新型复合生物抗菌敷料的抗菌强度、吸湿能力及细胞毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (16): 2905-2912.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.008

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新型复合生物抗菌敷料的抗菌强度、吸湿能力及细胞毒性

林晓华，黎志超，俞金龙，肖钟，邹兆伟，黄宗海，王晓东，莫小慧

林晓华，女，1983年生，广东省广州市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，医师，主要从事普通外科生物敷料方面的研究。
doctorlin2007@126.com

收稿日期:2012-12-27 修回日期:2013-03-11 出版日期:2013-04-16 发布日期:2013-04-16
通讯作者: 黄宗海，博士，主任，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院普通外科，广东省广州市 510280 drhuangzh@yahoo.com.cn
作者简介:林晓华，女，1983年生，广东省广州市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，医师，主要从事普通外科生物敷料方面的研究。 doctorlin2007@126.com

A novel compound biological antibacterial dressing: Antimicrobial effectiveness, moisture absorption capacity and cytotoxicity

Lin Xiao-hua, Li Zhi-chao, Yu Jin-long, Xiao Zhong, Zou Zhao-wei, Huang Zong-hai, Wang Xiao-dong, Mo Xiao-hui

Lin Xiao-hua, Physician, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
doctorlin2007@126.com

Received:2012-12-27 Revised:2013-03-11 Online:2013-04-16 Published:2013-04-16
Contact: Huang Zong-hai, Doctor, Doctoral supervisor, Professor, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China drhuangzh@yahoo.com.cn
About author:Lin Xiao-hua, Physician, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China doctorlin2007@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：细菌感染是影响伤口愈合的主要因素之一，伤口渗出液里含有的大量炎症因子、蛋白酶和自由基都会减缓伤口的愈合速度。新型复合生物抗菌敷料的研发对治疗外科感染伤口有重要的意义，是创伤敷料发展的必然趋势。
目的：观察添加纳米银的海藻酸钙敷料的抗菌活性、吸湿能力及细胞毒性。
方法：将纳米银材料添加到海藻酸钙中制备新型复合生物抗菌敷料，并通过使用平板计数法、MTT法、电子显微镜观察法观察敷料的抗菌活性、吸湿能力及细胞毒性，再与银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料进行对比，以期显示出新型复合生物抗菌敷料的具有强抗菌性及低细胞毒性的优势。
结果与结论：与银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料相比，添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均有更强的抑菌作用(P < 0.01)，细胞毒性较低(P < 0.01)；3种敷料的吸湿能力差异无显著性意义。证实此添加纳米银的海藻酸钙敷料的具有强抗菌性及低细胞毒性。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 新型生物敷料, 纳米银, 海藻酸纤维, 抗菌, 吸湿, 细胞毒性, 扫描电子显微镜

Abstract:

BACKGROUND: Bacterial infection is one of the main factors affecting wound healing. Wound exudate containing large amount of inflammatory cytokines, proteases and free radicals will delay wound healing. Research and development of new compound biological antimicrobial dressings have important implications for treating surgery wound infection, which is the inevitable trend of the development of wound dressings.
OBJECTIVE: To observe the antibacterial activity, moisture absorption capacity and cytotoxicity of calcium alginate dressing containing nanocrystalline silver.
METHODS: Silver nanoparticles were added into calcium alginate to prepare new compound biological antimicrobial dressings. The antibacterial activity, moisture absorption capacity and cytotoxicity of calcium alginate dressing containing nanocrystalline silver were detected using the plate count method, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method, electron microscope experiment, compared with silver ion calcium alginate dressing and calcium alginate dressing, in the hope of showing the strong antimicrobial activity and low cytotoxicity of new compound biological antimicrobial dressings.
RESULTS AND CONCLUSION: The new compound biological nano-silver antimicrobial dressing, compared with the silver ion calcium alginate dressing and calcium alginate dressing, had stronger bacteriostasis to Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa (P < 0.01), and exhibited lower cytotoxicity (P < 0.01). There occurred no significant differences in moisture absorption capacity among the three groups (P > 0.05). It is proved that the new compound biological nano-silver antimicrobial dressing has stronger antibacterial activity and lower cytotoxicity.

Key words: biomaterials, biomaterials and controlled drug release, novel biological dressings, nano-silver, alginate fiber, antibacterial, moisture absorption, cytotoxicity, scanning electron microscope

中图分类号:

R318

林晓华，黎志超，俞金龙，肖钟，邹兆伟，黄宗海，王晓东，莫小慧. 新型复合生物抗菌敷料的抗菌强度、吸湿能力及细胞毒性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2905-2912.

Lin Xiao-hua, Li Zhi-chao, Yu Jin-long, Xiao Zhong, Zou Zhao-wei, Huang Zong-hai, Wang Xiao-dong, Mo Xiao-hui. A novel compound biological antibacterial dressing: Antimicrobial effectiveness, moisture absorption capacity and cytotoxicity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(16): 2905-2912.

图/表（结果） 6

2.1 新型复合生物抗菌敷料的强抑菌率 新型纳米银海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为99.7%和99.6%，含银离子的海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为97.9%和97.7%，海藻酸钙敷料对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率分别为84.80%和84.5%。

体外抗菌实验提示，此3种海藻酸钙敷料均金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有一定的抑菌能力，新型纳米银海藻酸钙敷料在抑制和杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中有明显的优势。见图1。

2.2 新型复合生物抗菌敷料的强吸湿率 实验对3种材料进行离心脱水及干燥后发现，海藻纤维本身具有良好的吸水性，所吸收的水分中一大部分能被保留在纤维内部，很难通过离心脱水去除，添加了银离子或纳米银的海藻酸钙敷料并没有影响敷料的吸湿率。见表1。

2.3 新型复合生物抗菌敷料的低细胞毒性 培养72 h后，新型纳米银海藻酸钙敷料、海藻酸钙敷料对L-929 (小鼠成纤维细胞)属低生物毒性甚至是无生物毒性的纳米材料，细胞相容性好，见表2。当含银离子海藻酸钙敷料浸提液稀释到原溶液的1/4时，可显示出较低的细胞毒性，见表3。加入新型纳米银海藻酸钙敷料、海藻酸钙敷料浸提液中的L-929 (小鼠成纤维细胞)贴壁生长情况良好，细胞形态正常，未出现细胞脱落、裂解等细胞病变情况，此2组吸光度值与空白对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，细胞相对增殖率均在90.0%以上，细胞毒性反应分级均为1级。

加入银离子海藻酸钙敷料浸提液中的L-929 (小鼠成纤维细胞) 形态变异、圆缩，呈圆形疏松贴壁的细胞大于50%，可观察到大量细胞、脱落及裂解等细胞病变情况，其吸光度值与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 新型复合生物抗菌敷料的超微结构见图2。 图2A显示，新型纳米银海藻酸钙敷料内的纳米银粒子呈较规则球形，平均粒径较小，约25 nm，纳米银粒子均匀地分布在海藻酸纤维之间的孔隙中。图2B显示，银离子海藻酸钙敷料银粒子颗粒大，平均粒径可达1 μm，且形状及分布不如纳米银形状规则。

图3为金黄色葡萄球菌菌液在实验敷料上培养24 h后的分布情况，新型纳米银海藻酸钙敷料中可以看到仅有少量细菌零星地分布在纤维上；银离子海藻酸钙敷料中可以看到少量细菌分布在纤维上，部分细菌落形成条索状分布，但在纤维间并没有形成链接的细菌条索；海藻酸钙敷料中可以看到一层薄薄的细菌生物膜分布在纤维上，而且在纤维之间形成细菌膜的连接。

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引言

有研究认为，伤口在湿润的环境下比干燥的环境下要愈合得快，使得人们对伤口愈合的过程有了新的认识^[1] 。创面敷料需有一定的透水透气性，较少热量和电解质的损失，减少蛋白质的丢失，加速伤口的愈合，降低疼痛的感觉，无毒性，无抗原性，有广泛的适用性，而且价格低廉^[2-3] 。参照英国皇家护理学院(Royal College of Nursing)2005年压疮指南将敷料分为接触性敷料(以纱布敷料为代表)、主动性敷料(以含有胶原或生长因子活性成分为代表)、被动敷料(包括薄膜、海绵和水凝胶)、互动性敷料(敷料包括水胶体、海藻酸盐和亲水性纤维敷料)、抗菌性敷料(含有如银、碘、氯己定等某种抗菌成分的敷料)5大类^[4] 。

随着医学生物工程及组织生物学的发展，目前认为理想的创面敷料还应具备以下功能：①能吸收多余的渗出物，与伤口接触面保持一定湿度。②具有良好的易成凝胶性、黏附性及生物相容性。③移去敷料时不会造成伤口2次损伤，具有良好的生物降解性。④具有一定的抗菌性。⑤防止微生物、有害微粒及其他有害物质污染伤口。⑥制作及降解过程不会造成环境污染。

以海藻酸盐为原料研发的海藻纤维具有无毒性、高吸水成凝胶性、高透氧性、良好的生物相容性、整体易去除性、良好的生物降解吸收性、止血性能、能促进伤口愈合、高离子吸附性等优越特性，已被广泛应用于生物医学的研究。早在1951年，Blaine等^[5]就探讨了使用海藻酸作为可吸收止血材料的可能性，同时发现海藻酸对细菌生长有抑制作用。藻酸生物敷料从天然海藻中提取，加工过程中使用的材料没有任何毒性，因而海藻酸纤维生物敷料对人体无毒^[6] 。海藻酸能够维持创面一个湿润的环境，有利于创面愈合和皮肤再生。海藻酸生物敷料止血性能良好，能很好地降低伤口的疼痛，另外其成本也比较低。

银离子因其抗菌能力强、细菌耐药发生率低被选用作抗菌材料已有悠久的历史^[7] ，银被认为具有广谱的抗菌活性，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌及部分病毒等均有抗菌作用^[8] ，甚至对耐药菌株都显示出很强的抗菌作用^[9] 。研究表明银粒子不仅具有抗炎特性还有止痛作用^[10-11] ，能抑制DNA的复制，具有很强的渗透性，能渗透到皮下组织，与切口接触后迅速持久地释放纳米银粒子，快速有效地杀灭切口及缝线上的病原体。目前大量耐药菌的发生和增长促进银再次被作为抗菌剂应用^[12] ，添加银离子的海藻酸敷料表现较强的出快速杀菌能力，可用于感染伤口的局部控制细菌繁殖^[13] 。纳米银医用抗菌敷料是将纳米银附着于医用脱脂纱布或医用非织造布敷料。目前已有国内外多家生产企业推出了含银敷料^[14] ，最近加拿大临床试验证明添加藻酸盐银粉的抗菌敷料有利于促进慢性感染伤口的愈合^[15] 。

有研究结果表明银离子的释放与敷料内银的含量以及敷料从伤口上所吸收的渗出液的量有关^[16] 。以往有实验数据表明通过钙离子交联的藻酸盐与明胶按50/50的比例制造的水凝胶敷料，具有较好机械强度，能够充分保证敷料的弹性和湿润的环境，为伤口愈合提供一个舒适的环境^[17] 。百合医疗科技公司研发添加纳米银海藻酸钙纤维的新型复合生物抗菌敷料，纳米银医用抗菌敷料的抗菌性能及生物毒性检测对保证其安全有效的应用极为重要^[18-19] 。

实验将选用金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)分别作为革兰阳性菌和革兰阴性菌的代表，检测添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料、银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料的抗菌能力，对比3种敷料的吸湿能力，通过MTT细胞毒性实验评价添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料的细胞毒性，并在电镜下观察敷料的微观结构和细菌在敷料上的分布情况，证明该新型复合生物抗菌敷料具备高吸水性、强抗菌性、低毒性及无环境污染等条件，以期为临床寻找新一代敷料提供了很好的选择。

材料方法

设计：对比观察实验。
时间及地点：实验于2011年9月至2012年4月在南方医科大学附属珠江医院公共实验室完成。
材料：
敷料：添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料、海藻酸钙敷料、含银离子的海藻酸钙敷料均由百合医疗科技公司提供[18-19]，均进行了抗菌性能及生物毒性的检测。
菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)由南方医科大学珠江医院微生物实验室提供并常规保存。
细胞：L-929 (小鼠成纤维细胞)由南方医科大学细胞生物学研究所细胞库提供，培养基为添加体积分数2%小牛血清的RPMI1640。
方法：
平板计数法测试新型复合生物抗菌敷料的抗菌强度：金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是最常见的两种引起伤口处感染的病理性细菌，因此实验分别选用金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)作为革兰阳性菌代表和革兰阴性菌的代表，根据QB/T 2591-2003改进的平板计数法测试对比新型复合生物抗菌敷料的抗菌效果^[20] 。将已灭菌的新型纳米银海藻酸钙敷料、银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料分别裁剪成3 cm×3 cm的正方形材料。将厚度为0.1 mm的聚乙烯薄膜剪裁成如3种实验敷料形状，即3 cm×3 cm正方形材料。用体积分数70%乙醇溶液浸泡1 min，再用无菌水冲洗，自然干燥，备用。
分别配制浓度为1.5×10⁶ cfu/mL的金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)稀释液作为试验用菌液，随后分别取试验用菌液0.2 mL滴加在放置于灭菌平皿的新型纳米银海藻酸钙敷料样品(A)、银离子海藻酸钙敷料样品(B)、海藻酸钙敷料样品(C)及空白对照(D，即直接滴在灭菌平皿上)中，实验重复5次。用灭菌镊子夹起已灭菌的聚乙烯覆盖薄膜分别覆盖在样品(A)、样品(B)、样品(C)及空白对照(D)上，铺平，使菌均匀接触样品，保证样品覆盖膜部位所铺的菌浓度不变。然后将灭菌培养皿放置在(37±1)℃、相对湿度大于90%条件下培养24 h后，取出培养的样品，分别加入洗脱液20 mL，反复洗样品A，B，C，D的覆盖膜(用镊子夹起薄膜冲洗)，充分摇匀后，取200 μL接种于营养琼脂培养基中，在(37±1)℃下培养24 h后活菌计数，按GB/T 4789.2的方法测定活菌数。以上试验重复2次。
样品A、样品B、样品C及空白对照D培养24 h后的实际回收活菌数值，数值分别为A、B、C、D，样品N的抗细菌率为R(%)= (D-N)/D×100%。
吸湿实验检测新型复合生物抗菌敷料的吸液率及质量：称取8.3 g的氯化钠和0.277 g的无水氯化钙，溶于1 L的蒸馏水中配制成英国药典规定的A溶液^[21] 。在测试敷料的吸液率时，把3种敷料分别裁成5 cm×5 cm尺寸后放置24 h，使纤维的回潮率达到平衡。这时测定敷料的初始质量为m。称取比敷料重40倍的A溶液，分别将溶液和敷料对应放置在2个直径为9 cm的培养皿中，在37 ℃下放置30 min后用镊子夹住敷料的一角在空中，挂30 s后称取敷料的湿质量(m1)。单位质量敷料的吸液率= (m1-m)/m(g/g)，单位面积的吸液率=4(m1-m)g/ 100 cm²。重复上述实验3次，求其平均值。
测试液体在纤维内和纤维之间的分布时，把吸液后的敷料(质量为m1)用纱布分别包扎起来放在脱水机中脱水15 min后，测定脱水后敷料的质量为m2，这个质量是纤维本身的干质量和吸收进纤维内部的液体质量的总和。然后把离心脱水后的敷料在105 ℃干燥4 h，试样至恒质量后测得纤维的干质量m3。m1-m2是吸收在纤维之间的液体，而m2-m3是吸收进纤维内部的液体。(m1-m2)/m3和(m2-m3)/m3能分别计算出每克干质量的敷料吸收到纤维之间和纤维内部的液体。
MTT法检测新型复合生物抗菌敷料的细胞毒性：用MTT比色法对比检测新型复合生物抗菌敷料对L-929(小鼠成纤维细胞)的细胞毒性从而评价敷料的生物相容性。将L-929(小鼠成纤维细胞)以4×10⁴个/孔加入3块96孔细胞培养板中，先在37 ℃、体积分数5%CO₂的环境下培养 24 h。用含体积分数2%小牛血清的RPMI 1640培养液分别配制新型纳米银海藻酸钙敷料、银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料提取液A，B，C，并将A，B，C溶液分别用2%小牛血清的RPMI 1640培养液按体积分数75%，50%，25%，10%，1%梯度稀释(例如实验溶液为A100，A75，A50，A25，A10，A1)，然后分别取200 μL的A，B，C原提取液及各种浓度的稀释液加入L-929细胞孔中，每种提取液重复4孔/板，并以体积分数2%小牛血清RPMI 1640为阴性对照、用体积分数5%的二甲基亚砜为阳性对照。上述细胞放置于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养72 h。用PBS液配制成质量浓度为5 g/L的MTT(四唑盐)液，20 μL/孔加入上述3块细胞培养板细胞中，充分混匀，再培养4 h后终止培养。吸取培养上清液，再往培养板中加入150 μL/孔的二甲基亚砜，充分振荡10 min，选择 492 nm波长，在酶标检测仪上测定各孔吸光度值 (A492 nm)，并计算均值，同时计算细胞相对增殖率。

细胞相对增殖率(RGR)=(实验组A_{492 nm}值/阴性对照组A_{492 nm})×100%
最后结果转化为相应的细胞毒性等级：
Corresponding cytotoxicity levels:

细胞毒性(等级)	细胞相对增殖率(%)
0	≥100
1	75-99
2	50-74
3	25-49
4	1-24
5	0

扫描电镜检测新型复合生物抗菌敷料超微结构：将已灭菌的新型纳米银海藻酸钙敷料、银离子海藻酸钙敷料和海藻酸钙敷料3种实验材料分别裁剪成1 cm×1 cm的正方形，经高压灭菌后用戊二醛及锇酸双固定标本，以金属镀膜法把铂蒸发后覆盖在样品表面以获得良好图像。
各种敷料各制作3个标本，将样品标本放在扫描电镜下观察各自的显微结构，主要检测敷料在电镜下银离子和纳米银的邢台及分布情况。
将裁剪成1 cm×1 cm的实验样品(A为新型纳米银海藻酸钙敷料、B为银离子海藻酸钙敷料和C为海藻酸钙敷料)分别放进已经滴入0.2 mL浓度为1.5×10⁶cfu/mL的金黄色葡萄球菌(ATCC29213)菌液的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，然后将灭菌培养试管放置在(37±1) ℃、相对湿度大于90%条件下培养24 h。
用无菌镊子取出样品敷料，分别将其放置于无菌的吸水垫上吸取样品敷料上的多余水分将样品敷料依次放置于浸润在体积分数50%，70%，95%，100%乙醇中的无菌垫上按梯度逐步脱水，风干经上述处理的实验敷料用戊二醛及锇酸双固定标本，以金属镀膜法把铂蒸发后覆盖在样品表面以获得良好图像，检测细菌在各敷料上的分布情况。
主要观察指标：新型复合生物抗菌敷料抗菌强度、吸湿能力及细胞毒性。
统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，通过SPSS 13.0统计学软件对所得结果数据进行统计学分析，组间均数差异比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

预防性应用抗生素对防治切口或伤口感染已得到共识，但全身应用抗生素在切口或伤口局部的血药浓度比较低，难以杀灭黏附在切口或感染伤口的细菌，而且的不良反应较多。因此，选择既能创造湿性愈合环境，又有杀菌作用的新型敷料是未来工作的重点。

临床上，长久不愈的伤口组织局部含有大量蛋白酶、炎症因子和自由基，加上细菌的存在会加剧对组织的损伤，如果伤口局部组织的细菌浓度达到1× 105 cfu/g，即为感染的伤口^[22] ；如果伤口局部组织的细菌浓度达到1×106 cfu/g，那么就会给伤口的正常愈合带来影响，例如延迟伤口的愈合时间、加重伤口的炎症反应、增添患者的不适感、增加瘢痕形成的概率、延长患者的住院时间及增加治疗费用^[23-24] ；如果得不到及时正确的处理，细菌入血导致菌血症及败血症，甚至会发展成感染性休克。

因此，及时、正确地处理伤口感染是很重要的，其中正确选择抗菌能力强、生物相容性良好、吸湿能力强并制造一个湿性愈合环境、与不利于伤口愈合的病理因子结合、形成一层隔离保护膜避免进一步感染、缓解局部疼痛、无生物毒性及环境污染的抗感染敷料是治疗外科感染伤口的关键步骤之一^[25]。很多慢性感染伤口都是存在多重感染现象^[26] ，多种细菌感染时细菌之间会发生相互作用，增加了阐述抗菌敷料抗菌能力的复杂性。

体外实验证明，新型复合生物抗菌敷料具备良好的生物相容性、低细胞毒性、良好的吸湿性、较强的抗菌能力，适合应用于外科感染伤口的治疗。Liakos等^[27]研究发现天然高分子材料海藻酸钠和聚维酮碘聚合膜有效控制碘的释放，在48 h内表现出非常有效的抗菌和抗真菌活性，同时避免碘吸收中毒剂量。最近有研究认为，建立连续抗氧化系统和抗菌性能的多功能生物合成敷料用于慢性伤口的治疗有明显的优势^[28] 。

百合医疗科技公司研发了添加纳米银的新型复合生物抗菌敷料，由于临床上常见的致病菌是金黄色葡萄球菌，而且95%的金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，60%-70%的金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药^[29] 。

实验选择了临床上最常见的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌2种革兰阳性、革兰阴性的代表细菌检测新型复合生物抗菌敷料的抗菌能力，证明新型复合生物抗菌敷料的抗菌能力。该新型复合生物抗菌敷料需要进一步动物实验数据证明其优越性。目前此类抗感染实验模型、实验价指标还没有标准，有待进一步实验研究。另外，添加纳米银的海藻酸钠也可作为稳定剂与其他材料合成多功能的生物敷料^[30] 。

新型复合生物抗菌敷料的抗菌强度、吸湿能力及细胞毒性

A novel compound biological antibacterial dressing: Antimicrobial effectiveness, moisture absorption capacity and cytotoxicity

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