨膜来源丰富，取材方便，操作简单，无免疫排斥，协同作用下诱导新骨形成，加快成骨速度，并为富血小板纤维蛋白促进浓缩红骨髓成骨提供了一个极佳的支架结构。

颌骨缺损的原因有很多，修复的手段也多种多样。实验充分利用自体组织成分间的相互作用和结合所具有的良好生物学相容性及骨传导和骨诱导特性，最终促进颌骨缺损区成骨。本材料具有不会传播传染性疾病，抗原性最小，使用方便，费用低等优点，为临床应用提供了一个经济有效的理论依据和实验基础，有望成为新型缺损修复复合支架材料。

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浓缩红骨髓/富血小板纤维蛋白复合载自体骨膜碎片修复下颌骨缺损

Concentrated red bone marrow/platelet-rich fibrin compound with an autologous periosteum debris scaffold for repair of mandibular defects

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