灌注法构建小肠黏膜全层去细胞外基质

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：对于解剖层次复杂的细胞外基质，单纯浸泡法则很难达到理想的去细胞效果。
目的：观察灌注法去细胞技术制备小肠黏膜全层去细胞外基质的效果。
方法：采用灌注法去细胞技术，经成年雄性新西兰大白兔小肠黏膜上动脉灌注去离子剂后处理获得小肠
黏膜全层去细胞外基质。采用MTT法检测小肠黏膜全层去细胞外基质浸提液(实验组)或含体积分数20%
小牛血清的DMEM(对照组)与1 月龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞共培养后的细胞相对增殖率。
结果与结论：①大体观察：小肠黏膜上动脉经灌注30 min 后变得苍白透明，经2 h 灌注后肠段变得苍
白剔透，清楚可见脉管纹理。②组织学与扫描电镜观察：灌注法构建的小肠黏膜全层去细胞外基质的去
细胞程度均匀，胶原纤维未受损，孔隙多，孔隙率为(86.72±2.98)%。③MTT 检测实验：培养2，4，7 d，
实验组细胞A 值明显高于对照组细胞A值(P < 0.05)，且实验组细胞相对增殖率均>1。表明采用灌注法
构建小肠黏膜全层去细胞外基质可操作性强，安全性好，且小肠黏膜全层去细胞外基质对骨髓间充质干
细胞无毒性，并有一定的促生长作用。

关键词: 生物材料, 细胞外基质材料, 灌注法, 去细胞技术, 小肠, 黏膜, 细胞外基质, 喉气管, 骨髓间充质干
细胞, 细胞相对增殖率, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Immersing method is difficult to construct the ideal acellular matrix for the complex organ.
OBJECTIVE: To investigate the effect of preparing the acellular full-thickness small intestine scaffold by
perfusion method.
METHODS: All the small intestines were excised in a sterile fashion in adult male New Zealand rabbits and
the acellular small intestine scaffolds were obtained by perfusing ionic detergents through the superior
mesenteric arteries. Relative growth rates were detected using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide method after bone marrow mesenchymal stem cells from 1-month-old NewZealand rabbits were co-cultured with decellularized full-thickness small intestine extracellular matrix
(experimental group) or Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 20% fetal bovine serum (control group).
RESULTS AND CONCLUSION: The macroscopic view showed that the perfused-decellularized small intestine
artery became translucent after 30 minutes of perfusion, and the small intestine segment became translucent
after 2 hours of perfusion. The vessels were seen distinctly. Histological view and scanning electron microscope
results indicated that the perfused-decellularized full-thickness small intestine showed perfect acellular effect.
Many pores and collagen fibers were retained and the porosity was (86.72±2.98)%. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that the relative growth rate of the experimental group overtopped
1. The absorbance values in the experimental group were significantly higher than those in the control group at 2,
4 and 7 days of coculture (P < 0.05). These findings suggest that the perfusion method is a better way to
construct acellular full-thickness small intestine scaffold because it can achieve better acellular effect and retain
scaffold vitality at the greatest extent in the acellular small intestine scaffold that can promote the growth of bone
marrow mesenchymal stem cells and not add toxicity to the cells.

Key words: biomaterials, extracellular matrix materials, perfusion method, decellularized technique, small
intestine, mucous membrane, extracellular matrix, laryngotracheal, bone marrow mesenchymal stem cells;
relative growth rate, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

侯楠，朱力，文科. 灌注法构建小肠黏膜全层去细胞外基质[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2950-2955.

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图/表（结果） 3

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引言

长段喉气管缺损的修补至今仍无理想方法，近年来组织工程的发展为喉气管重建打开了新的视角^[1-2]。去细胞天然支架材料广泛存在于物种间并能很好地被异种宿主耐受，在体内容易被机体降解，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起支架材料作用，而且具有特殊生理功能，包含的多种生长因子在组织修复和重建中具有重要促进作用，自身无免疫原性，即使经去细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境，因而成为组织工程研究领域的热点。去细胞基质的制备方法主要包括物理处理法、化学处理法、酶学处理法等。化学处理法是目前使用最多的细胞方法，化学处理法中最常用的是浸泡法，但是此种方法多适用于小肠黏膜下层、血管、神经及心脏瓣膜等天然解剖结构相对较薄的组织或器官，而对于全心、全喉或者全层气管这种结构精细复杂的器官，很难制备较为均匀完整的去细胞支架。马克基亚尼等成功进行了世界上第1例组织工程气管移植。该小组将同种异体气管用浸泡法反复处理后构建出一个去软骨细胞及上皮细胞的全层去细胞气管支架，再将患者自体骨髓间充质干细胞经过成软骨诱导后种植入去细胞气管支架的外壁，又将患者健康支气管黏膜取部分上皮细胞进行培养后植入去细胞气管支架的内壁进行培养，最终构建出一个含软骨支架和气管上皮层且免疫原性极低的组织工程气管，并进行体内移植[3]。之后国际上又相继有多家研究机构成功报道了组织工程气管用于人体移植的个案，但国内在组织工程气管构建方面的研究甚少^[4-7]。
同种异体气管全层去细胞外基质之所以制备时间较长，其难度主要在于软骨。因为软骨结构特殊，其内无血管，靠体液渗透压维持营养供给，运用传统的浸泡法对软骨支架进行去细胞处理会消耗大量的时间，导致去细胞效果不佳，去细胞基质不均匀。因此浸泡法只适合于解剖层次相对较单一的组织或器官施行去细胞。目前又报道了一种新的化学去细胞法——灌注法。在重建喉气管时常选用小肠黏膜下层作为气管重建的支架，与软骨细胞复合充当组织工程喉气管的软骨层，气管黏膜上皮与胶原复合上皮细胞构建上皮层，两层叠加构建组织工程喉气管。这种机械的叠加很难达到真正意义上的融合，若能找到一种解剖层次与喉气管相似的天然细胞外基质作为支架则可解决这一难题^[8]。小肠本身解剖层次与气管相似，但其结构复杂，构建全层小肠去细胞基质难度较大。如果找到一种方法将小肠黏膜全层去细胞化，可以将小肠黏膜全层去细胞基质作为组织工程喉气管重建的支架材料。小肠肠段内脉管丰富，采用灌注法经肠系膜上动脉灌注去离子剂可以达到均匀的去细胞效果^[9-10]。相对以往构建组织工程气管时所选择的天然或人工支架，小肠黏膜全层去细胞支架更有利于构建具有生理功能的组织工程喉气管。实验采用灌注法去细胞技术对部分小肠进行灌注，构建出小肠黏膜全层去细胞外基质，为组织工程喉气管的构建提供理想的支架材料。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011年1至12月在成都医学院第一附属医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康成年雄性新西兰大白兔20只，体质量2.0-2.5 kg；1月龄新西兰大白兔，体质量450-550 g，雌雄不拘，均购于成都医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(川)2008-0076。

灌注法构建小肠黏膜全层去细胞外基质实验的主要试剂、仪器：SDS、TritonX100、DMEM培养液、2.5%胰蛋白酶、甲苯胺蓝、四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；青霉素、链霉素(哈尔滨制药厂)；靶控麻醉泵(浙江大学医学仪器有限公司)；光学显微镜(Olympus 公司，日本)；S-900 扫描电镜(Hitachi 公司，日本)；AG240DR 电子天平(梅特勒公司，瑞士)；ZYJLT3超净工作台(西安富康空气净化设备工程有限公司)；Hera cell 150 CO2培养箱(Heaeus 公司，德国)。

实验方法：

灌注法制备小肠黏膜全层去细胞支架：将新西兰大白兔以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉，仰卧固定于专用手术台上。腹部脱毛，自剑突下缘纵行切开腹部正中皮肤，分离浅筋膜、腹肌，暴露小肠及肠系膜上动脉，取部分肠管，保留该段肠管的肠系膜上动脉主要分支，结扎该段小肠其余各级分支血管。游离带血管的小肠，并结扎该段小肠两端，经肠系膜动脉插管采用持续灌注器进行持续灌注。首先用含有肝素和腺苷的PBS 灌注15 min，含有1% SDS去离子水灌注16 h，然后去离子水灌注15 min，1% Triton X-100 去离子水灌注30 min，最后用含双抗的PBS冲洗48 h。灌注期间离体小肠置于消毒的200目铜筛网上，铜筛网下放置小烧杯以确保灌注液能及时流出。小肠离体后所有操作均在无菌操作台中进行。

大体观察：观察新鲜离体肠段与灌注法去细胞技术构建的去细胞全层小肠基质的颜色及外观变化。

组织学观察：取新鲜离体肠段及去细胞小肠黏膜全层细胞外基质支架，体积分数4%甲醛固定后石蜡包埋，切片。切片入二级二甲苯各15 min，再入体积分数100%乙醇(二级)→体积分数95%乙醇→体积分数75%乙醇→体积分数50%乙醇→蒸馏水中，各3-5 min。切片入苏木精中染色10-30 min，用自来水流水冲洗约15 min。将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色约数秒至数十秒钟。用0.5%伊红乙醇液对比染色2-5 min，观察。

扫描电镜观察：取小肠黏膜全层去细胞外基质支架，2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，乙腈真空干燥，表面喷金，观察去细胞全喉支架肌肉表面超微结构。Image-Pro Plus6.0 图像分析软件进行孔隙率测定。

MTT细胞毒性实验：

骨髓间充质干细胞的制备：取1月龄新西兰大白兔，无菌条件下抽取骨髓液，用16号骨髓穿刺针自左腿股骨大转子处穿刺抽取骨髓，注入50 mL离心管中，加入适量肝素，适当振动离心管，之后再加入等体积DMEM培养液，轻轻吹打成细胞悬液。按2∶1的体积比将细胞悬液加入淋巴细胞分离液的离心管中，在离心机中以 1 500 r/min离心15 min，离心半径15 cm，弃上清液。取出后液体分为4层，用弯吸管轻轻垂直伸入第2层，沿管壁吸取含云雾状细胞的淡黄色液体移至无菌的离心管中，加入等体积的不完全DMEM 培养液混匀后 1 500 r/min离心10 min，离心半径15 cm，弃上清液，重复此操作2遍。向离心管中加入体积分数10%胎牛血清吹打成细胞悬液，接种于25 mL塑料培养瓶，置于体积分数5%CO2饱和湿度，37 ℃培养箱中培养，每隔3 d换1次培养液。分别将第1代骨髓间充质干细胞进行成肌诱导及成软骨诱导。3周后进行α-肌动蛋白抗体染色及甲苯胺蓝染色实验，间接鉴定为骨髓间充质干细胞。

细胞与材料共培养：按DMEM培养液与小肠黏膜全层去细胞外基质之比为10 mL/cm2加入DMEM培养液(含体积分数20%胎牛血清)，于37 ℃孵箱内静置24 h制备小肠黏膜全层去细胞外基质浸提液。取传代培养第3代的骨髓间充质干细胞，稀释成1×107 L-1，接种于3块96孔板上，实验组与对照组各10孔，每孔100 μL ，5%CO2饱和湿度37 ℃下培养24 h，弃原培养液，实验组加入小肠黏膜全层去细胞外基质浸提液，对照组加新

配制的含体积分数20%小牛血清的DMEM，置孵箱内继续培养，于2，4，7 d各取出1块培养板，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，继续孵育4 h后，小心吸去培养上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，490 nm波长酶联免疫检测仪测定各孔光吸收(A)值，进行体外细胞毒性实验，计算骨髓间充质干细胞的相对增殖率。

细胞相对增殖率=(实验组A值/对照组A值)×100%

主要观察指标：①去细胞全层小肠基质的大体及组织学观察结果。②去细胞全层小肠基质与骨髓间充质干细胞共培养后的细胞相对增殖率。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析检验， P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

由于各种原因所造成的大段气管壁缺损的修补至今仍无理想的方法[11]。重建喉气管呼吸道功能的基础是建立低免疫原性、与气管壁结构和功能相似、有呼吸道黏膜的喉气管软骨支架。组织工程理想的支架材料应具备如下条件^[12]：①有良好的组织相容性。②可降解和降解速率可控性。③无抗原作用。④维持生长其上的细胞形态和表型，并增进细胞的黏附和增殖，诱导组织再生。⑤有一定孔隙率。⑥有一定机械强度。天然细胞外基质生物材料，几乎拥有上述各种特性，最有可能在组织体内完全再生^[13-15]。对于天然细胞外基质的制备传统多采用浸泡法，但浸泡法去细胞技术多适用于制备单层去细胞外基质，对于解剖层次复杂的细胞外基质单纯的浸泡法则很难达到理想的去细胞效果^[16]。2008年Ott等^[10]首次报道了利用灌注法构建心脏全层去细胞基质，重新注入新生小鼠细胞，在体外培养后使心脏恢复了跳动，体外再造具有生理活性器官。2010年Nature Medicine上再次发表了1篇关于灌注法去细胞技术的论著：研究者利用灌注法通过肺主动脉对肺脏进行去细胞处理后半小时就使支气管软骨达到了完全去细胞的效果，制备肺脏全层去细胞外基质^[10]。这一报道更有力说明灌注法有可能成为构建组织或器官全层去细胞支架的首选方法。作者也曾在前期研究中利用供体完整的喉作支架，经喉上动脉及甲状腺上动脉内灌注去细胞液，构建出去除环甲肌、环杓后肌、环杓侧肌、甲杓肌及黏膜等具有免疫原性软组织，但保留喉肌群细胞外基质结构及完整的喉软骨支架结构。说明灌注法去细胞技术是制备复杂细胞外基质的首选方法^[17-19]。
气管壁主要由气管上皮黏膜层、黏膜下层、软骨层及软骨膜构成。将气管全层去细胞外基质作为气管重建的支架结构是最理想材料^[20-22]。但由于气管的主要结构之一软骨层本身有Ⅱ型胶原包裹，很难达到完美的去细胞效果，给支架的构建增加了难度^[23]。如果能找到一种解剖层次与气管相似而又较容易制备的细胞外基质，则更有利于组织工程气管重建技术的推广。小肠的解剖层次由内向外分别是小肠黏膜上皮层、小肠黏膜下层、平滑肌层及浆膜层。这两种器官的解剖层次十分类似。以往的研究多将小肠黏膜下层作为气管重建黏膜上皮的支架结构，并且在种植黏膜上皮的时候多涂以胶原等生物胶以帮助上皮细胞黏附，再与种植有软骨细胞的支架结构相结合^[24-26]，这些实际上属于物理意义上的结合，在体内通常容易发生变形，上皮细胞纤维化。利用脉管灌注法构建小肠黏膜全层去细胞外基质的技术为该领域打开新的思路。该实验用肠系膜上动脉灌注去离子剂去除掉小肠黏膜上皮层、小肠黏膜下层及肌层，构建出的小肠黏膜全层去细胞基质有较高的孔隙率，适合细胞附着，该细胞外基质具有与气管相对应的解剖层次，而且无免疫原性。在气管重建时小肠黏膜上皮层可以作为气管黏膜上皮的细胞外支架，小肠肌层可以作为气管软骨层的细胞外支架，使组织工程气管的层次达到生物融合。与气管全层去细胞外基质的制备方法比较具有耗时短、操作简单等优点，因此灌注法构建的小肠黏膜全层去细胞外基质有望成为组织工程气管制备的首选支架。将小肠黏膜全层去细胞外基质作为气管重建的支架这一思路在国内外目前尚未见报道^[27-30]。实验的下一步设想是利用骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导种植入小肠去细胞基质肌层，因此在细胞毒性实验中选择骨髓间充质干细胞进行研究。

文章快阅

延伸阅读

气管壁主要由气管上皮黏膜层、黏膜下层、软骨层及软骨膜构成。将气管全层去细胞外基质作为气管重建的支架结构是最理想材料。但由于气管的主要结构之一软骨层本身有II型胶原包裹，很难达到完美的去细胞效果，给支架的构建增加了难度。如果能找到一种解剖层次与气管相似而又较容易制备的细胞外基质，则更有利于组织工程气管重建技术的推广。小肠的解剖层次由内向外分别是小肠黏膜上皮层、小肠黏膜下层、平滑肌层及浆膜层。这两种器官的解剖层次十分类似。以往的研究多将小肠黏膜下层作为气管重建黏膜上皮的支架结构，并且在种植黏膜上皮的时候多涂以胶原等生物胶以帮助上皮细胞黏附，再与种植有软骨细胞的支架结构相结合，这些实际上属于物理意义上的结合，在体内通常容易发生变形，上皮细胞纤维化。利用脉管灌注法构建小肠全层去细胞外基质的技术为该领域打开新的思路。该实验用肠系膜上动脉灌注去离子剂去除掉小肠黏膜上皮层、小肠黏膜下层及肌层，构建出的小肠黏膜全层去细胞基质有较高的孔隙率，适合细胞附着，该细胞外基质具有与气管相对应的解剖层次，而且无免疫原性。在气管重建时小肠黏膜上皮层可以作为气管黏膜上皮的细胞外支架，小肠肌层可以作为气管软骨层的细胞外支架，使组织工程气管的层次达到生物融合。与气管全层去细胞外基质的制备方法比较具有耗时短、操作简单等优点，因此灌注法构建的小肠黏膜全层去细胞外基质有望成为组织工程气管制备的首选支架。将小肠全层去细胞外基质作为气管重建的支架这一思路在国内外目前尚未见报道。本实验的下一步设想是利用骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导种植入小肠去细胞基质肌层，因此在细胞毒性实验中选择骨髓间充质干细胞进行研究。实验结果表明骨髓间充质干细胞在小肠黏膜全层去细胞基质浸提液中生长不仅没有受阻反而具有促进作用，这说明制备的小肠黏膜全层去细胞外基质没有细胞毒性，并且维持生长其上的细胞形态和表型，增进细胞的黏附和增殖，诱导组织再生。综上所述小肠黏膜全层去细胞外基质是气管重建理想的支架材料，灌注法是构建小肠全层去细胞外基质的理想方法。