类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金表面成骨细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1367-1371.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.007

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金表面成骨细胞的增殖

卜银忠¹，王琳²，冉海琼¹，陈军麟¹，张俊彦³，刘斌¹

1兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730000
2兰州大学第二医院口腔科，甘肃省兰州市 730000
3中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2012-05-17 修回日期:2012-07-04 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 刘斌，博士，教授，兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730000 liubkq@lzu.edu.cn 并列通讯作者：张俊彦，博士，研究员，中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃省兰州市 730000 zhangjunyan@licp.cas.cn
作者简介:卜银忠★，男，1981年生，甘肃省兰州市人，汉族，兰州大学口腔医学院在读硕士，主要从事口腔修复和生物材料学方面的研究。 buyinzhong@163.com

Osteoblast proliferation on the surface of titanium alloy modified by diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film

Bu Yin-zhong¹, Wang Lin², Ran Hai-qiong¹, Chen Jun-lin¹, Zhang Jun-yan³, Liu Bin¹

1 School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
2 Department of Stomatology, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
3 National State Key Laboratory of Solid Lubrication, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2012-05-17 Revised:2012-07-04 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Liu Bin, Doctor, Professor, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China liubkq@lzu.edu.cn Zhang Jun-yan, Doctor, Investigator, National State Key Laboratory of Solid Lubrication, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China zhangjunyan@licp.cas.cn
About author:Bu Yin-zhong★, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China buyinzhong@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：钛合金表面沉积类金刚石薄膜可提高其摩擦和抗腐蚀性能，但缺乏生物活性，在其表面接枝生物蛋白分子是一种新的生物化学改性途径。
目的：观察成骨细胞在类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金表面的增殖与黏附。
方法：采用非平衡磁控溅射和多步组装方法在钛合金表面制备类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜。将对数生长期的成骨细胞悬液接种于类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰的钛合金与纯钛合金试件上。
结果与结论：类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金组细胞增殖率和黏附数量高于纯钛合金组(P < 0.05)。扫描电镜显示，类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金组成骨细胞胞体显著增大，表面粗糙，边界模糊不清，细胞呈充分的铺展状态；纯钛合金组成骨细胞胞体光滑，边界线条锐利清晰，伸展不良。表明类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜可促进钛合金表面成骨细胞的增殖与黏附。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 组织工程口腔材料, 类金刚石薄膜, 钛合金, 酪蛋白磷酸肽, 成骨细胞, 增殖, 黏附, 国家自然科学基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Titanium alloy surface modification with diamond-like carbon film can improve the friction and corrosion resistance of titanium alloy, but it is lack of biological activity. So fixing biological protein molecules on the diamond-like carbon surface is a kind of new biological chemical modification method.
OBJECTIVE: To observe the proliferation and adhesion of osteoblasts on the titanium alloy surface modification with diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film.
METHODS: Using unbalanced magnetron sputtering and multi-step assembly method diamond-like carbon/ casein phosphopeptide composite film was prepared on titanium alloy surface. The osteoblast suspension at logarithmic growth phase was seeded on the titanium alloy surface modified with or without the diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the titanium alloy without modification, the adhesion and proliferation of osteoblasts were significantly increased after modification by diamond-like carbon /casein phosphopeptide composite film (P < 0.05). The scanning electron microscope showed the osteoblast body on the surface of titanium alloy increased significantly, presenting with rough surface, fuzzy boundaries, and fully stretched after modification by diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film, but the osteoblasts on the surface of titanium alloy without modification displayed smooth surface, clear boundary, not fully stretched. It is indicated that the prepared diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film can significantly increase the biological activity of titanium alloy.

Key words: biomaterials, tissue engineering bone materials, tissue engineering oral materials, diamond-like carbon film, titanium alloy, casein phosphopeptides, osteoblasts, proliferation, adhesion, the National Natural Science Foundation of China, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

卜银忠，王琳，冉海琼，陈军麟，张俊彦，刘斌. 类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金表面成骨细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1367-1371.

Bu Yin-zhong, Wang Lin, Ran Hai-qiong, Chen Jun-lin, Zhang Jun-yan, Liu Bin. Osteoblast proliferation on the surface of titanium alloy modified by diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1367-1371.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Mändl S,Sader R,Thorwarth G,et al.Investigation on plasma immersion ion implantation treated medical implants .Biomol Eng.2002;19 (2-6):129-132.

[2] Ratner BD,Hoffman AS,Schoen FJ,et al. Biomaterials Science. An Introduction to Materials in Medicine. San Diego, Calif: Academic Press, 1996:335.

[3] Goodman SB,Song Y,Yoo JY,et al. Local infusion of FGF-2 enhances bone ingrowth in rabbit chambers in the presence of polyethylene particles. J Biomed Mater Res A. 2003;65(4): 454-461.

[4] Kobayashi A,Bonfield W,Kadoya Y,et al.The size and shape of particulate polyethylene wear debris in total joint replacements.Proc Inst Mech Eng H. 1997;211(1):11-15.

[5] Dearnaley G, Arps JH. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: a review. Surf Coat Technol. 2005;200(7): 2518-2524.

[6] Vanhulsel A,Velasco F,Jacobs R,et al.DLC solid lubricant coatings on ball bearings for space applications. Tribol Int.2007;40(7): 1186-1194.

[7] Podgornik B,Vizintin J.Tribologically activated surface layers in lubricated DLC contacts.Surf Interface Anal.2008;40(3-4): 867-870.

[8] Allen M,Myer B,Rushton N.In vitro and In vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. J Biomed Mater Res. 2001;58(3): 319-328.

[9] Jiang SW,Yin GF,Zheng CQ,et al. Mocha Xuebao. 2001; 21(3): 167-171. 蒋书文,尹光福,郑昌琼,等. 钛合金表面类金刚石碳梯度薄膜的摩擦磨损性能研究[J]. 摩擦学报,2001,21(3): 167-171.

[10] Zhang Li, Yin GF,Zheng CQ,et al.Gongneng Cailiao. 2003; 34 (3): 278-280. 张利, 尹光福, 郑昌琼,等. 钛合金基类金刚石梯度薄膜的生物摩擦学性能评价[J]. 功能材料, 2003,34 (3): 278-280.

[11] Choy KL, Felix E. Functionallygradeddiamond- likecarboncoatings on metallic substrates.Mat Sci Eng A. 2000;278 (1-2): 162-169.

[12] Lu L, Jones MW, Wu RL. Diamond-like carbon as biological compatible material for cell culture and medical application. Biomed Mater Eng. 1993;3(4): 223-228.

[13] Nakamura T, Ohana T,Suzuki M,et al.Chemical modification of DLC films with perfluorooctyl functionality. Diamond Relat Mater. 2005;14 (3-7): 1019-1022.

[14] Hauert R.A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond Relat Mater. 2003;12(3-7): 583-589.

[15] Nakamura T,Ohana T,Suzuki M,et al.Surface modification of diamond-like carbon films with perfluorooctyl functionalities and their surface properties. Surf Sci. 2005;580(1-3): 101-106.

[16] Jones MI,McColl IR,Grant DM,et al.Protein adsorption and platelet attachment and activation, on TiN, TiC, and DLC coatings on titanium for cardiovascular applications. J Biomed Mater Res.2000;52(2): 413-421.

[17] Choi J,Ishida T,Kato T,et al.Self-assembled monolayer on diamond-like carbon surface: formation and friction measurements. Tribol Int. 2003;36 (4): 285-290.

[18] Wu XM,Itoh N,Taniguchi T,et al. Requirement of calcium and phosphate ions in expression of sodium-dependent vitamin C transporter 2 and osteopontin in MC3T3-E1 osteoblastic cells. Biochim Biophys Acta. 2003; 1641(1): 65-70.

[19] Zhuo LL, Zhang CL, Gu JH,et al. Zhongguo Shouyi Xuebao. 2009; 29(6): 769-773. 卓丽玲,张春岭,顾建红,等. 钙对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化及细胞周期的影响[J].中国兽医学报,2009,29(6): 769-773.

[20] Gu WW, Pei YY. Zhongguo Linchuang Yaoxue Zazhi. 2000; 9(1): 58-60. 顾王文, 裴元英. 酪蛋白磷酸肽促钙吸收的作用及研究概况[J].中国临床药学杂志,2000,9(1): 58-60.

[21] Hansen M,Sandstrom B,Jensen M,et al. Effect of casein phosphopeptides on zinc and calcium absorption from bread meals. Trace Elem Med Biol.1997; 11 (3): 143-149.

[22] Matsui T,Yano H, Awano T,et al.The influences of casein phosphopeptides on metabolism of ectopic bone induced by decalcified bone matrix implantation in rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 1994; 40(2): 137-145.

[23] Ciapetti G,Cenni E,Pratelli L,et al.Invitro evaluation of cell biomaterial interaction by MTT assay. Biomaterials. 1993; 14(5): 359-364.

引言

材料方法

设计：体外生物学分析。
时间及地点：于2010年12月至2011年6月在中国科学院兰州化学物理研究所和兰州大学口腔医学院完成。
材料：Ti-6Al-4V薄片购自西北有色金属有限公司。酪蛋白磷酸肽购自Biotech公司。鼠成骨细胞MC3T3-E1购于解放军第四军医大学。
主要试剂与仪器：Tris、多巴胺(Acros Organics)；戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)；EDC、MES(上海生工生物工程技术服务有限公司)；NHS(国药集团化学试剂有限公司)；MTT(Sigma公司)；等离子体表面处理仪(Plasma- Surface-Technology, FEMTO, Germany)；酶联免疫检测仪(Bio-Rad, Model 550, USA)；荧光显微镜(OLYMPUS, BX51)；扫描电镜(SEM, JEOL, 5600 LV, Japan)。
实验方法：
实验分组：将钛合金试样随机分为2组：纯钛合金组(对照组)和类金刚石/酪蛋白磷酸肽组(实验组)。以上样品均在无菌操作台里用体积分数70%乙醇冲洗和紫外光照射30 min后用于细胞实验。
在实验组钛合金表面制备类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜：钛合金片经600^#-2 000^#CRR/R的金相砂纸依次打磨、机械抛光后依次放入去离子水、丙酮、无水乙醇和去离子水中分别超声清洗20 min，氮气吹干后备用。将钛合金基片放入非平衡磁控溅射镀膜系统真空腔内，薄膜沉积前首先将真空腔抽到10^-4 Pa，然后通入Ar在偏压400 V下将钛合金基片刻蚀 0.5 h。接着调整偏压到800 V，Ar流量为70 sccm镀钛过渡层 15 min，随后引入反应气体甲烷(流量为200 sccm)沉积类金刚石薄膜40 min；将得到的样品利用等离子体表面处理仪对其进行表面羟基化处理10 min得到亲水的表面。在培养皿中导入40 mL制备好的Tris-HCl缓冲溶液，称量80 mg多巴胺加入上述溶液中，放入磁子将培养皿放在磁力搅拌器上搅拌使多巴胺完全溶解，然后将表面沉积了类金刚石薄膜的钛合金片放入该溶液中，继续搅拌6 h后将钛合金片取出，放入去离子水中超声1 min，然后用大量去离子水冲洗，氮气吹干后备用；将酪蛋白磷酸肽、EDC(20 mmol/L)、NHS(50 mmol/L)加入到0.1 mol/L的MES中，配制成10 mg/L的酪蛋白磷酸肽溶液，将上述样品浸入此溶液中，室温下静置过夜后用PBS(pH=7.4)冲洗，真空干燥后备用。
细胞培养：将鼠成骨细胞MC3T3-E1培养在体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养液中。在体积分数5%CO₂、37 ℃及饱和湿度环境下培养传代，选择处于对数生长期且贴壁良好的健康细胞，用0.25%胰蛋白酶消化分散在新鲜配制的培养基中配成2×10⁷ L^-1单细胞悬液用于下述实验。
细胞活性及增殖：分别将两组钛合金样品置于24孔板内，每孔加入浓度为2×10⁷L^-1的细胞悬液1 mL。培养1，2，4 d后，每孔加5 g/L MTT液100 μL，37 ℃下继续孵育4 h后终止培养。之后小心吸弃孔内培养上清液，每孔加750 μL DMSO，振荡10 min，待结晶物充分溶解后，每孔吸取150 μL转入96孔板中，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)。以时间为横坐标、细胞增殖率为纵坐标绘制柱状图。
细胞黏附：细胞接种及培养方法同上，接种细胞浓度为2×10⁷ L^-1。培养6 h后取出样品，表面用PBS反复冲洗以去除未黏附的细胞。然后将黏附了细胞的样品置于新的24孔培养板中每孔加0.25%的胰蛋白酶0.3 mL充分消化样品表面黏附的细胞后，每孔再加入0.7 mL的培养基以终止消化。轻柔反复吹打样品表面制成细胞悬液，在倒置显微镜下用细胞计数器进行细胞计数，每个样品重复3次，取其平均值。每个实验组含3个平行试样，设不加样品的细胞组为阴性对照组。
细胞接种及培养方法同上，接种细胞浓度2×10⁷ L^-1。培养24 h后，弃上清液，无水乙醇脱水10 min，PBS浸润2.0-3.0 min，加吖啶橙染色剂染色3 min后吸除染色剂，加入CaCl2溶液固色30 s，在荧光显微镜下观察。
细胞形态学观察：细胞接种及培养方法同上，接种浓度为2×10⁷ L^-1。培养48 h后，弃上清液，PBS漂洗，加3%戊二醛溶液固定，4 ℃下过夜。加1%锇酸，在4 ℃下固定1 h。PBS漂洗，系列梯度乙醇脱水。经临界点干燥法干燥后表面喷金，扫描电镜观察。
主要观察指标：成骨细胞在不同钛合金表面的增殖及黏附情况。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计分析软件对所有数据结果进行两样本均数t 检验分析。统计学处理由第一作者完成。

讨论

成骨细胞在材料表面的增殖活性是判断植入体材料生物活性优劣的重要指标之一^[23]。实验细胞增殖实验说明在钛合金表面制备的类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜对成骨细胞的生长增殖具有显著促进作用。表现在成骨细胞与其接触早期就表现出较强的增殖活性，并随着培养时间的延长这种促进作用更为明显。这是由于酪蛋白磷酸肽导致的高钙浓度对使细胞迁移产生动力的肌动蛋白丝产生了协同作用，加快了细胞迁移，从而促进了细胞增殖。

植入体与骨组织的早期愈合和性能稳定是保证种植成功的先决条件，为了使植入体早期愈合和获得良好的稳定性，钛合金植入体表面早期应有大量成骨细胞附着。成骨细胞早期黏附实验说明虽然在钛合金与成骨细胞接触早期就有细胞附着，然而细胞黏附数量少且发生了团簇。而在钛合金表面制备了类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜后显著提高了成骨细胞的早期黏附，说明酪蛋白磷酸肽形成的高钙浓度会促进成骨细胞黏附的增加。细胞计数法与荧光染色法测得的结果是一致的。

材料表面成骨细胞的生长形态可以间接反映细胞的生长状态和成骨行为，由此可判断细胞在成骨过程中所处的阶段。通过对样品表面成骨细胞形态的观察，可以看到成骨细胞在不同钛合金样品表面均可黏附生长。但在制备了类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜的钛合金表面生长分化活动表现的更为活跃，细胞胞体显著增大，呈充分铺展状态，边缘模糊，边界不清，出现了板状伪足和细胞间桥。细胞表面变得粗糙，毛刺状突起显著增多，以及细胞间桥，这些就是细胞肌动蛋白丝，它的出现反映了成骨细胞活跃的分泌活动和迁移趋势。因此，进一步证明钛合金表面经类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰后增强了成骨细胞的功能，表现出优异的生物活性。

致谢：感谢中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室王富国助理研究员、张斌助理研究员等对本实验研究给予的支持和帮助。
基金资助：国家自然科学基金项目(50823008)；中央高校基本科研业务费专项资金自由探索面上项目(lzujbky-2011-96)。
作者贡献：第一、六作者进行实验设计，实验实施为第一、二作者，实验评估为第四作者，资料收集为第一、二、三作者，第一作者成文，第五、六作者审校，第一、六作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

类金刚石/酪蛋白磷酸肽复合薄膜修饰钛合金表面成骨细胞的增殖

Osteoblast proliferation on the surface of titanium alloy modified by diamond-like carbon/casein phosphopeptide composite film

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[3]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[4]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[5]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[6]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[7]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[8]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[9]	石晓岫, 毛世龙, 刘洋, 马幸双, 罗彦凤. 钽与钛(合金)骨科材料的差异比较：理化指标及抗菌和成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 593-599.
[10]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[11]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[12]	刘珂珂, 段昕, 马向瑞, 张云涛. 以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3500-3504.
[13]	何林, 吴稀, 何淞, 杨森. 经聚多巴胺涂层的羟基磷灰石生物陶瓷具有亲水性与细胞黏附性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3540-3544.
[14]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[15]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.