人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞的共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：软骨细胞移植等组织工程方法已经成为非常有潜力的骨关节炎治疗措施，软骨下骨的成骨细胞对软骨细胞的作用不仅参与骨关节炎的发生和发展，而且与细胞移植治疗预后有着密切的关系。
目的：培养人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞，构建两者共培养的细胞培养模型，探讨软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的作用。
方法：收集骨关节炎患者行全膝关节置换和严重创伤患者行截肢后遗弃的胫骨平台组织，采用Ⅰ型胶原酶连续消化后进行贴壁培养的方法，培养软骨下骨的成骨细胞，应用Ⅱ型胶原酶消化方法，培养软骨细胞，然后应用多孔插入器细胞培养池构建成骨细胞和软骨细胞三维共培养模型。
结果与结论：通过免疫组化，NBT/BCIP染色，茜素红染色等检查，证实成功培养出成骨细胞和软骨细胞。实时定量RT-PCR显示，在与骨关节炎的软骨下骨成骨细胞共培养的软骨细胞中，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达明显下降。可见骨关节炎患者的成骨细胞能促进软骨细胞的退变。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 软骨下骨, 成骨细胞, 软骨细胞, 骨关节炎, 共培养, 实时定量RT-PCR, Ⅱ型胶原, 蛋白聚糖, Ⅰ型胶原, 碱性磷酸酶, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Cartilage tissue engineering provides a potential method for the treatment of osteoarthritis. The relation and mechanism of interaction that subchondral osteoblasts act on chondrocytes are worthy of further research.
OBJECTIVE: To co-culture subchondral osteoblasts and chondrocytes from human knee joint, thereby constructing a co-culture system of subchondral osteoblasts and chondrocytes to investigate the reaction between osteoblasts and chondrocytes.
METHODS: Subchondral bone specimens were obtained from patients undergoing total knee replacement for primary osteoarthritis and those receiving amputation surgeries for serious limb injuries. Primary osteoblasts were isolated from subchondral bone specimens using sequential digestion method, and identified using type Ⅰ collagen immunochemistry. Primary chondrocytes were isolated from articular specimens after amputation and identified using type Ⅱ collagen immunochemistry. Then, a three-dimensional co-culture system of osteoblasts and chondrocytes was constructed using cell culture inserts.
RESULTS AND CONCLUSION: Osteoblasts and chondrocytes were identified successfully using immunochemistry, NBT/BCIP staining, and alizarin red staining. Real-time quantitative reverse transcription-PCR results exhibited that expression of type Ⅱ collagen and proteoglycans significantly decreased in chondrocytes co-cultured with subchondral osteoblasts from osteoarthritis patients. These findings show that osteoblasts from osteoarthritis patients can initiate chondrocyte phenotypes shifting towards degenerative differentiation.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, subchondral bone, osteoblasts, chondrocytes, osteoarthritis, co-culture, real-time quantitative reverse transcription-PCR, type Ⅱ collagen, proteoglycans, type Ⅰ collagen, alkaline phosphatase, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张立智，蒋垚，毛彦杰，黄成龙. 人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞的共培养[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1909-1916.

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图/表（结果） 6

2.1 软骨下骨成骨细胞的培养及鉴定 Ⅰ型胶原酶序列消化后贴壁培养方法培养软骨下骨成骨细胞，大约3周后，细胞爬出骨片，贴附于培养瓶底，细胞可呈多种形态，如三角形、梭形、多角形、立方形等，见图1A；4-6周时，细胞可融合成片。Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化染色显示，原代培养的成骨细胞的细胞质内可见颗粒状棕色阳性染色，见图1B；碱性磷酸酶染色显示阳性，细胞的胞浆中可见蓝色的细小颗粒，见图1C；Von-Kossa染色显示细胞外基质出现黑色团块状钙结节，见图1D；茜素红染色显示呈阳性，镜下观察有结节形成，见图1E。

2.2 软骨细胞的培养及鉴定 采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶联合消化软骨组织后贴壁培养方法培养软骨细胞，可见消化后细胞多为圆形、半透明，细胞核清晰，逐渐贴附于培养瓶底，培养2周后，可见大部分软骨细胞贴壁生长良好，4周后，细胞可生长至融合状态。原代软骨细胞呈圆形、多角形，立方形或三角形等形状，核为圆形或椭圆形。Ⅱ型胶原蛋白免疫组化检测原代培养的细胞胞浆中可见棕色颗粒状阳性染色，见图2A；阿辛蓝染色和甲苯胺蓝染色可见软骨细胞外基质的蛋白多糖呈浅蓝色和蓝色，见图2B，C。

2.3 成骨细胞和软骨细胞共培养模式建立 成功构建了软骨细胞海藻酸钠微珠，软骨细胞转入藻酸盐凝胶三维培养体系，见图3。

培养于凝胶微珠中的软骨细胞形状为圆形或椭圆形，胞体透亮，见图4。

成骨细胞培养成膜状结构，应用多孔插入器对成骨细胞和软骨细胞的共培养，培养液中的可溶性分子可经过多孔插入器进行信息交流，见图5。

2.4 RT-PCR检测不同成骨细胞共培养的软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA水平基因表达差异 骨关节炎软骨下骨成骨细胞共培养的软骨细胞蛋白聚糖表达量(3.04±0.33)×10^-3，Ⅱ型胶原表达量(1.22±0.54)×10^-5；非骨关节炎软骨下骨成骨细胞共培养的软骨细胞蛋白聚糖表达量为(5.36±1.14)×10^-3 ，Ⅱ型胶原表达量(3.75±0.8)×10^-5；非共培养的软骨细胞蛋白聚糖的表达量为(9.38±1.13)×10^-3 ，Ⅱ型胶原的表达量为(23.1±8.5)×10^-5。在成骨细胞共培养的软骨细胞中蛋白聚糖的表达量和Ⅱ型胶原的表达量均低于非共培养的软骨细胞中的表达；在骨关节炎软骨下骨成骨细胞共培养的软骨细胞中的表达明显低于非骨关节炎成骨细胞共培养的软骨细胞中的表达(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。
时间及地点：于2011年3月至2012年4月在上海市第六人民医院中心实验室及上海市电力学院实验室完成。
材料：
组织来源：收集行全膝关节置换的骨关节炎患者5例，创伤性截肢患者3例，均为男性。在征得患者同意后，留取术后遗弃的胫骨平台骨组织。骨关节炎患者软骨部分磨损，软骨下骨硬化，局部软骨缺如，软骨下骨裸露。截肢患者软骨和软骨下结构完整。显微镜辅助下认真检查骨小梁和关节软骨后，区分软骨下骨和软骨。
人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞的共培养实验所需试剂和仪器：
Reagents and instruments required in the co-culture of subchondral osteoblasts and chondrocytes from human knee joint:

实验方法：
成骨细胞分离与培养：仔细解剖骨关节炎和截肢患者的胫骨平台，首先去除软骨组织，从内侧胫骨平台软骨下骨板分离骨小梁组织，用128 U/mL庆大霉素冲洗并浸泡骨块，将骨块剪碎成小片后无血清培养基洗净骨髓，以含Ⅰ型胶原酶的DMEM/F12培养基(1 g/L)覆盖，37 ℃消化20 min，吸弃上清后重复消化20，240 min 2次，无血清培养基或PBS冲洗3遍，消化后的骨片以含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12进行培养，隔天更换培养液，细胞爬出骨片到培养皿后，更换为含有体积分数为10%胎牛血清的培养液培养，4-6周细胞生长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化，用20 μm的细胞筛过滤去除骨片并清洗后，以含10^-8 mol/L 1，25二羟基维生素D3，50 mg/L维生素C，20 mg/L的脯氨酸，体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养，进一步鉴定和后续实验，矿化诱导实验时加入5 mmol/L β-磷酸甘油，培养1周。
软骨细胞分离与培养：取创伤性截肢遗弃的组织标本，标本显示有软骨呈白色，结构完整。2 h内分离表层和中间层软骨组织，避开钙化层，将取出的软骨组织收集在无血清的DMEM培养液中反复清洗，去除组织表面的血液以及误带的滑膜，剪碎成小片，用无血清的DMEM培养液清洗2次，转入无菌试管中，加入0.2% Ⅱ型胶原酶溶液及0.25%胰蛋白酶溶液(4∶1)，置于37 ℃水浴中轻微振荡消化，直至组织块基本消失、溶液变混浊，细胞筛过滤去除碎片，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，DMEM液冼2次，弃上清。细胞加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基(青霉素100 U/mL，链霉素 100 g/L)，混匀计数，锥虫蓝检测证实存活率>95%，将细胞悬液以1×10⁹ L^-1的浓度接种于25 mL培养瓶中，并置于培养箱中，每2 d换液1次培养。
软骨细胞的三维培养：原代软骨细胞与1.2%低黏度的海藻酸钠无菌盐水溶液混合，悬浮浓度4×10⁹ L^-1，通过25 G的针头缓慢滴落到102 mmol/L CaCl₂溶液，微珠瞬间胶凝化后，在CaCl₂溶液中继续聚合10 min，每10个含有软骨细胞的海藻酸钠微珠放入一个1 mm孔径的多孔插入器。软骨细胞在藻酸盐微珠内培养2 d，PBS冲洗后，以DMEM培养基(含1%胰岛素+转铁蛋白+硒(ITSC)，50 g/L维生素C，2 mmol/L脯氨酸，2% Ultroser G，10 mmol/L HEPES，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素)和骨关节炎及非骨关节炎的软骨下骨成骨细胞分别共培养。
免疫组化：细胞爬片PBS冲洗后，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，每片加1滴过氧化酶阻断液，孵育室温下10 min，以PBS冲洗3次，加入1滴正常非免疫动物血清，孵育10 min(室温)。去除血清，PBS冲洗3次，加入第一抗体4 ℃下过夜，PBS洗3次，加入1滴生物素标记的第二抗体，孵育10 min(室温)；PBS冲洗3次；加入1滴链亲和素-过氧化物酶溶液，孵育10 min(室温)，PBS冲洗，加入2滴新鲜配制的AEC和DAB液，显微镜下观察3-10 min，染色满意后，自来水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明后封固。
茜素红染色：爬片的成骨细胞，去除培养液，PBS冲洗，多聚甲醛固定，双蒸水冲洗，每孔加入pH 4.1的 40 mmol/L茜素红1 mL，室温下轻轻振动，抽吸未结合的染料，于显微镜下观察染色情况，双蒸水冲洗，轻轻振荡后倾斜去除过多的水。
碱性磷酸酶染色：细胞爬片PBS冲洗，多聚甲醛固定，PBST冲洗3次后，置爬片于湿盒内，37 ℃碱性磷酸酶染液孵育30 min，PBS冲洗后，显微镜观察。
Von Kossa染色：细胞爬片用40 g/L的多聚甲醛固定30 min，蒸馏水洗3次， 5 min/次。浸于1.5%的硝酸银溶液中，紫外线照射30 min。用去离子水彻底清洗。浸于5%硫代硫酸钠中和2 min。充分水洗，显微镜观察。
阿新蓝(Alcian blue)染色法：配制pH=2.5显示酸性黏多糖和含有硫酸根蛋白多糖染液，阿新蓝(8 GX)1 g+3%醋酸100 mL。去除培养基，用PBS洗涤1遍，体积分数为10%中性甲醛固定，PBS冲洗，阿新蓝(pH=2.5)染 30 min，水洗后脱水、透明、封固。
甲苯胺蓝染色：去除生长良好的第1代骨关节炎患者软骨细胞爬片的培养基，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，弃去多聚甲醛，PBS洗涤3次，1%甲苯胺蓝染色30 min后，PBS冲洗，显微镜下观察。
RT-PCR检测细胞中相关基因的mRNA表达：Trizol裂解细胞，提取总RNA，采用随机引物法将RNA反转录为cDNA。总RNA提取后适当稀释，用紫外分光光度计检测A(260)/A(280)的比值，并定量，RNA浓度(mg/L)= A(260)×40×稀释倍数。1%的琼脂糖凝胶电泳证实RNA的完整性。取2 μg RNA经M-MLV反转录酶系统合成cDNA第一链(20 μL反应总体积)，取反转录产物1 μL cDNA，用20 μL反应体系进行PCR 扩增。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；变性60 ℃ 30 s，退火72 ℃ 1 min，共40个循环；熔解曲线：95 ℃ 0 s→65 ℃ 30 s→95 ℃ 0 s，3-12个基线循环。不同标本，同一基因，基因表达量差异通过ΔCt(靶基因Ct值-内参基因Ct值)来计算，通过2﹣ΔΔCt来计算基因的相对表达量。
定量RT-PCR引物序列：①Ⅱ型胶原：上游：TGC TGC CCA GAT GGC TGG AGG A；下游：TGC CTT GAA ATC CTT GAG GCC C。②蛋白聚糖：上游：AGG AGG TAG TGC TGC TGG；下游：ATG GAA CAC GAT GCC TTT。
主要观察指标：①成骨细胞内Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达。②软骨细胞内Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达。③成骨细胞和软骨细胞三维共培养模型构建情况。④共培养后软骨细胞内Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因表达的变化。
统计学分析：所有数据用SPSS 17.0统计软件处理，结果以x(_)±s表示。两组之间的比较用t 检验，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是以关节软骨退行性变、软骨下骨的硬化为基本病理特征的慢性致残性疾病，是人类最常见的关节疾病，严重威胁着中老年人健康^[14]。相对于骨组织，软骨细胞对软骨的修复和再生能力以及对周围基质的调节能力有限，所以更多的研究集中于软骨细胞的研究^[15]。

研究显示，除了软骨的病变，软骨下骨的重塑是骨关节炎病理过程中一个非常重要的特点^[16-19]。由于骨组织能根据应力负载，较快速改变骨骼的结构和形态^[20-21]，有研究者提出软骨下骨可以先于软骨发生病变^[22-23]。实验研究也显示软骨下骨的生物学代谢异常可以直接导致或促进骨关节炎的发生、发展^[9]。实验通过分离培养人的软骨下骨成骨细胞和软骨细胞，利用软骨细胞的组织工程技术方法模拟体内环境，构建三维共培养模型，旨在探讨骨关节炎软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的影响。

成骨细胞的培养方法较多，早在20世纪60年代，Peck和Birge开始用胶原酶消化骨片，体外培养成骨细胞获得成功；后来又有研究者采用多次胶原酶消化，使培养的成骨细胞得到纯化。本实验采用了多次胶原酶消化后联合贴壁培养的方法^[24]，不仅避免了成纤维细胞等其他细胞的混入，提高了细胞的纯度，还使得活化的成骨细胞爬出骨片后，保留了原来的生物学特性。实验的鉴定结果显示，此方法有效实用，并可获得足够数量的成骨细胞进行下一步研究。成骨细胞生长成单层膜状结构，细胞之间相互连接，分泌类骨基质，相对于分散状态培养更类似于体内结构。

关节软骨细胞在单层培养时容易生长。但在体外培养过程中会发生去分化现象，传代几次后，细胞形态改变，失去其分化表型。如何既能获得高数量的软骨细胞，又能有效地保持软骨细胞良好的分化表型是亟待解决的难题。近年的研究显示，藻酸盐三维软骨细胞培养体系与传统的单层培养(二维培养)相比能较有效地维持培养细胞的分化表型，而被广泛地应用于软骨细胞组织工程和软骨细胞生物学研究^[25-27]。藻酸盐串珠提供了软骨细胞在体内某种程度上十分相似的环境，软骨细胞保持圆形，细胞间的接触也不像在单层培养时那么紧密，软骨细胞胞周形成了细胞外基质的层次结构，细胞与细胞外基质之间的密切关系得到了保存，提供了保持软骨细胞表型的适宜环境^[28]。进一步的研究显示，软骨细胞在藻酸盐凝胶培养3周的时间里能保持良好的分化表型^[29]。

解剖结构上，软骨下骨和软骨之间仅隔一层薄的钙化软骨，钙化软骨具有通透性，为细胞因子、各种酶、基质分子之间的相互交流提供了基础^[30]。骨关节炎患者的软骨下骨，在反复的应力作用下可以形成软骨下骨囊肿、裂隙、新生血管，进一步扩大了他们之间的异常信息的交流途径^[31-33]。作者构建的共培养模型是将形成单层膜状结构的软骨下骨成骨细胞通过多孔插入器与藻酸盐串珠培养的软骨细胞共培养，多孔插入器上有可通透的小孔，成骨细胞分泌的各种可溶性因子可通过小孔和软骨细胞进行信息交流。正常的关节软骨中包含有大量含水的细胞外基质，它由稀疏分布的特殊细胞-软骨细胞合成并维持。基质的主要成分是胶原(大多是Ⅱ型胶原以及少部分其他类型的胶原)和蛋白聚糖(主要是聚集蛋白聚糖)。作者研究显示，骨关节炎相对于非骨关节炎的软骨下骨成骨细胞明显降低了软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的基因表达，也就是说，骨关节炎软骨下骨成骨细胞能促进软骨细胞的退变。

骨关节炎的软骨下骨成骨细胞相对于正常的成骨细胞明显促进了软骨的退变，这可能与骨关节炎的软骨下骨成骨细胞表达的异常的生物学表型有关，其原因仍有待进一步研究和证实^[24]。相关研究显示，骨关节炎的软骨下骨成骨细胞产生异常的成骨标记，如高表达转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1^[34]；还有报道骨关节炎的软骨下骨成骨细胞能产生异常的细胞因子，如白细胞介素1和白细胞介素6，肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶13^[35-36]；进一步的研究显示，骨关节炎的软骨下骨成骨细胞能促进关节软骨细胞中的ERK-1/2活化和p38的失活，促进软骨细胞的退变，推测MAPK/CBFA1通路可能是其中的重要通路^[37]。因此，骨关节炎的软骨下骨成骨细胞生物分子有可能单独或协同的作用于关节软骨细胞，参与调节关节软骨细胞表型改变的诱导。然而这些可溶性因子的作用，以及骨关节炎软骨下骨和软骨间作用的信号传递等具体机制仍需进一步的研究^[38-39]。

软骨细胞移植已在基础研究方面取得了令人瞩目的成果，并在临床应用方面进行了初步尝试，是一项非常有潜力的骨关节炎的治疗措施^[2]。移植入的软骨细胞整合入周围的组织，尤其是软骨下骨，这是软骨移植取得成功的一个关键方面^[40]，因此探索骨关节炎软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的作用及其机制就具有非常重要的作用^[41]。作者研究中证实骨关节炎的软骨下骨成骨细胞能促进软骨细胞的退变，提示着在研究和治疗的过程中可能对骨关节炎和非骨关节炎的软骨下骨需不同对待。由于病例研究数量的限制，尚不能完全排除表型的变化可能存在着个体的差异，但骨关节炎患者的组织标本分离出的细胞更接近于真实病变。从细胞、分子水平阐明软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的作用和影响以及细胞基因、细胞因子等的作用机制，不仅能辅助软骨细胞自体移植的组织工程技术的研究，还可进一步阐明骨关节炎及相关疾病的发病机制和演变过程，对寻找临床预防和治疗骨关节炎相关疾病的新途径，均具有重要的理论和实际意义。

基金资助：国家自然科学基金资助项目(30772182)，2012年度上海市卫生局局级科题项目资助(20124303)。
作者贡献：实验设计为第一作者，实验实施为第一、三、四作者，实验评估为第一和第二作者，资料收集为第三、四作者。第一作者成文，第一、二作者审校，第一、二作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验方案经医院伦理委员会批准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。