体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (20): 3626-3634.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.003

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

徐磊，叶朝阳，周燕，谭文松

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海市 200237

收稿日期:2012-09-29 修回日期:2012-11-19 出版日期:2013-05-14 发布日期:2013-05-14
通讯作者: 叶朝阳，博士，副教授，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海市 200237 zhaoyangye@ecust.edu.cn
作者简介:徐磊★，女，1988年生，河南省三门峡市人，汉族， 2012年华东理工大学毕业，硕士，主要从事软骨组织工程研究。 xulei502211964@yahoo.com.cn
基金资助:
教育部留学回国人员科研启动基金。

Rabbit articular chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion

Xu Lei, Ye Zhao-yang, Zhou Yan, Tan Wen-song

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Received:2012-09-29 Revised:2012-11-19 Online:2013-05-14 Published:2013-05-14
Contact: Ye Zhao-yang, Ph.D., Associate professor, State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China zhaoyangye@ecust.edu.cn
About author:Xu Lei★, Master, State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China xulei502211964@yahoo.com.cn
Supported by:
by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry

摘要/Abstract

摘要：

背景：兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型，关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可。
目的：观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象。
方法：将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代，对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数，显微镜观察，F机动蛋白染色、番红O染色，糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较。
结果与结论：光学显微镜下，兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形，逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态，对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化。细胞计数结果表明，细胞增殖能力随代次增加显著下降，特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖；经过番红O染色以及定量测定糖胺聚糖的含量，发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低。半定量聚合链式反应检测结果表明，随着传代次数的增加，特别是第3代以后，软骨相关特征分子(包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等)基因表达水平下调；而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调，同时，细胞表面分子CD90基因表达上调，而CD14基因表达未见明显变化。结果证实，兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象，呈现出特征基因表达水平的变化，第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 关节软骨损伤, 软骨组织工程, 兔, 软骨细胞, 传代培养, 去分化, 细胞形态, 细胞生长, 组织学染色, 基因表达, 部级基金

Abstract:

BACKGROUND: Rabbits have been extensively utilized in cartilage tissue engineering as experimental models. However, research efforts remain limited concerning the dedifferentiation of rabbit articular chondrocytes.
OBJECTIVE: To explore the dedifferentiation of rabbit articular chondrocytes during in vitro expansion.
METHODS: Chondrocytes were isolated from articular cartilage of New Zealand white rabbits and subcultured in vitro until passage 7. Cells were analyzed regarding cell growth, morphology, deposition of cartilaginous extracellular matrix and gene expression using cells counting method, microscopic examination, F-actin staining, safranine-O staining, quantitative determination of glycosaminoglycans and semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, respectively
RESULTS AND CONCLUSION: Under light microscope, rabbit articular chondrocytes changed from small round or polygonal shape into fibroblast-like morphology during the in vitro subculture, which was further confirmed with F-actin staining using phalloidin. Results of cell counting showed that, cell proliferation significantly declined with passage generations, especially after passage 3, articular chondrocytes were not proliferating. Safranine-O staining and glycosaminoglycans quantification demonstrated that, the capacity of producing cartilaginous extracellular matrix decreased dramatically as early as passage 2. Semiquantitative polymerase chain reaction analysis showed that, the gene expression of collagen Ⅱ, aggrecan, cartilage oligomeric matrix protein and SOX9 was downregulated especially for cells after passage 3, while the expression of collagen I and versican was upregulated. In addition, the CD90 expression increased and CD14 expression remained unaltered. Rabbit articular chondrocytes dedifferentiate quickly upon in vitro expansion with distinct variation of gene expression profile, and cells within passage 3 are appropriate for applications in cartilage repair.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, articular cartilage damage, cartilage tissue engineering, rabbit, chondrocytes, in vitro expansion, dedifferentiation, cell morphology, cell growth, histological staining, gene expression, ministerial grants-supported paper

中图分类号:

R318

徐磊，叶朝阳，周燕，谭文松. 体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3626-3634.

Xu Lei, Ye Zhao-yang, Zhou Yan, Tan Wen-song. Rabbit articular chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3626-3634.

图/表（结果） 8

2.1 兔软骨组织的组织学鉴定结果 实验中削取兔膝关节表层软骨组织，制备组织切片，进行组织学鉴定。图1A番红O染色分离的关节软骨组织呈现均匀的砖红色，表明组织中存在大量的糖胺聚糖，同时可以观察到软骨陷窝的存在；图1B为阿利新蓝染色，关节软骨组织为蓝色阳性着色，同样证实了软骨组织特征胞外基质的存在；图1C是针对Ⅱ型胶原的免疫荧光染色，结果表明，组织样品中分布了大量的Ⅱ型胶原。这些结果证实所获组织为单一透明软骨组织，未见参杂的软骨下骨组织。

2.2 酶消化法分离的兔软骨细胞形态 见图2。

图2所示为应用Ⅱ型胶原酶消化处理软骨组织的过程。消化前软骨组织中细胞和细胞之间紧密排列，而且呈现典型的圆形细胞形态，见图2A；消化2 h后，出现部分单个细胞从组织上游离出来，见图2B；消化4 h后，消化液中已经累积了大量的单分散圆形细胞，见图2C；消化6 h后，在放大100倍下可以确认几乎没有组织残片的存在，游离的细胞以单分散的形式存在，见图2D。

2.3 原代培养的兔软骨细胞形态 从软骨组织分离所得的细胞(P0)经冻存复苏，接种2 d后，基本上完全贴壁，见图3A，而且细胞多呈圆形或者多角形，继续培养至5 d时细胞基本达到100%汇合，细胞呈典型铺路石状，见图3B。

2.4 不同代次兔软骨细胞生长及增殖变化 在24孔板中，将不同代次的软骨细胞同时以5 000/cm²浓度接种，在不同时间点消化计数，绘制生长曲线。如图4A所示，P1代细胞的增殖能力最好，呈现明显的对数生长期；P3代软骨细胞的生长速率明显下降，而且迟滞期明显延长，但依然表现出典型的对数生长期。相比较而言，P5和P7代的细胞生长能力有限，在13 d的培养时间内基本没有增殖。同样如图4B，C所示，实验选取了两种细胞接种浓度(1.8×10⁴/cm²和3.6× 10⁴/cm²)，并从P1代开始连续传代，计算每代细胞到达100%汇合时其倍增次数。可以发现，倍增次数从P1代至P2代迅速下降，其后基本维持在1左右；累积倍增次数的增长趋势随着培养代次的延长而趋于缓和。在2种细胞接种浓度的条件下，尽管细胞的倍增次数差别不大，但仍然可以观察到累积倍增次数在较高细胞浓度的条件下P6代后才出现了平台，而低浓度下平台出现在P4代。见图4。

2.5 传代过程中兔软骨细胞的形态 利用鬼笔环肽染色方法，表征F肌动蛋白的分布，可以间接地考察细胞形态。如图5所示，接种24 h后，P1代细胞较小，形态多呈圆形或多角形，而P3代中出现了明显较大的细胞，而且随代次增加在P5和P7代次更多的细胞变大，同时部分细胞形态呈现狭长的有纤维样变化，见图5A；而当细胞长至90%汇合时，见图5B，同样P1代的细胞较小，而且可以发现F肌动蛋白随机无序排列，随着细胞代次增加，可以看出细胞逐渐变大，单个细胞所占的面积较大，更加重要的变化是F肌动蛋白逐步出现有序的排列，P7代细胞表现得尤为明显。

2.6 传代过程中兔软骨细胞的基质分泌情况 从图6的番红O染色结果可以看出，P1代软骨细胞呈较强的阳性砖红着色，同时伴随有结节现象，且结节处着色更为显著，见图6A，显微镜下放大观察可以看到细胞内外均匀着色，见图6B；但是随着代次的增加，番红O着色逐渐减弱，颜色变淡，特别是P7代细胞，番红O着色较浅而且分布不均。

糖胺聚糖和DNA定量分析的结果如图7所示。可以看到，细胞100%汇合后，由于细胞大小和DNA合成活性的差异，各个代次的DNA含量并不完全相同，P2代DNA含量最高(P < 0.05)，表明其DNA合成活性较高，而P7代则远远低于代次较低细胞的DNA含量，见图7A，这主要是因为P7代的细胞已经显著大于代次低的细胞，使得细胞的绝对数量较低。图7B则表示随着代次的增加，兔软骨细胞的糖胺聚糖分泌量迅速降低(P < 0.05)；进一步将糖胺聚糖平均到单位DNA量上，如图7C所示，P2代的糖胺聚糖/DNA数值相较于P1代就显著低(P < 0.05)，而后随代次的增加缓慢降低。

2.7 传代过程中兔软骨细胞的基因表达 将原代细胞在3.6×10⁴/cm²的浓度接种于平皿中，在细胞长至90%汇合时，收集细胞，以同样浓度传代培养，同时提取每代细胞的RNA样品，进行半定量PCR分析，结果如图8所示。

这其中，原代细胞RNA直接从冻存的细胞进行提取。可以看出，从P1到P7，随着代次的增加，表征软骨细胞特征分化的基因表达量逐渐降低，而表征软骨去分化的基因表达量逐渐增加。具体来说，随着传代次数的增加，Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX-9的基因表达水平明显逐步降低；此外，软骨寡聚基质蛋白作为软骨胞外基质的一种重要组成，其基因表达量呈现也缓缓降低的趋势；相反，Ⅰ型胶原的表达水平则在P3代明显增加，同时Versican的基因表达也呈现上调的趋势。原代细胞胶原蛋白 Ⅱ基因表达相对于P1要低，可能是由于原代细胞直接取自冻存样品有关。此外，细胞表面分子CD90的基因表达也在P3代的细胞内开始逐渐增加，而各个代次细胞的CD14基因表达变化不大。

参考文献

[1] Redman SN, Oldfield SF, Archer CW. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater. 2005;9:23-32; discussion 23-32.

[2] Benya PD, Shaffer JD. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 1982;30(1):215-224.

[3] Schnabel M, Marlovits S, Eckhoff G, et al. Dedifferentiation-associated changes in morphology and gene expression in primary human articular chondrocytes in cell culture. Osteoarthritis Cartilage. 2002;10(1):62-70.

[4] Zhang Y, Cai G, Liu W, et al. Zhonghua Zhengxing Waike Zazhi. 2007;23(4):331-334.张艳,柴岗,刘伟,等.体外培养过程中去分化的人软骨细胞基因表达谱的变化[J].中华整形外科杂志,2007,23(4):331-334.

[5] Karlsen TA, Shahdadfar A, Brinchmann JE. Human primary articular chondrocytes, chondroblasts-like cells, and dedifferentiated chondrocytes: differences in gene, microRNA, and protein expression and phenotype. Tissue Eng Part C Methods. 2011;17(2):219-227.

[6] Barlic A, Drobnic M, Malicev E, et al. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 2008;26(6): 847-853.

[7] Wang L, Verbruggen G, Almqvist KF, et al. Flow cytometric analysis of the human articular chondrocyte phenotype in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9(1):73-84.

[8] Diaz-Romero J, Gaillard JP, Grogan SP, et al. Immunophenotypic analysis of human articular chondrocytes: changes in surface markers associated with cell expansion in monolayer culture. J Cell Physiol. 2005;202(3):731-742.

[9] Chu CR, Szczodry M, Bruno S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Eng Part B Rev. 2010;16(1): 105-115.

[10] Ren B, Li HF, Zuo XA, et al. Hebei Beifang Yixue Xuebao Yixue Ban. 2010;27(2):8-11.任保,李慧芳,左喜爱,等.兔关节软骨细胞的原代培养和去分化现象[J].河北北方医学学报:医学版,2010,27(2):8-11.

[11] Xia Q, Wang WD, Wei Z, et al. Zhongguo Yishi Zazhi. 2007; 9(9):1174-1177.夏青,王卫东,魏振,等.兔关节软骨细胞的体外培养及鉴定[J].中国医师杂志,2007,9(9):1174-1177.

[12] Kim YJ, Sah RL, Doong JY, et al. Fluorometric assay of DNA in cartilage explants using Hoechst 33258. Anal Biochem. 1988;174(1):168-176.

[13] Enobakhare BO, Bader DL, Lee DA. Quantification of sulfated glycosaminoglycans in chondrocyte/alginate cultures, by use of 1,9-dimethylmethylene blue. Anal Biochem. 1996;243(1): 189-191.

[14] Gosset M, Berenbaum F, Thirion S, et al. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 2008;3(8): 1253-1260.

[15] Sasazaki Y, Seedhom BB, Shore R. Morphology of the bovine chondrocyte and of its cytoskeleton in isolation and in situ: are chondrocytes ubiquitously paired through the entire layer of articular cartilage? Rheumatology (Oxford). 2008;47(11): 1641-1646.

[16] Giovannini S, Diaz-Romero J, Aigner T, et al. Population doublings and percentage of S100-positive cells as predictors of in vitro chondrogenicity of expanded human articular chondrocytes. J Cell Physiol. 2010;222(2):411-420.

[17] Tew SR, Murdoch AD, Rauchenberg RP, et al. Cellular methods in cartilage research: primary human chondrocytes in culture and chondrogenesis in human bone marrow stem cells. Methods. 2008;45(1):2-9.

[18] Li H. Shanxi Zhigong Yixueyuan Xuebao. 2008;18(1):15-17.李昊.不同年龄兔软骨细胞培养和形态学研究[J].山西职工医学院学报,2008,18(1):15-17.

[19] Schulze-Tanzil G, de Souza P, Villegas Castrejon H, et al. Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in high-density cultures. Cell Tissue Res. 2002;308(3):371-379.

[20] Martin I, Jakob M, Schafer D, et al. Quantitative analysis of gene expression in human articular cartilage from normal and osteoarthritic joints. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9(2): 112-118.

[21] Diaz-Romero J, Nesic D, Grogan SP, et al. Immunophenotypic changes of human articular chondrocytes during monolayer culture reflect bona fide dedifferentiation rather than amplification of progenitor cells. J Cell Physiol. 2008;214(1):75-83.

[22] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

引言

材料方法

设计：细胞学观察实验。

时间及地点：于2011年11月至2012年6月在华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室动物细胞与组织工程实验室完成。

材料：

实验动物：健康2月龄新西兰大白兔6只，清洁级，雌雄不限，由上海市车墩实验动物良种场提供，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0008。

兔软骨细胞随传代培养的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

兔软骨细胞的分离与培养：将新西兰大白兔经耳缘静脉空气栓塞猝死，取股骨和胫骨，用含有青霉素 (100 U/mL)和链霉素(100 mg/L)的PBS漂洗后，体积分数75%乙醇中浸泡30 min除菌。削取关节软骨得片状组织，经0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，PBS润洗后，置于体积分数0.2%Ⅱ型胶原酶(含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基配制)消化液中并在摇床上37 ℃、体积分数5%CO₂下消化5.0-6.0 h，消化过程中每隔2 h观察1次，待绝大多数软骨细胞从组织中游离出来成为单个细胞后，消化液经2 000 r/min离心10 min后收集细胞，经锥虫蓝染色计数，或液氮冻存于含10%DMSO的胎牛血清中(定义为第0代，P0)，或将2×10⁶个细胞接种于T-150方瓶中于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

软骨细胞生长培养基组成如下：高糖DMEM，体积分数10%胎牛血清，1%非必须氨基酸，0.4 mmol/L L-脯氨酸，50 mg/L抗坏血酸，1 mmol/L HEPES，青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/L)。每隔三四天换液1次，于倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞达80%汇合时，经0.25%胰蛋白酶消化传代，所获细胞分别记为P1，P2，P3等，以此类推。

计算细胞倍增数及绘制生长曲线：P1代软骨细胞以1.8×10⁴/cm²或3.6×10⁴/cm²浓度接种于55 cm²的平皿中，待细胞长至100%汇合时，胰酶消化后计数，然后再以同样的浓度接种到平皿中，传代培养至第7代。计算倍增次数(Population doubling，PD)和累积PD数(Cumulative PD，cPD)。PD计算方法如下：PD=log2(N/N0)；N，培养结束时细胞数；N0，接种时细胞数；cPD，各代PD数之和。将P1，P3，P5和P7代细胞分别以5 000/cm²的浓度接种于24孔板中，每2 d换液，分别于2，4，6，8，10，12 d(针对P1细胞)或者3，5，7，9，11 d(针对P3、P5和P7细胞)，用胰酶消化细胞计数，绘制生长曲线。

组织学及免疫荧光染色观察糖胺聚糖以及Ⅱ型胶原的分泌：P1，P3，P5和P7代软骨细胞以5 000/cm²浓度接种于12孔板中，待细胞贴壁24 h或长至90%汇合时，40 g/L多聚甲醛固定后，用体积分数0.1%Triton X-100/PBS，加5 mg/L的罗丹明-鬼笔环肽室温染色，DAPI核染，荧光纤维镜下观察。软骨组织包埋后，冰冻切片机上制备8 μm厚切片。组织切片或多聚甲醛固定的细胞进行番红O或阿利新蓝染色后显微镜观察。Ⅱ型胶原免疫荧光染色：组织切片用体积分数0.25% Triton X-100/PBS透膜处理后，用体积分数1% BSA/0.25% Triton X-100封闭处理，进而与小鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体(体积分数1%BSA/PBS)在湿润环境下孵育1 h，用Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠二抗IgG(体积分数1% BSA/0.25%Triton X-100)室温避光处理，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察。

DNA和糖胺聚糖分泌量的定量测定：细胞样品经的木瓜蛋白酶(质量浓度125 g/L) 60 ℃处理16-20 h，所获上清液用于DNA和糖胺聚糖含量的测定。应用Hoeschst 33258荧光染料法定量测定DNA，利用荧光分析仪(Hoefer DQ300，Hoefer)测定荧光强度，以小牛胸腺DNA(100 ng/mL)作为标准品^[12]。应用1，9-二甲基亚甲蓝(DMMB)法测定糖胺聚糖含量，利用紫外/可见分光光度计(DU730，Beckman Coulter)测定在紫外线波长 525 nm处吸收，并根据硫酸软骨素标准品绘制标准曲线来计算样品中糖胺聚糖含量^[13]。

反转录-聚合链式反应(RT-PCR)分析基因表达水平：细胞样品(2×10⁶细胞)使用 RNA提取液Trizol依照常规步骤提取RNA，并溶于20 μL DEPC水，同时加入0.2 μL RNA Inhibitor，混匀，室温放置20 min后使用紫外分光光度计测定RNA浓度。取1 μg RNA样品按照反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录反应，制备cDNA。建立20 μL PCR体系，取1 μL cDNA，8 μL DEPC水，上游引物和下游引物各0.5 μL，10 μL 2×PCR Master Mix。使用PCR基因扩增仪进行反应。取3 μL PCR产物，在2%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲液中120 V恒压下电泳 30 min，经溴化乙锭染色，紫外光下显色拍照。

RT-PCR引物序列：

Primer sequences:

主要观察指标：培养的软骨细胞形态、生长速率、胞外基质分泌以及相关基因表达变化。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示。应用Microsoft EXCEL 2007软件进行数据处理，采用两样本t 检验比较组间均数差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

软骨细胞是软骨组织工程的重要种子细胞来源，由于其来源有限，体外扩增不可避免。软骨细胞的主要缺陷是在体外扩增的过程中会迅速去分化，丧失其特征功能。兔是软骨组织工程研究中临床前验证修复效果的重要模型动物，鉴于当前对兔软骨细胞相关研究较少的现状，文章考察了兔关节软骨细胞在体外扩增过程中的去分化现象，着重从细胞形态、基质分泌和基因表达等不同角度来详细表征。

实验通过酶解法获取软骨细胞，并详细考察了不同代次的软骨细胞生长，胞外基质分泌，以及基因表达，从不同层次证实了兔软骨细胞的去分化现象。在实验中，软骨原代细胞呈现圆形或多角形态，这与文献报道的其他种属来源的原代软骨细胞形态一致^{[3, 14-15]}。

随着兔软骨细胞的体外传代培养，软骨细胞的形态显著发生了变化，细胞逐渐变大，而且呈现狭长成纤维细胞样形状，这与任保等人所观察到的兔软骨细胞体外传代后的形态变化吻合^[10]，也与所报道的人源软骨细胞的形态变化相符^[3]。细胞形态主要是由于细胞和周围环境的相互作用来决定，同时也与细胞骨架结构相关^[15]。

与现有报道的关于兔软骨细胞的研究不同的是^[10-11]，实验中借助罗丹明标记的鬼笔环肽特异性染色F肌动蛋白来考察细胞骨架形态。实验发现随着传代次数增加，特别是从P5代开始，F肌动蛋白出现了显著重排，从而调节了细胞形态。另一方面，胞外基质分泌的变化被认为是软骨细胞去分化最主要标志^[16]。兔软骨细胞分泌的糖胺聚糖量先是在P2代迅速降低，而后下降的速度趋缓。胶原蛋白Ⅱ，聚集蛋白聚糖和SOX9等基因表达在P4代开始出现较大幅度的下调，而胶原蛋白Ⅰ和Versican的基因水平则在P3代后呈现显著的上调。需要特别指出的是，P1代软骨细胞的胶原蛋白Ⅱ基因表达水平相对于较后代次的细胞反而稍低，这有可能是由于实验中用于基因表达检测的P1代细胞直接取自于冻存样品，这些细胞经过了长时间的Ⅱ型胶原消化处理，可能会影响其基因表达水平^[8]。此外，实验也表明兔软骨细胞的增殖能力与其传代次数相关。随着细胞代次的增加，软骨细胞的增殖能力下降，在P3代就出现明显降低，而P5和P7代基本丧失增殖能力。这个发现与任保等^[10]所报道的P4代的兔软骨细胞比P1代细胞增殖能力更强的研究结果不一致^[10]，这可能是由于在绘制生长曲线的实验中所采取的细胞接种浓度不同所致，任保等^[10]实验中的接种浓度是1.5×10⁴/cm²，远远高于实验中的5×10³/cm²。一般认为，软骨细胞的培养浓度与细胞表型的维持有很大的关联，高浓度培养有利于软骨细胞表型的维持^[17]。

因此，实验结果表明，兔软骨细胞的去分化从体外培养一开始就已经发生，在P2代软骨细胞的糖胺聚糖分泌能力就发生了显著地下调，而后随着细胞传代次数增加的变化相对缓慢。但是，综合细胞生长、形态、基质分泌和基因表达的综合分析，实验认为3代以内的兔软骨细胞基本还能维持其特征功能，适合于软骨组织工程的应用，与先前一些针对兔软骨细胞的相关报道所得结论一致^{[10-11, 18]}，而且这也与很多研究所报道的人软骨细胞在体外培养过程中一般在传四五代出现不可逆的去分化的观点基本接近^{[2, 19]}。

基因表达的分析是考察软骨细胞去分化的重要手段。基于前面的讨论，实验发现对软骨细胞不同角度的表征所揭示的去分化进程并不一致，这更提示了有必要对软骨细胞去分化现象进行综合判断，而不能仅仅依赖于某一种分析手段。为此，基于现有的针对兔软骨细胞去分化现象的研究报道^[10-11]，实验详细考察了软骨细胞在体外扩增的过程中多个与成软骨相关基因表达的情况。近年来，有很多文献报道了各种分析方法，以求更加精确、系统地表征软骨细胞的去分化行为。

Wang等^[7]探索了借助细胞流式仪定量分析软骨细胞分泌Ⅰ，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等特征基质分子的可行性；Martin等^[20]提出以Ⅱ型胶原蛋白Ⅰ型胶原蛋白以及Aggrecan/Versican的相对表达水平来定量表征软骨细胞分化行为；而Diaz-Romero等^[21]提出了以软骨细胞表面分子如CD90和CD14的相对基因表达水平(CD90/CD14)以及细胞倍增数PD和1个细胞内特定蛋白分子S100来定义软骨细胞的去分化行为。因此，实验也尝试对兔软骨细胞表达CD14和CD90的情况进行了表征。结果表明，与人软骨细胞一致^[21]，P0兔软骨细胞也不表达CD90，而随代次的增加CD90表达上调，但是与人软骨细胞在P1代就高表达CD90不同，兔软骨细胞在P5以后才显著表达CD90；另一方面兔软骨细胞的CD14基因表达与人软骨细胞差别较大^[21]，随细胞传代基本没有明显的变化。这些结果表明，针对兔软骨细胞，CD90和CD14的基因表达可以作为表征其去分化的重要指标。

综上所述，兔关节软骨细胞在体外传代过程中与人软骨细胞一样存在着显著地去分化现象，而且去分化过程从体外培养的一开始就已经发生，同时对兔软骨细胞的基因分析应该作为考察其去分化的重要组成部分。综合分析后发现，第3代(P3)以内的兔软骨细胞仍基本能维持软骨表型，可以适用于软骨组织修复再生的相关研究。

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

Rabbit articular chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[2]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[3]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[4]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[5]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[6]	高坤, 陈大宇, 张勇, 刘伟东, 孙淑芬, 赖文强, 马笃军, 吴益宏, 林展鹏, 蒋鹰鹭, 余伟吉. 牛膝醇提物调控滑膜成纤维细胞外泌体抑制软骨细胞外基质降解[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3636-3640.
[7]	童洁, 廖瑛, 陈政宇, 孙光华. 骨关节炎软骨细胞自噬及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3246-3251.
[8]	刘杏, 魏晓菡, 邓洁, 李仲铭. 骨骼肌钝挫伤兔模型制备与打击力度的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 196-200.
[9]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[10]	穆钰峰, 魏利娜, 吴勇, 邵安良, 陈亮, 屈树新, 徐丽明. α-半乳糖基抗原缺失模型兔的研制与评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 281-285.
[11]	马笃军, 彭力平, 陈锋, 蒋顺琬, 姜劲挺, 高坤, 林展鹏. 基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 298-303.
[12]	曹阳, 张军平, 彭立, 丁义, 李光辉. 兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3000-3003.
[13]	张为, 崔帅帅, 周志超, 胡小华, 杨晓红. 微小RNA调控组蛋白去乙酰化酶治疗骨相关疾病的发展现状[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2767-2774.
[14]	陈谱, 阮安民, 周俊, 张晓哲, 马玉峰, 宗晨钟, 王庆普. 通络止痛凝胶干预膝关节骨性关节炎模型兔的软骨炎症及退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2670-2675.
[15]	黎少, 梁永康, 高毅, 彭青. 三维胶原HepaRG微球的建立及其体外功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2541-2547.