红花注射液保存人胎羊膜贴敷皮肤切口

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.12.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (12): 2210-2217.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.12.018

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红花注射液保存人胎羊膜贴敷皮肤切口

罗秋燕，李慧智，边文玲，王莉莉

新乡医学院第三附属医院妇产科，河南省新乡市 453003

收稿日期:2012-12-19 修回日期:2013-01-16 出版日期:2013-03-19 发布日期:2013-03-19
通讯作者: 罗秋燕★，女，1978年生，汉族，吉林省吉林市人，2002年长春中医学院毕业，硕士，主治中医师，讲师。 luoqiuyan2002@163.com
作者简介:罗秋燕★，女，1978年生，汉族，吉林省吉林市人，2002年长春中医学院毕业，硕士，主治中医师，讲师。 luoqiuyan2002@163.com

Safflower injection-preserved human amniotic membrane is applied in skin wound

Luo Qiu-yan, Li Hui-zhi, Bian Wen-ling, Wang Li-li

Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China

Received:2012-12-19 Revised:2013-01-16 Online:2013-03-19 Published:2013-03-19
Contact: Luo Qiu-yan, Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China luoqiuyan2002@163.com
About author:Luo Qiu-yan★, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管内皮生长因子参与创伤组织修复，可促进与创面愈合。
目的：观察红花注射液保存人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合中感染率及血管内皮生长因子表达的影响。
方法：建立大鼠皮肤切创模型，建模后随机分成4组，分别以纱布、羊膜、及红花注射液处理过的胎儿面羊膜贴敷在切口表面，于切创后2，3，5，7 d取大鼠切口皮肤组织应用免疫组织化学染色，通过计算机图像分析系统检测大鼠切口皮肤组织中血管内皮生长因子的表达情况，同时观察切口感染率。
结果与结论：切创后2，3 d，红花+羊膜组的血管内皮生长因子的表达明显高于其他3组(P < 0.05)。切创后5 d，红花+羊膜组感染率(5%)较其他3组明显减少(P < 0.05)。结果证实，经红花注射液保存后的人胎羊膜在大鼠皮肤切创愈合的早期阶段，可促进创缘周围血管内皮生长因子的表达，将其贴附创面能明显减少创口的感染率、促进创口的愈合。

关键词: 生物材料, 细胞外基质材料, 人胎羊膜, 红花注射液, 切创愈合, 血管内皮生长因子, 瘢痕, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor can participate in tissue repair and promote wound healing.
OBJECTIVE: To observe the infection rate and vascular endothelial growth factor expression during the healing of rat skin wound following treated with human amniotic membrane preserved by the safflower injection.
METHODS: Rats were randomly divided into four groups after skin wound modeling. The wounds were stuck with gauze, amniotic membrane and amniotic membrane saved with safflower injection. Skin tissue samples of rats were taken at 2, 3, 5, 7 days after wound for immunohistochemical staining. Then the expressions of vascular endothelial growth factor and infection rate were detected with auto image analysis system.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of vascular endothelial growth factor was much higher in the rats treated with human amniotic membrane saved with safflower injection than the others at days 2 and 3 after wound (P < 0.05). The infection rate of skin wound in the rats treated with human amnion saved with safflower injection (5%) was less than that of the other groups at day 5 after wound (P < 0.05). Results showed that the human amniotic membrane preserved by safflower injection could not only enhance the expression of vascular endothelial growth factor around the area of injury in the initial stage, but also reduce the infection rate of skin wound, thereby promoting wound healing in rats.

Key words: biomaterials, extracellular matrix materials, human amniotic membrane, safflower injection, wound healing, vascular endothelial growth factor, scar, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs- containing paper

中图分类号:

R318

罗秋燕，李慧智，边文玲，王莉莉. 红花注射液保存人胎羊膜贴敷皮肤切口[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(12): 2210-2217.

Luo Qiu-yan, Li Hui-zhi, Bian Wen-ling, Wang Li-li. Safflower injection-preserved human amniotic membrane is applied in skin wound[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(12): 2210-2217.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

由于各种因素的影响，中国剖宫产率逐年提高，随之带来的剖宫产切口感染问题及切口的修复过程中细胞因子的研究亦逐步受到重视。探索创伤修复过程的形成机制以求达到理想的组织修复，一直是外科基础研究的重要课题。

组织的创伤修复首先通过肉芽组织增生，溶解吸收损伤局部的坏死组织及其他异物，并填补组织缺损，此后肉芽组织转化为胶原纤维为主的瘢痕组织，修复便告完成。肉芽组织和瘢痕组织的形成过程包括：血管生成，成纤维细胞增殖和迁移，细胞外基质成分的积聚和纤维组织的重建。创伤修复是一个复杂而有序的生物学过程，每一个修复阶段均受到机体精细的调节，其中血管内皮生长因子被认为是作用最强、特异性最高的调控因子。血管内皮生长因子又称血管通透因子，是一种同型二聚体糖蛋白^[1]，其主要生物学功能：①促进血管生存和血管发生，诱导新血管形成。②维持血管正常状态和完整性，增加血管通透性。③促进血浆蛋白在细胞基质中沉积，增加组织血流灌注以及改善组织缺血状态^[2-4]。

人胎羊膜是一种天然高分子生物材料，系胎盘即中药紫河车的一部分(羊膜的胎儿面)，是胎盘中细胞生长、分化最活跃的部分，具有益气养血之功效。羊膜外敷具有防御功能，减少切口感染率，对创面愈合具有促进作用。羊膜还含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分，它能表达多种上述生长因子及其mRNA的相关蛋白，能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分，有利于细胞的生长繁殖。羊膜外用具有防御功能，可阻止细菌入侵、免疫排斥反应低^[5]。现在它已被广泛应用于外科、皮肤科、眼科及泌尿生殖科等等。

血管内皮生长因子已在周围血管疾病、肿瘤、糖尿病、创伤修复及组织重建领域得到广泛研究和初步应用。有研究表明，活血化瘀中药内服促进血管内皮生长因子水平增加，但外用贴敷创口能否引起血管内皮生长因子增加鲜有报道。鉴于此，实验主要观察红花液保存胎膜贴敷创口后对创口感染率及血管内皮生长因子的影响，以期为促进切口愈合、减少瘢痕形成的干预和治疗奠定基础。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年1月至2011年1月在新乡医学院基础医学院中心实验室完成。
材料：
实验动物：健康成年清洁级SD雄性大鼠80只，体质量300-400 g，由新乡医学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(豫)2010-0019。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[5]。
羊膜：新鲜人羊膜均取自新乡医学院第三附属医院妇产科健康剖宫产产妇的胎盘(年龄、孕产胎次等影响因素除外)，根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》在实验前将实验方案和风险告知对方，并签署知情同意书^[6]。选择产前血清学检查已排除艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎及梅毒等传染性疾病，无胎膜早破、胎粪污染，羊水澄清的胎盘。无菌条件下用生理盐水反复冲洗去除血凝块，通过羊膜与绒毛膜间的潜在空隙进行钝性分离羊膜，无菌生理盐水反复漂洗后剪成6 cm× 3 cm小块，放入体积分数0.1%的洗必泰中浸泡消毒10 h备用，使用前再次用无菌生理盐水冲洗^[7]。
红花注射液：红花注射液为中药红花有效成分提取物，含有红花黄色素、红花醌苷、红花素及新红花苷；20 mL/支，每毫升注射液相当于红花原生药0.5 g，由山西亚宝药业集团股份有限公司提供，国药准字Z14020783，局部外敷创面。
将上述处理过的部分羊膜片置入红花注射液中浸泡12 h后取出，转移到消毒后的中性硅玻璃瓶内，封闭瓶口置于4 ℃冰箱中保存备用。
红花注射液保存人胎羊膜贴敷大鼠皮肤切口实验的试剂及仪器：
Reagents and instruments for rat skin wound stuck with safflower injection-preserved human amniotic membrane:

方法：
大鼠皮肤切创模型的建立及分组：将符合纳入标准的全部80只大鼠经体积分数5%水合氯醛0.5-0.7 mL/kg腹腔麻醉。消毒铺巾后在背中线旁约1 cm处做长约4 cm纵行切口，止血后间断缝合皮下组织及皮肤，切口表面干燥、无渗血渗液。建模成功后，将80只大鼠随机分成4组：对照组、羊膜组、红花组及红花+羊膜组，每组20只，同时每组又设创伤后2，3，5，7 d共4个时间点，每个时间点5只。
对照组用纱布覆盖切口并包扎；红花组、羊膜组、红花+羊膜组分别将红花注射液、处理过的羊膜(胎儿面)贴敷在切口表面，纱布覆盖、包扎。分笼饲养，3 d后换药，羊膜组与红花+羊膜组不换羊膜敷料。分别于切创后2，3，5，7 d处死大鼠进行实验。
血管内皮生长因子免疫组织化染色：采用免疫组织化学 SP法检测切口皮肤组织中血管内皮生长因子的表达。步骤如下：取材后均放入40 g/L多聚甲醛中固定12 h后，常规切片、脱蜡、水化。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)抗原热修复15 min，置于体积分数3%H2O2中，室温下孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次，体积分数5%正常山羊血清封闭，室温下孵育15 min。大鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体作为一抗(1∶400，北京中杉金桥生物技术有限公司，SC-7269)，4 ℃过夜后37 ℃孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次，PBS代替一抗作为阴性对照。滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次。链霉卵白液，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次。DAB显色5 min，自来水冲洗，苏木精复染，体积分数1%的盐酸乙醇分化，自来水冲洗，脱水透明，中性树胶封固，过夜干燥。免疫组织化学SP法染色、DAB显色均按说明书进行^[8-10]。
染色后，在高倍显微镜(×400)下观察并采集信号，用Image-Pro Plus 6. 0图像分析软件进行形态定量分析检测吸光度，并记录其平均值，即积分吸光度。观察结果：10%以上细胞质呈棕黄色者为血管内皮生长因子阳性表达，10%以下为阴性表达；吸光度越大，表示其含量越高^[11]。
切口感染诊断标准：根据国家卫生部医改司医院感染监测小组制定的医院感染诊断标准，切口处有红、肿、热、痛、脓性分泌物是切口感染的主要诊断依据^[12]。
主要观察指标：在每次换药和取材前大体观察大鼠生命体征及创面情况并记录，包括：肉芽的生长情况、是否有新鲜的血管生成、有无渗液等；愈合过程中皮瓣的颜色、质地、组织水肿、坏死、炎症情况及有无肿胀。若大鼠皮肤切口处出现上述感染指征，即可判定出现切口感染。
统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，计数资料用率表示。结果数据采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，组间数据的比较采用因素方差分析和χ²检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血管内皮生长因子与创面愈合关系：损伤早期增高血管内皮生长因子，使缺血组织重新建立血运而存活并促进肉芽形成是本课题研究的主要目的。促进伤口愈合和减少瘢痕形成是很多研究人员所希望达到的目的，血管内皮生长因子是一种功能强大并能产生多种生物学效应的细胞因子，对血管再生起着关键的作用。

红花与血管内皮生长因子的关系：红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，临床上常以水煎入药，具有活血通络、散肿止痛之功效^[13]。现代研究表明：红花主要含有黄酮醇、苷类、脂肪酸等成分，可抑制血小板聚集、抗血栓形成、促进纤维蛋白溶解、扩张外周血管等；而红花注射液则具有抗炎、抗凝、抗缺氧作用，能显著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)诱导的血小板聚集，促进纤维蛋白溶解，抑制血栓形成，同时无明显的毒不良反应。在临床上广泛应用于心脑血管、血液系统、创伤感染及跌打损伤等疾病^[14-17]。红花内服或静脉应用增强血管内皮生长因子表达促进创伤愈合^[18]，抑制血栓形成。同时由于剖宫产子宫内膜血窦开放，红花内服及静脉应用可引起子宫出血过多，这就限制了红花在剖宫产创伤修复中的内服及静脉应用^[19]；但红花创伤局部外用能否增强血管内皮生长因子含量未见报导。本次实验发现：红花组的感染率明显低于对照组；切创后2，3 d，创口边缘血管内皮生长因子表达较对照组明显增强，均有统计学意义；故红花外用可增强血管内皮生长因子表达、减少切口感染、促进创伤愈合。考虑与红花等活血化瘀药物具有正向调高血管内皮生长因子水平，从而促进创面微血管新生增殖，加快毛细血管重建塑形，达到促进创面愈合的作用。

近年来有关血管内皮生长因子与创面愈合关系的研究(按主题排序)：

近年来有关红花与血管内皮生长因子的关系研究(按主题排序)：

羊膜外敷与创面炎性反应关系：中性粒细胞能吞噬细菌和伤口中的坏死组织，中性粒细胞的侵润在伤后24 h达到高峰，而后随着单核细胞进入伤口，其数量减少。单核细胞破坏细菌和坏死组织后转变成巨噬细胞，巨噬细胞也是伤口愈合过程中所必须的^[20]。羊膜以其来源广泛、价格低廉、应用操作简便、生物组织相容性好，且存在的伦理问题少等特有的优点和生物学活性，已成为理想的生物材料^[21]。本次实验结果显示：羊膜组的感染率、炎性细胞的表达亦明显低于对照组。但是其取材、保存和使用需遵循严格的医学标准。由于新鲜羊膜存在着安全隐患问题，而且也不能保证随时供应，使其在临床的应用受到很大限制，目前多种保存羊膜的方法在临床上均有成功的报道。羊膜作为生物支架制成的真皮替代物在临床中的应用也会遇到种种困难。如何更能保持羊膜的生物活性，改良人工羊膜制备及贮存方法以及构建更加适于并能有效附载种子细胞及其分化所需生物环境的组织工程载体材料，都将通过各种基因修饰等技术使之成为可能。

羊膜与红花联合应用在促进创面愈合中的作用：以往研究表明：皮肤切创愈合过程中，血管内皮生长因子于创后 2 d开始表达并逐渐增强。本次实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强血管内皮生长因子表达，同时减少感染率，二者具有协同作用。考虑可能与以下因素有关：①二者联合使用，可以覆盖创面行成一个闭合环境，防止了细菌污染，使机体自身的防御能力在局部得以最大限度的发挥，达到抗菌、消炎、减少感染的目的。②羊膜含有高水平的表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、角蛋白细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、肝细胞生长因子(hypatocyte growth factor, HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等多种生长因子^[22]，羊膜与红花联合应用，可以促进细胞黏附、迁移、增殖和分化等生命功能，维持细胞生长，阻止上皮细胞凋亡，从而达到促进上皮组织生长、加速创面愈合的目的。③羊膜是一个良好的半透薄膜，为膜内包裹细胞提供所需营养物质浓度，与周围神经许旺细胞基底膜成分类相似，用经红花注射液保存过的羊膜覆盖创面，使其隔绝了与外界的接触，减少了水分的蒸发，可保持创面一定的湿度、减轻创面浅表神经的暴露因冷热及机械性刺激引起的疼痛，而且对许旺细胞的贴壁黏附、分裂增殖以及许旺细胞的髓鞘化有着重要作用^[23]，因此具有明显减轻或消除创面疼痛的作用。因此经红花注射液保存后的胎羊膜外用贴敷创面，不仅安全，而且价格低廉；在减少切口感染、促进创面愈合、减少增生性瘢痕方面有一定潜力，两者联合应用更值得进一步研究和探索，为大家以后的研究提供了很好的理论基础及方向。

近年来有关羊膜注射液与红花联合治疗创面愈合的研究(按主题排序)：

近年来有关羊膜注射液与红花联合治疗创面愈合的研究(按主题排序)：

总之，本次实验首次发现红花及用红花注射液保存的羊膜外敷提高皮肤切创后早期血管内皮生长因子的表达，减少创口的感染率，促进切口愈合，以红花配羊膜效果更佳，两者有协同作用。随着研究的不断深入，加上与新技术的完美结合，各种保存形式的羊膜在各种组织工程中的应用必将组织修复带入一个新的领域。

基金资助：河南省科技厅资助项目(082102310084)。
作者贡献：所有作者均参与了本次实验的实施和评估，均对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理批准：实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

文章快阅

延伸阅读

1 实验设计及文章构思特点

对组织创伤愈合研究发现：血管内皮生长因子是参与创伤组织修复的重要因子，可促进创面愈合。红花内服或静脉应用增强血管内皮生长因子表达促进创伤愈合，同时由于剖宫产子宫内膜血窦开放，红花内服及静脉应用引起子宫出血过多，这就限制了红花在剖宫产创伤修复中的内服及静脉应用，红花创伤局部外用能否增强血管内皮生长因子含量未见报导。实验旨在研究红花注射液保存人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合中感染率及血管内皮生长因子表达的影响。

2 文章创新点

活血化瘀中药内服可促进血管内皮生长因子水平增加，但外用贴敷创口能否引起血管内皮生长因子增加却鲜有报导。实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强血管内皮生长因子表达，同时减少感染率，二者具有协同作用；实验采用更为科学的积分吸光度反应组织中血管内皮生长因子的表达情况，弥补了以往单纯应用定性指标的不足，使结果更加客观。从而为实现对促进切口愈合、减少瘢痕形成的干预和治疗奠定基础。

3 文章概要：

文章要点：中药红花内服或静脉给药可促进血管内皮生长因子水平增加，但外用贴敷创口能否引起血管内皮生长因子增加却鲜有报导。本次实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强血管内皮生长因子表达，同时减少感染率，二者具有协同作用。本次实验采用更为科学的积分吸光度反应组织中血管内皮生长因子的表达情况，弥补了以往单纯应用定性指标的不足，使结果更加客观。从而为实现对促进切口愈合、减少瘢痕形成的干预和治疗奠定基础。

关键信息：经红花注射液保存后的人胎羊膜在大鼠皮肤切创愈合的早期阶段，可促进创缘周围血管内皮生长因子的表达；将其贴附创面能明显减少创口的感染率、促进创口的愈合。

研究的创新之处与不足：实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强血管内皮生长因子表达、促进创面愈合，同时减少感染率，二者具有协同作用；但二者联用对减少瘢痕组织形成方面的探讨尚处于起步阶段，值得日后进一步研究。

红花注射液保存人胎羊膜贴敷皮肤切口

Safflower injection-preserved human amniotic membrane is applied in skin wound

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