跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (15): 2661-2668.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.001

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跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死

杨国巍，朱晖，周子伟，李瑛，张彦军，张建宁

天津医科大学总医院，天津市神经病学研究所，教育部“中枢神经系统创伤修复与再生”重点实验室，天津市“神经损伤变异与再生”重点实验室，天津市 300052

收稿日期:2013-02-16 修回日期:2013-02-27 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 张建宁，博士，教授，博士生导师。天津医科大学总医院，天津市神经病学研究所，教育部“中枢神经系统创伤修复与再生”重点实验室，天津市“神经损伤变异与再生”重点实验室，天津市300052 jianningzhang@hotmail.com
作者简介:杨国巍★，男，1982年生，汉族，天津市人，天津医科大学在读硕士，主要从事脑外伤基础与临床研究。 yangguowei@tijmu.edu.cn

Dynamic observation of rat hippocampal neuronal death process by hopping probe ion conductance microscopy

Yang Guo-wei, Zhu Hui, Zhou Zi-wei, Li Ying, Zhang Yan-jun, Zhang Jian-ning

Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin Neurological Institute, Key Laboratory of Post-trauma Neuro-repair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Injuries, Variations and Regeneration of Nervous System, Tianjin 300052, China

Received:2013-02-16 Revised:2013-02-27 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Zhang Jian-ning, Doctor, Professor, Doctoral supervisor, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin Neurological Institute, Key Laboratory of Post-trauma Neuro-repair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Injuries, Variations and Regeneration of Nervous System, Tianjin 300052, China jianningzhang@hotmail.com
About author:Yang Guo-wei★, Studying for master’s degree, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin Neurological Institute, Key Laboratory of Post-trauma Neuro-repair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Injuries, Variations and Regeneration of Nervous System, Tianjin 300052, China yangguowei@tijmu.edu.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关于神经元坏死的分子机制研究已取得一定进展，然而由于技术水平的限制，对神经元坏死过程细胞的动态变化研究较少。应用跳跃探针式离子电导显微镜可对体外培养神经元进行实时、非接触式的连续观察。
目的：采用跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死过程中细胞表面形态随时间的动态变化。
方法：体外原代培养大鼠海马神经元，用1 mmol/L过氧化氢溶液处理30 min致神经元坏死。采用跳跃探针式离子电导显微镜连续扫描，观察神经元坏死过程中其胞体与突起的形态变化，并测量其细胞高度与体积变化。
结果与结论：跳跃探针式离子电导显微镜连续扫描9 h结果显示，过氧化氢组大鼠海马神经元由正常的三角形或梭形逐渐肿胀变成球形，轴突与树突出现串珠样改变，最终神经突断裂并溶解消失。同时测量细胞高度与体积后结果显示，过氧化氢组神经元细胞高度比及体积比于扫描后2-7 h之间持续增加(P < 0.05)，扫描后7-9 h之间维持于相对稳定水平，最终高度与体积值约为初始值的2倍。线性回归分析结果示在扫描后1-7 h之间过氧化氢组神经元高度与体积增加量与时间呈线性相关(b=0.15，P < 0.05； b=0.17，P < 0.05)。结果证实，利用跳跃式离子电导显微镜技术观察大鼠海马神经元坏死，可以得到了高质量的细胞图像，更准确的细胞高度与体积的信息。

关键词: 组织构建, 神经组织构建, 神经元, 坏死, 跳跃探针式离子电导显微镜, 过氧化氢, 海马, 超微结构, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: The molecular mechanism underlying neuronal cell death has been made some progress in the past years. However, the cell morphology dynamics after neuron death is still missing because of technical shortcomings. Even the time required for the execution of the death program is still unknown. However, neurons cultured in vitro can be observed continually in a non-contact manner by a hopping probe ion conductance microscopy, therefore the morphology changes of a death process can be obtained.
OBJECTIVE: To dynamically observe morphological changes of rat hippocampus neurons during a cell necrotic process by the hopping probe ion conductance microscopy.
METHODS: Primary Wistar rat hippocampal neurons were used for the experiment, and cell necrosis was induced by 1 mmol/L hydrogen peroxide solution for 30 minutes. Neurons without hydrogen peroxide-treatment were used as control. The morphology of neuronal soma and neurites were continually imaged by the hopping probe ion conductance microscopy after hydrogen peroxide treatment, and the height and volume of a neuron were simultaneously measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Continuous imaging for 9 hours after hydrogen peroxide treatment under the hopping probe ion conductance microscopy showed that: Hippocampal neurons gradually transformed from a normal triangular or fusiform shape to a more spherical shape due to cell swelling. Axon beading and dendritic beading were gradually formed after scanning, and finally the neurites were ruptured and dissolved. Measurement of the cell height and volume showed that: The height and volume of hydrogen peroxide-treated neurons elevated after 1 hour of scanning, and continued increasing up to 7 hours after scanning (P < 0.05). The final height and volume were approximately twice as beginning. The increase of height and volume manifested as linear correlation with time within 1 to 7 hours by linear-regression analysis (cell height b=0.15, P < 0.005; cell volume b=0.17, P < 0.05). Meanwhile, no significant morphological change was observed during the time of scanning a normal neuron. It is successful to observe necrotic process of hippocampus neurons by the hopping probe ion conductance microscopy. Higher-quality cell image and more accurate information about cell height and volume can be obtained.

Key words: tissue construction, nerve tissue construction, neurons, necrosis, hopping probe ion conductance microscopy, hydrogen peroxide, hippocampus, ultrastructure, rats

中图分类号:

R318

杨国巍，朱晖，周子伟，李瑛，张彦军，张建宁. 跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(15): 2661-2668.

Yang Guo-wei, Zhu Hui, Zhou Zi-wei, Li Ying, Zhang Yan-jun, Zhang Jian-ning. Dynamic observation of rat hippocampal neuronal death process by hopping probe ion conductance microscopy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(15): 2661-2668.

图/表（结果） 10

2.1 原代培养的大鼠海马神经元鉴定新生大鼠海马神经元培养7 d后进行微管相关蛋白2荧光染色鉴定。微管相关蛋白2特异表达于神经元细胞骨架。图1可见400和600倍荧光显微镜下观察细胞染色情况。其中微管相关蛋白2呈红色荧光，细胞核由DAPI染成蓝色，原代培养大鼠海马神经元阳性率>99%。

2.2 高剂量过氧化氢对大鼠海马神经元坏死的影响实验用较高浓度过氧化氢(1 mmol/L)致神经元坏死。为观察坏死效果，神经元经过氧化氢作用30 min后更换为普通neurobasal/B27培养基继续培养，3 h后行Annexin-V、PI荧光双标染色。Annexin-V可特异结合磷脂酰丝氨酸(PS)，细胞发生凋亡或坏死时，PS可被Annexin-V检测到^[9]。细胞坏死时细胞膜完整性破坏，PI可以通过破损细胞膜与细胞核特异结合。分别在100、200和400倍荧光显微镜下观察过氧化氢组与对照组Annexin-V(绿色)及PI(红色)的表达情况，可见大部分过氧化氢组神经元呈Annexin-V、PI双阳性，而对照组神经元Annexin-V和PI仅有少量阳性表达，见图2。

过氧化氢组 Annexin-V和PI阳性率大于对照组为(P < 0.01)。Annexin-V、PI染色结果证明大部分神经元经1 mmol/L 过氧化氢处理后发生坏死性改变。见图3。
2.3 相差显微镜下过氧化氢干预的大鼠海马坏死神经元形态见图4。
经过氧化氢处理后的神经元3 h后在相差显微镜下的形态，可见胞体肿胀，呈球形，神经突串珠形成；而正常神经元胞体呈三角形或梭形，突起完整光滑，见图4。

2.4 跳跃式离子电导显微镜扫描单个神经元坏死后形态过氧化氢处理30 min后立即换成L15培养基，通过跳跃式离子电导显微镜观察神经元形态，连续扫描9 h。扫描期间可见神经元胞体从1 h后开始肿胀，形状从开始的三角形或梭形逐渐变成球形。同时在扫描1 h时，可见轴突和树突形成串珠样改变，随扫描时间延长轴突和树突逐渐断裂直至溶解消失，见图5。

同时由扫描离子电导显微镜 Image Viewer生成的扫描细胞的高度和体积信息可见此神经元细胞起始高度为4.92 μm，于扫描1 h后开始增加，7 h后增加到 9.22 μm，约为原来的两倍。与此同时1 h后神经元体积开始增加，至7 h达到2 085 μm3约为初始体积(973 μm3)的2倍。7-9 h之间神经元的高度与体积不再继续增加，处于稳定水平，见图6。

经跳跃式离子电导显微镜连续扫描9 h发现：对照组神经元胞体呈三角形，扫描9 h内胞体形状没有明显变化，轴突和树突等神经突起光滑完整，扫描9 h内没有断裂或减少，见图7。扫描开始时细胞高度为5.45 μm，扫描9 h结束时高度为5.77 μm，扫描开始时细胞体积为972 μm3，9 h体积为989 μm3，均变化不大，见图8。

与对照组相比，过氧化氢组细胞高度比和体积比从扫描1 h后开始增加，并于2-7 h之间持续增加(P < 0.05)，7-9 h之间维持于相对稳定水平。扫描7 h时达顶峰，并维持在初始高度和体积的2倍水平。见图9。

回归分析结果表明：过氧化氢组神经元在扫描1- 7 h之间高度与体积比的增加与时间呈线性相关(b=0.15，P=0.00；b=0.17，P=0.00)，而对照组神经元高度比与体积比在1-7 h之间与时间无线性相关 (P > 0.05)。见表1。

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引言

动态观察神经元坏死后其表面形态的变化对研究神经元的坏死过程具有重要意义。然而由于技术条件的限制，目前尚没有针对体外培养神经元坏死后进行高分辨率动态观察的方法。传统的连续观察方法是利用时间间隔显微成像技术，然而由于光学衍射的限制，普通光学相差显微镜分辨率在1 000倍以下，观察极限分辨率是0.2 μm，因此不能观察神经元表面的细微结构^[1]。扫描电子显微镜的发明突破了光学衍射的极限使分辨率达0.2 nm，然而电子显微镜在观察生物样本时，需要对样品进行固化处理且需要在真空下观察，但不能观察活的生物样品^[2]。扫描离子电导显微镜由于可以直接在溶液中工作，因此可以在纳米尺度下对活的生物样品表面进行直接观察^[3]。

探针跳跃式离子电导显微镜属于扫描离子电导显微镜家族成员，其在工作时不破坏样品表面结构，可对形态结构复杂且不规则的生物样品进行成像，成像速度更快，精确度更高，目前已被用于多种生物样品的表面成像^[4]。Liu等^[5]用跳跃式离子电导显微镜区分了SK-N-SH神经母细胞瘤细胞3种不同亚型的表面形态，Yang等^[6]成功观察了PC12细胞经神经生长因子诱导后其细胞形态变化及神经突起生长情况。

外源性过氧化氢处理体外培养神经元是一种常用的氧化应激致神经元损伤模型^[7]。过氧化氢作为一种氧化应激源，可破坏神经元的细胞膜、多种蛋白质和DNA等重要结构从而引起神经元损伤，大剂量过氧化氢可直接致神经元坏死^[8]。实验应用体外培养原代大鼠海马神经元细胞，经大剂量过氧化氢致神经元损伤后，应用跳跃式离子电导显微镜连续扫描观察神经元的坏死过程及其胞体与突起在坏死过程中的形态改变。

材料方法

1 材料和方法

设计：细胞学体外实验。
时间及地点：于2011年10月至2012年6月在天津市神经病学研究所完成。
材料：新生24 h内的Wistar大鼠60只，由解放军军事科学院提供，动物许可证号SCXK-(军)2007-004。
跳跃式离子电导显微镜连续扫描观察实验相关主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
大鼠海马神经元培养及过氧化氢致神经元损伤模型的建立：新生Wistar大鼠(<24 h)，于体积分数75%乙醇溶液中消毒10 min后，断头并剪开颅骨，取脑后置于预冷    (4 ℃)的Hank’s平衡盐溶液中，显微镊轻柔分离脑膜，取海马组织，用显微剪把脑组织剪成1 mm3的组织碎块。应用Hank’s液洗去红细胞等杂质，加入体积分数0.125%胰酶和0.01%DNA酶，在37 ℃ CO2培养箱中消化30 min，吸去含胰酶的Hank’s液，用DMEM/F12培养基再悬脑组织，并用1 mL移液器反复轻柔吹打成单细胞悬液，后用70 μm细胞筛过滤，细胞计数后以5×107 L-1的细胞浓度接种于包被多聚赖氨酸的35 mm细胞培养皿上。37 ℃，CO2培养箱中培养4 h，待细胞贴壁后换成Neurobasal/B27培养基继续培养，1 d后加入  5 mmol/L阿糖胞苷，以后每两天半量换液，培养7 d后细胞突起发育完全，可用于实验。神经元损伤用少量溶液加入培养皿中致终浓度为1 mmol/L，37 ℃培养箱中作用30 min后可用于扫描。实验分为对照组与过氧化氢组，分别行跳跃式离子电导显微镜扫描。
大鼠海马神经元的鉴定：培养于盖玻片上的细胞7 d后行免疫荧光染色。质量浓度40 g/L多聚甲醛固定2 h后，PBS洗3次，加入1∶1 000稀释的兔抗大鼠微管相关蛋白2一抗。4 ℃过夜后，PBS洗3次，体积分数2%BSA封闭1 h后，PBS洗3次，加PE标记的山羊抗兔二抗，避光下37 ℃反应2 h，PBS洗3次，加1 mg/L的DAPI溶液染核，10 min后，PBS洗3次，甘油封固，在荧光显微镜下观察，并行阳性细胞计数。
Annexin-V、PI 荧光双标染色观察大鼠海马神经元形态：根据生产商的说明书进行Annexin-V、PI染色，将细胞用Hank’s液洗3次，后加入455 μL缓冲液，50 μL Annexin-V反应液，5 μL PI反应液。在37 ℃培养箱中反应10 min，取出培养皿，用缓冲液洗3遍后最后加入   500 μL缓冲液，待上镜观察。荧光显微镜下观察细胞，并计数5个培养皿中随机4个200倍视野下阳性细胞率，整个染色过程需避光操作。
跳跃探针式离子电导显微镜观察大鼠海马神经元超微结构：L15 培养基作为扫描神经元时的样品浴液和电极内液。硅酸盐玻璃毛细管经激光微电极拉制仪制成外径   1 mm，内径0.59 mm，长90 mm的玻璃微探针，确保探针在L15培养基中的电阻范围为100-150 MΩ。扫描装置包括ICnano扫描控制器和SH01扫描头，扫描头置于倒置显微镜的载物台上，由一个XY向100 μm×100 μm的纳米级平板压电陶瓷扫描台和一个Z向25 μm的LISA高精度平板压电陶瓷组成，其中XY向扫描台可使扫描样品水平移动，Z向平板压电陶瓷连接玻璃微探针并使探针上下跳跃。利用MultiClamp 700B 膜片钳放大器给跳跃式离子电导显微镜的微探针提供200 mV的直流电压，微探针跳跃至神经元样品表面一定高度时，测得一个通过针尖的参考电流Iref，然后微探针以设定的     100 nm/ms的恒定速度Z向向下接近神经元样品表面。当通过探针的电流减少Iref的0.4%时，探针停止向下移动，此时探针与样品表面仍保持一段距离，此时Z向压电陶瓷的位置即为此成像点的高度值，同时结合水平面XY扫描台的位置, 即可得到该成像点处样品的三维坐标。其后，微探针再次跳跃至预设高度，同时XY向扫描台移动到下一个成像点，重新开始下一个采样循环, 从而得到整个神经元的表面三维图像。整个扫描范围   80 μm×80 μm，约20 min可扫描1个图像，用系统自带的图像处理软件扫描离子电导显微镜 Image Viewer对成像结果进行分析处理，图像处理软件可同时生成细胞高度及体积等信息。因为每个神经元的高度及体积均不同，为比较不同细胞之间高度与体积的变化情况，需计算扫描后细胞高度、体积与其初始值的比值，并以细胞高度比和体积比进行统计学分析，每组分别取6个细胞观察。
主要观察指标：跳跃探针式离子电导显微镜下观察神经元坏死后胞体与突起随时间的动态变化，测量并比较神经元坏死过程中高度及体积随时间的变化。
统计学分析：计量资料结果用表示，采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，统计学方法采用两样本t 检验及线性回归分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经元坏死的形态研究在神经元坏死机制研究中具有重要意义。在脑血管病、脑损伤及阿尔茨海默病等多种神经系统疾病中，均可出现大量神经元发生变性坏死，因此关于其变性坏死机制的研究具有重要意义^[10]。近年的研究发现细胞坏死不只是一种完全被动的行为，而是一种受到精细调控的主动过程^[11]。细胞坏死的最新定义为质膜完整性不可逆性的缺失^[12]。关于细胞坏死的分子生物学机制研究目前已取得一定进展，然而由于技术水平的限制，对神经元坏死过程中，其细胞形态随时间的动态变化的研究仍有不足，甚至对体外培养神经元坏死过程所需的时间仍不清楚^[13]。

实验应用跳跃式离子电导显微镜实现了对神经元坏死过程的连续高分辨率动态观察。扫描离子电导显微镜的发明解决了在溶液中对活细胞进行实时观察的问题。其设计原理是基于探针在接近样品表面时，流入探针的离子流会相应减少。Hansma等^[14]设计出了第一台扫描离子电导显微镜，但由于当时技术水平的限制，最初的扫描离子电导显微镜不能满足活体生物样品扫描的需要。Novak等[15]在连续负反馈模式扫描离子电导显微镜基础上再一次进行了改进，研究出了全新的跳跃模式，即跳跃式离子电导显微镜。跳跃模式使探针对于电压的变化更加敏感，并且增加了探针的抗干扰能力，使探针与样品之间的距离控制更加精准可靠，从而使跳跃式离子电导显微镜在纳米生物学领域得到广泛的应用^[16]。跳跃式离子电导显微镜突破了光学衍射的极限，分辨率可达纳米级别，更适合在复杂的生物样品表面工作，可直接对处于培养基生理液态环境中的活体生物样品进行实时、高分辨率的扫描成像。本次实验成功运用跳跃探针式离子电导显微镜连续观察了体外培养大鼠海马神经元的坏死过程，并对其坏死过程中细胞高度及体积变化进行了测量。

实验应用跳跃式离子电导显微镜实现了对神经元坏死过程中细胞高度和体积的定量观测。神经元坏死后可发生质膜完整性破坏，细胞体积增加，细胞器肿胀等形态变化，而这种形态变化在神经元坏死后发生的时间仍缺少相关报道[17]。实验用大剂量过氧化氢致神经元损伤模型中发现：体外培养的大鼠神经元在坏死后1 h内体积及高度并没有明显变化，而从第过氧化氢处理1 h后其细胞体积及高度均随时间开始增加，1-7 h的增长曲线与时间线性相关，7 h后体积及高度停止增加，整个增加时间持续约6 h，同时细胞形态从开始的三角形或梭形渐变成球形。神经元胞体肿胀可能与其坏死过程中能量代谢受到破坏，不能产生足够的ATP以维持细胞内Na+，K+，Cl+等离子平衡，其中细胞排Na+障碍及非选择性阳离子通道的开放所引起的细胞内Na+蓄积被认为与H2O最终进入细胞内及细胞肿胀直接相关^[18-19]。然而神经元坏死过程中，实验观察到的这种神经元体积随时间的增长与相关离子通道改变的关系仍需进一步研究。此外，神经元坏死过程中，膜完整性破坏与细胞肿胀之间的因果联系也需要进一步探讨。

同时实验发现过氧化氢致神经元坏死过程中，轴突和树突等细胞突起呈串珠样改变。轴突和树突的局部肿胀样改变在多种损伤致神经元变性中均可出现。神经元在亚致死量谷氨酸、缺氧等刺激下形成神经突串珠可在胞体出现相关变化前出现[20]。轻微的神经元变性可单独出现神经突的变化，而不伴随胞体的改变，同时这种串珠样改变呈可逆性^[21]。而在实验的实验中神经元胞体肿胀与神经突串珠形成同时发生，而且神经突串珠呈不可逆性改变，并最终导致轴突、树突的崩解，这可能与大剂量过氧化氢致神经元不可逆性坏死有关。神经元变性坏死过程中神经突呈特征性的局部肿胀，而不是神经突整体肿胀，Greenwood等^[22]认为这可能是由于神经突局部Ca2+内流增加导致线
粒体超极化，致局部ATP水平下降，导致局部继发性Na+蓄积，最终H2O内流致微管等细胞骨架结构破坏，但神经突串珠形成的确切机制至今仍不明。

综上所述，利用跳跃式离子电导显微镜技术观察神经元坏死过程可以得到了分辨率更高的图像，更准确的高度与体积的信息。这使实验对神经元坏死过程的形态变化有了更深入的了解。然而对神经元坏死过程中细胞形态发生改变的生物学意义，细胞形态变化背后的分子机制及相关离子通道的改变仍需进一步研究。

跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死

Dynamic observation of rat hippocampal neuronal death process by hopping probe ion conductance microscopy

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