骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1331-1520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.001

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骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

徐晓峰¹，陈琛²，陈海宁²，陈亮²，张志坚²

1江苏大学附属医院骨科，江苏省镇江市 212001
2江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏省镇江市 212013

收稿日期:2012-04-29 修回日期:2012-06-11 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 徐晓峰，主任医师，江苏大学附属医院骨科，江苏省镇江市 212001
作者简介:徐晓峰，男，1962年生，江苏省南通市人，汉族，1983年南通医学院毕业，主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事骨组织工程方面的研究。 13775534791@163.com

In vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells on bone morphogenetic protein-2/injectable calcium sulfate carrier

Xu Xiao-feng¹, Chen Chen², Chen Hai-ning², Chen Liang², Zhang Zhi-jian²

1 Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 2120001, Jiangsu Province, China
2 School of Basic Medicine and Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China

Received:2012-04-29 Revised:2012-06-11 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Xu Xiao-feng, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 2120001, Jiangsu Province, China 13775534791@163.com
About author:Xu Xiao-feng, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 2120001, Jiangsu Province, China 13775534791@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：将生长因子复合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。
目的：观察骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。
方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液，分3组培养：实验组将细胞悬液滴加到骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合材料表面，对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2，空白对照组正常培养。
结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多，实验组细胞数量最多，明显多于对照组及空白对照组(P < 0.05)。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组(P < 0.05)。体外实验显示骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 骨形态发生蛋白2, 注射式硫酸钙, 大鼠骨髓间充质干细胞, 碱性磷酸酶, 其他基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Composite material of growth factor and scaffolds has the function of bone induction and conduction.
OBJECTIVE: To observe the effect of bone morphogenetic protein-2/injectable calcium sulfate carrier on the in vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The second generation of bone marrow mesenchymal stem cells suspension in good growth state was collected from Sprague Dawley rats, and then divided into three groups. In the experimental group, the cells suspension was dropped on the surface of bone morphogenetic protein-2/injectable calcium sulfate composite; in the control group, bone morphogenetic protein-2 was injected into the cells suspension; cells in the blank control group were cultured normally.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of the cells in three groups was increased with the prolonging of the incubation time, and the number of the cells in the experimental group was significantly larger than that in the control group and the blank control group (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity at different culturing time points in the experimental group was higher than that in the control group and the blank control group (P < 0.05). In vitro experiment results showed that bone morphogenetic protein-2/injectable calcium sulfate carrier can promote the in vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: biomaterials, tissue engineering bone materials, bone morphogenetic protein 2, injectable calcium sulfate, rat bone marrow mesenchymal stem cells, alkaline phosphatase, other grants-supported paper, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

徐晓峰，陈琛，陈海宁，陈亮，张志坚. 骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1331-1520.

Xu Xiao-feng, Chen Chen, Chen Hai-ning, Chen Liang, Zhang Zhi-jian. In vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells on bone morphogenetic protein-2/injectable calcium sulfate carrier[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1331-1520.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞培养及成骨诱导结果 见图1。

培养 48 h后，可见有少量贴壁细胞，多为梭形或成纤维细胞样，细胞形态幼小、细短，少数细胞呈扁平多角不规则形态。7 d左右细胞可长满瓶底，细胞间排列紧密，呈均匀一致的长梭形。各组培养3 d后，3组细胞的形态和数量发生明显变化。实验组细胞数量明显多于对照组和空白对照组，空白对照组最少，细胞呈多角形，细胞两端有长丝状伪足。各组培养10 d后细胞的形态变化，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞表型鉴定结果 免疫组织化学染色显示骨髓间充质干细胞CD44有阳性表达，阳性细胞表现为胞浆呈棕色至棕褐色，细胞核周围最明显；CD34表达阴性，证实培养的细胞为骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3 各组细胞计数 3组细胞随培养时间延长逐渐增多，且相同时间点实验组数量最多(P < 0.05)，对照组次之，空白对照组最少，见表1。

2.4 各组细胞碱性磷酸酶活性测定结果 相同时间点实验组碱性磷酸酶表达量最高(P < 0.05)，对照组次之，空白对照组最少，见图3。

2.5 各组细胞成骨细胞表型检测结果 大鼠骨髓间充质干细胞经诱导培养7 d后，空白对照组碱性磷酸酶细胞化学染色为阴性，实验组和对照组为阳性。14 d后空白对照组钙结节染色，冯库萨染色均为阴性，对照组和实验组均呈强阳性，其中实验组碱性磷酸酶染色后可见胞质中棕黄色颗粒，对照组细胞分散，融合较少。实验组钙结节染色细胞间可见大块细胞融合形成的大块红色钙结节，对照组只见少量零散小块红色钙结节。实验组冯库萨染色细胞间可见大块细胞融合形成的黑色钙沉积，对照组只见少量零散小块黑色钙沉积，见图4。

参考文献

[1] Fab W,Wang D.Zhongguo Yaowu yu Linchuang. 2007;7(8): 620-622. 范伟,王东.骨形态发生蛋白缓释载体的研究进展[J].中国药物与临床,2007,7(8):620-622.

[2] Urist MR,Kovacs S,Yates KA.Regeneration of an enchondroma defect under the influence of an implant of human bone m orphogenetic protein. J Hand Surg Am.1986; 11(3):417-419.

[3] Kawamura M,Urist MR.Human fibrin is a physiologic delivery system for bone morphogenetic protein. Clin Orthop Relat Res.1988;(235): 302.

[4] Xu XF,Liu XP,Wang MW,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(25):4636-4640. 徐晓峰,刘小平,王明伟,等.血管内皮生长因子-纳米晶胶原基骨缓释系统与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(25):4636-4640.

[5] Ozeki N,Jethanandani P,Nakamura H,et al.Modulation of satellite cell adhesion and motility following BMP2-induced differentiation to osteoblast lineage. Biochem Biophys Res Commun. 2007;353(1):54-59.

[6] Xue JF,Zeng BF.Guowai Yixue:Gukexue Fence. 2004;25(3): 171-172. 薛剑锋,曾柄芳.可注射硫酸钙制剂治疗骨缺损[J].国外医学:骨科学分册,2004,25(3):171-172.

[7] Xu XF,Xu CZ,Ma P,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(16):3052-3057. 徐晓峰,徐成振,马鹏,等.细胞支架与骨形态发生蛋白及血管内皮生长因子复合修复大鼠股骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(16):3052-3057.

[8] Xu XF,Liu XP,Chen JJ,et al.Zhongguo Shengwu Yixue Gongcheng Xuebao. 2010;29(5):741-746. 徐晓峰,刘小平, 陈静家,等. 纳米晶胶原基骨/血管内皮生长因子缓释支架对人骨髓间充质干细胞体外粘附增殖的影响[J].中国生物医学工程学报,2010,29(5):741-746.

[9] Tessmar JK,Göpferich AM. Matrices and scaffolds for,protein delivery in tissue engineering.Adv Drug Deliv Rev.2007; 59(4-5): 274-291.

[10] Qian D,Ma P,Li Y,et al.Jiangsu Daxue Xuebao. 2009;19(2): 118-120. 钱栋,马鹏, 李阳,等. 骨形成蛋白-2结合纤维连接蛋白体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的观察[J].江苏大学学报, 2009,19(2):118-120.

[11] Winn SR,Hollinger JO.An osteogenic cell culture system to evaluate the cytocompatibility of Osteoset, a calcium sulfate bone void filler. Biomaterials. 2000;21 (23):2413-2425.

[12] Chen H,Tang PF,Liang XS,et al.Zhongguo Jiaoxing Waike Zazhi.2008;16(10): 728-730. 陈华,唐佩福,梁向党,等.Osteoset 人工骨加内固定治疗跟骨骨折疗效分析[J]. 中国矫形外科杂志,2008, 16(10): 728-730.

[13] Intini G,Andreana S,Margarone JE 3rd,et al.Engineering a bioactive matrix by modifications of calcium sulfate. Tissue Eng.2002;8(6): 997-1008.

[14] Thomas MV,Puleo DA,Al-Sabbagh M.Calcium sulfate: a review. J Long Term Eff Med Implants. 2005;15(6): 599-607.

[15] Thomas MV,Puleo DA.Calcium sulfate: Properties and clinical applications. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009; 88(2): 597-610.

[16] Peltier LF.The use of plaster of Paris to fill defects in bone.Clin Orthop.1961;21:1-3.

[17] Mao KY,Li YT,Yang Y,et al.Shengwu Yixue Gongcheng yu Linchuang. 2011;15(3):205-209. 毛克亚,李云涛, 杨云,等.β-TCP/α-CSH 复合植骨材料的制备与理化性能检测[J].生物医学工程与临床,2011,15(3):205-209.

[18] Chen JM,Liu FG,Jin DD. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2007;11(26):5078-5081. 陈建民,刘方刚,金大地.硫酸钙人工骨结构特征与其理化性能的关系[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(26):5078- 5081.

引言

材料方法

设计：完全随机分组设计，对比观察实验。
时间及地点：于2010年6月至2011年6月在江苏大学基础医学实验室完成。
材料：
实验动物：6周龄健康雄性SD大鼠，体质量约150 g，由江苏大学动物实验中心提供，动物使用许可证：SCXK(苏)2002-0045。
试剂与仪器：
Reagents and instruments:

实验方法：
SD大鼠骨髓间充质干细胞的获得与培养：颈椎脱臼处死SD大鼠，无菌条件下取其股骨、胫骨，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，冲出骨髓，淋巴细胞分离液分离后，常规传代培养^[4]。
骨髓间充质干细胞的表型鉴定：取P3生长状态良好的细胞，制成细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗，0.1%Triton-100通透，过氧化氢消除内源性过氧化物酶，加5% BSA，加一抗(兔抗大鼠CD44、CD34)，同时用PBS作为一抗设置阴性对照，37 ℃孵育1 h，加生物素化二抗，加SABC，DAB显色，苏木精染色，脱水、封固、显微镜下观察。
骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙的制备：按照说明书，将固相硫酸钙粉剂天平称质量4 g，用无菌注射器抽取按固液相配比1∶0.4的硫酸钙溶剂，加入骨形态发生蛋白2(100 mg/L)，然后将固相粉剂加入含有骨形态发生蛋白2的混合溶剂中，均匀搅拌1 min，初步固化后注入自制模具(5 mm×5mm×5 mm)内，用2 kg砝码加压驱赶残存的空气，约3 min后，小心顶出样条，将其置于37 ℃恒温箱内继续固化5 min，固化过程中峰值温度为32 ℃。经细砂纸打磨，将已制备的骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙置于4 ℃冰箱中保存备用。上述操作严格按照无菌要求。
细胞接种：0.25%胰酶消化生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞制成的细胞悬液，5×10⁹ L^-1吸取100 μL分别滴加到已置入24孔板的骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙材料表面，37 ℃，体积分数5% CO2饱和湿度放置2 h后，反转材料，向该材料另一面滴加100 μL细胞悬液作为实验组，同时在其他细胞培养孔中滴加200 μL细胞悬液并加入等量骨形态发生蛋白2 (100 mg/L)作为对照组；单纯骨髓间充质干细胞作为空白对照组，37 ℃，体积分数5% CO₂饱和湿度静置培养。
细胞计数：3组诱导培养第3，7，10，14天时，每组各取样本3片，PBS洗涤3遍，0.25%胰酶消化细胞，反复吹打培养板后加入等量含10%PBS的培养基终止消化，取出培养板，培养液离心，制悬，计数。
碱性磷酸酶活性测定：上述计数后的细胞悬液，在冰浴中用超声细胞破碎机处理5次，6 s/次，共30 s，然后 1 000 r/min离心5 min，取上清液，按碱性磷酸酶试剂盒介绍的方法算出碱性磷酸酶活性。
成骨细胞表型鉴定：24孔板内各组大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养7 d后，行碱性磷酸酶细胞化学染色，14 d后行冯库萨染色、矿化沉积钙结节染色。
主要观察指标：各组细胞计数、碱性磷酸酶活性及成骨细胞表型鉴定结果。
统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 11.5统计软件中的方差分析进行统计学处理，若有差异显著性再采用SNK-q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，临床上修复骨缺损使用的自体骨、异体骨、人工骨虽有较好的生物相容性和生物活性，但因自体骨来源有限，异体骨有一定排斥反应^[5]，人工骨来源充足，但在生物活性及可降解性方面存在缺陷，超过临界点的节段性骨缺损单纯植入骨植入材料难以达到有效治疗效果。兼备骨诱导及传导效应的人工骨无法应用于微创治疗，从而限制了其广泛应用。将种子细胞种植于生长因子、支架材料上构建组织工程骨可较好解决上述问题^[6]。徐晓峰等^[7]将骨髓间充质干细胞种植于骨形态发生蛋白及血管内皮生长因子/纳米羟基磷灰石支架构建组织工程骨成功修复了大鼠股骨缺损。骨形态发生蛋白2属于转化生长因子B超家族成员，是目前已知具有最强异位诱导成骨能力的细胞因子，但骨形态发生蛋白在局部组织中迅速随体液扩散稀释或酶解吸收，难以在新骨形成的全过程中充分发挥其诱导成骨作用。外源性骨形态发生蛋白存在稳定性差，生物半衰期短等不足，影响了其临床应用效果。将生长因子负载于合适的支架材料中，达到释放与组织再生同步目的，已成为组织工程学的重要研究内容^[8-10]。
硫酸钙作为骨移植替代物在临床上应用已经有100多年的历史^[11-15]。实验采用的是FDA批准的美国Wright医疗技术公司研发的注射式硫酸钙，它由特制硫酸钙粉剂和相应的溶剂组成，使用时配置成糊状，固化温度不高于33 ℃，固化后机械强度与松质骨相当。Peltie^[16]指出硫酸钙最大的优点是在人体内降解吸收率接近于骨缺损区内新骨的形成率。在以往构建生长因子/载体复合支架的基础上利用硫酸钙的物理特性，将注射型硫酸钙与骨形态发生蛋白2制成复合载体系统，观察骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙复合载体对骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向转化的影响。实验培养的细胞表型鉴定为CD44阳性，CD34阴性，说明培养扩增的细胞为骨髓间充质干细胞。体外实验发现在平面环境下骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙复合载体对骨髓间充质干细胞的诱导成骨优于单纯骨形态发生蛋白2。实验组细胞形态由长梭形变成多角形，胞体和胞核增大，且骨髓间充质干细胞发生成骨分化的时间更短。实验组细胞数量和碱性磷酸酶活性表达明显优于对照组和空白对照组，可见大块钙结节沉积，表现出明显的成骨效应。反映了骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙与骨髓间充质干细胞有较好的生物相容性，较好地保留了生长因子的生物活性，能够明显诱导骨髓间充质干细胞成团向成骨细胞分化。

作者推测实验组优于对照组及空白对照组的机制可能在于注射型硫酸钙固化后在其原料颗粒表面可见一些微孔形成^[17-18]。微孔结构有利于骨形态发生蛋白2的复合和成骨细胞的黏附和增殖。骨形态发生蛋白2是可溶于水的，但分子量大。骨形态发生蛋白2与注射型硫酸钙复合时，骨形态发生蛋白2被包裹在硫酸钙内，大分子骨形态发生蛋白2不能从注射型硫酸钙的空隙中游离，随着注射型硫酸钙的降解逐渐释放出，持续发挥其生物学效应。注射型硫酸钙的缓慢降解吸收所形成的弱酸性环境及无机盐能减弱破骨细胞的活性，从而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，加速新骨的形成。骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙复合载体同时发挥了骨传导和诱导成骨作用。

实验为微创治疗骨缺损提供了一种新途径，可同时具备骨诱导和骨传导作用。由于实验是体外观察骨形态发生蛋白2/注射型硫酸钙载体对骨髓间充质干细胞的生物相容性及诱导成骨影响，对于在体内环境中该载体如何发挥其作用还需要进一步的实验研究。

致谢：感谢江苏大学基础医学及医学技术学院周月鹏提供相应技术性帮助。
基金资助：镇江市社会发展基金资助项目(SH2002019)，课题名称：骨髓间质干细胞体外扩增回植对骨缺损的作用。
作者贡献：由第一、二作者进行实验设计，第二作者参与实验的实施，全部作者参与实验结果的评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[4]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[5]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[6]	魏琴, 张雪, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 贾麒钰, 马创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.
[7]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.
[8]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[9]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[10]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[11]	罗诒财, 李昊. 增强芳香烃受体表达对糖尿病模型大鼠牙槽骨缺损区愈合及炎症反应的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2166-2171.
[12]	刘治军, 刘少津, 魏合伟, 万雷, 黄宏兴, 乔荣勤. 补肾健脾活血方干预去势大鼠肌肉骨骼转化生长因子β/骨形态发生蛋白2信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2219-2223.
[13]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[14]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[15]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.