微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1168-1173.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.006

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微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定

宁斌¹，丁远景¹，龚维明¹，刘海飞²，刘勇²，王德春²，胡有谷²

1山东大学附属济南市中心医院脊柱外科，山东省济南市 250013
2山东省创伤骨科研究所，山东省青岛市 266001

收稿日期:2012-07-28 修回日期:2012-09-11 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 胡有谷，教授，硕士生导师，山东省创伤骨科研究所，山东省青岛市 266001 huyougu@hotmail.com
作者简介:宁斌☆，男，1979年生，山东省章丘市人，汉族，山东大学博士，主治医师，主要从事脊柱疾患的研究。 ningbin@mail.sdu.edu.cn

Adult degenerative nucleus pulpous cells cultured by a microcarrier-based stirred culture system

Ning Bin¹, Ding Yuan-jing¹, Gong Wei-ming¹, Liu Hai-fei², Liu Yong², Wang De-chun², Hu You-gu²

1 Department of Spinal Surgery, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong Universtiy, Jinan 250013, Shandong Province, China
2 Orthopedic Research Institute of Shandong Province, Qingdao 277018, Shandong Province, China

Received:2012-07-28 Revised:2012-09-11 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Hu You-gu, Professor, Master’s supervisor, Orthopedic Research Institute of Shandong Province, Qingdao 277018, Shandong Province, China huyougu@hotmail.com
About author:Ning Bin☆, Doctor, Attending physician, Department of Spinal Surgery, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong Universtiy, Jinan 250013, Shandong Province, China ningbin@mail.sdu.edu.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：旋转生物反应器是目前应用较多的微载体培养系统。
目的：应用微载体旋转立体培养方法对成人退变髓核细胞进行扩增及鉴定。
方法：对手术切除的髓核组织进行原代培养，传代后进行单层培养和微载体旋转立体培养的对比，并行苏木精-伊红、Gimsa染色观察细胞形态，利用电镜观察其超微结构，利用MTT比色法检测细胞生长活性。
结果与结论：倒置相差显微镜观察培养的细胞符合退变髓核细胞形态，透射电镜下可显示其退变改变。倒置相差显微镜和扫描电镜下观察，可见退变的髓核细胞呈立体状生长，并能够成功甩珠传代。细胞在对数生长期时，微载体培养的细胞的生长活性明显高于单层培养组的细胞。表明微载体旋转立体培养法可以较好的维持细胞表型，对对数生长期髓核细胞的细胞活性具有明显的刺激作用。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 髓核细胞, 退变, 微载体, 细胞培养, 细胞鉴定, 立体培养, 单层培养, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Rotating bioreactor is a microcarrier-based stirred culture system that is currently used more often.
OBJECTIVE: To culture the adult degenerative nucleus pulposus cells in vitro by a microcarrier-based stirred culture system, and then to amplify and identify the cells.
METHODS: Nucleus pulposus specimens taken from patients with disc degenerative diseases were randomly divided into monolayer culture group and micro-carrier culture group. The cell morphology was observed by hematoxylin-eosin staining and Gimsa staining, the microstructure was observed under an electron microscope, cell viability was detected by MTT method.
RESULTS AND CONCLUSION: The morphology of degenerative nucleus pulpous cells was identified by inverted phase contrast microscope, and the regression was showed by a transmission electron microscope. The microcarrier cultured cells were observed by an inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope showing stereoscopic shape. In the logarithmic growth phase, the growth activity of microcarrier culture cells was significantly higher than that of the cells in monolayer culture. Microcarrier-based stirred culture system can stabilize the cell phenotype, and significantly stimulate the cellular activity of nucleus pulposus cells in the logarithmic growth phase.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, nucleus pulpous cells, degeneration, microcarriers, cell culture, cell identification, three-dimensional culture, mondayer culture, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

宁斌，丁远景，龚维明，刘海飞，刘勇，王德春，胡有谷. 微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1168-1173.

Ning Bin, Ding Yuan-jing, Gong Wei-ming, Liu Hai-fei, Liu Yong, Wang De-chun, Hu You-gu. Adult degenerative nucleus pulpous cells cultured by a microcarrier-based stirred culture system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1168-1173.

图/表（结果） 4

2.1 退变髓核细胞单层培养细胞形态

光镜下：单层原代退变髓核细胞接种时细胞悬浮生长时为圆形，细胞大小不等，轮廓较清，可见胞核。初贴壁时呈多角形、梭形或纺锤形，并伸出较短伪足，其随着细胞生长逐渐伸长，呈狭长分布。进入对数生长期细胞增殖、融合相对活跃，较少见漩涡状或火焰状的细胞团块，可见胞核略大，呈椭圆、梭形或多角形的类软骨样细胞，见图1。

电镜下：透射电镜观察细胞呈梭形或多角形，胞周有许多绒毛突起，体积较大，细胞之间界限清晰，细胞膜完整，细胞膜上的微绒毛较多，胞浆电子浓度较高，细胞内线粒体的数量较少，线粒体嵴清楚，内质网欠丰富，细胞核位于细胞的中央或偏于一侧，边界清楚，胞核形态丰富，有分叶状，椭圆形，内有电子浓度较高的核仁，见图2。

2.2 退变髓核细胞微载体培养细胞形态

光镜下：退变髓核细胞立体培养时，在光镜下微载体为基本规则的球形，表面粗糙不平，半透明。能够看到在微载体表面呈现梭形或不规则形状的细胞光影，不同的聚焦层面能够显示不同的细胞影，见图3A。

电镜下：扫描电镜下观察微载体退变髓核细胞培养，可见微载体呈规则球形，不同浓度的髓核细胞贴壁生长在微载体的表面，细胞多呈不规则形或梭形，与单层培养的扁平状生长不同，细胞呈立体状生长，狭长分布，伪足清晰，见图3B。

2.3 退变髓核细胞两种方法培养的活性 见表1。两种培养方式的细胞处于稳定生长期时，细胞增殖活性没有明显区别，而处于对数生长期时，微载体培养的细胞生长活性明显高于单层培养组的细胞(P < 0.01)，说明微载体培养对对数生长期的髓核细胞的细胞增殖活性具有明显的刺激作用。

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2005年9月至2009年5月在山东省创伤骨科研究所(山东省重点实验室)及山东大学附属济南市中心医院完成。
材料：髓核组织取自2005年9月至2009年5月在青岛大学医学院附属医院及山东大学附属济南市中心医院因椎间盘疾患施行手术的患者28例34个髓核组织(n=34)。其中男17例21个椎间盘，女11例13个椎间盘；年龄20-71岁，年龄中位数43.7岁。取自腰椎间盘组织26个；颈椎间盘组织6个；下胸椎间盘组织2个。患者对治疗均知情同意，自愿提供髓核组织。
切除椎间盘组织进行椎间盘退行性变程度Thompson评^分[7]：Ⅱ级6个，Ⅲ级15个，Ⅳ级13个。
主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
髓核细胞单层培养：手术切除椎间盘组织显微镜下分离髓核组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块。依次37 ℃下，2.5 g/L的胰蛋白酶消化20 min，2 g/L的胶原酶静置消化4 h，用HAM F-12+体积分数10%胎牛血清培养液冲洗。按10⁷L^-1细胞浓度接种于底面积为 25 cm2培养瓶中，加足含青霉素100 U/mL、链霉素 100 U/mL的HAM F-12/DMEM +体积分数10%胎牛血清培养液。在37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养。每两三天换液，定期倒置相差显微镜及透射电镜观察，Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线，明确稳定生长期和对数生长期。
髓核细胞微载体培养：称取20.4 g/L的微载体颗粒，5%的硅油中预湿。微载体灭菌后放入旋转培养瓶，加入含青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的HAM F-12/DMEM+体积分数10%胎牛血清培养液100 mL，旋转培养瓶置于慢速磁力搅拌器上，以10 r/min的速度在37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中预培养24 h。将单层培养的原代退变髓核细胞(浓度为10⁷ L^-1)接种于静止旋转培养瓶中，接种后48 h开始慢速(10 r/min)旋转培养72 h后，将旋转培养速度调整至正常(30 r/min)。每3- 5 d半量换液，定期倒置相差显微镜观察，Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线。
单层培养退变髓核细胞苏木精-伊红染色：细胞爬片成功后，放入40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗3遍3-5 min，0.1%Triton X-100溶液透化细胞15 min，苏木精溶液覆盖细胞染色5 min，盐酸乙醇分化10 s，伊红复染2 min，脱水、透明、封固，镜下观察。
微载体培养退变髓核细胞苏木精-伊红染色：取1 mL含微载体培养液，2.5 g/L的胰蛋白酶消化，过滤获取细胞悬液，加入离心涂片机的加样孔，JY LTP-A离心涂片机涂片15 min，40 g/L多聚甲醛固定10 min，依步骤苏木精-伊红染色，封固，镜下观察。
透射电镜观察：细胞10 g/L锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水，3∶1的环氧树脂3 h，1∶1的环氧树脂过夜。将细胞放入胶囊内加纯Epon 812，放入37 ℃恒温箱内24 h， 60 ℃恒温箱内48 h。先行醋酸铀滴注染色30 min。再用硝酸铅滴注染色30 min，自然晾干。透射电镜观察、拍照。
扫描电镜观察：从旋转培养瓶中取含微载体颗粒的培养液10 mL，微载体颗粒约100粒，放入细胞培养瓶中。固定于25 g/L戊二醛中4 h，PBS冲洗后，再置入10 g/L锇酸固定30 min。丙酮梯度乙醇脱水各10 min。乙酸异戊酯置换4 h以上。用Giko DX-1 CO₂临界干燥器干燥后。Giko IB-3真空离子喷金镀膜仪喷溅金离子。JSM-840扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。
MTT比色法检测细胞生长活性：取稳定生长期及对数生长期的细胞，制备单细胞悬液。以每孔10³-10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔200 μL。37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中细胞培养3-5 d。每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，中止培养，吸取培养上清夜，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
主要观察指标：①退变髓核细胞两种方法培养的细胞形态。②退变髓核细胞两种方法培养的活性。
统计学分析：所得的数据应用SPSS V11.0软件进行处理，使用Dunnet t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

讨论

由于组织工程细胞培养需要高浓度的种子细胞接种，自体组织细胞存在数量少及长期传代后细胞功能老化的问题，故种子细胞的获取和体外培养是组织工程的重要研究内容之一^[8]。髓核细胞的退变在椎间盘组织退变中起了关键性作用^[9]，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心问题。

3.1 退变髓核细胞的培养方式 当前软骨的组织工程学进行了广泛深入的研究^[10-11]，现在常用以下3种软骨种子细胞扩增方式：①二维单层培养添加生长因子。 ②细胞贴附微载体在旋转式生物反应器(RCSS)中扩增。③细胞贴附微载体在搅拌式生物反应器中扩增^[12]。二维单层培养因共识的局限性较少学者采用，而RCSS扩增细胞有一些问题，如实验体系操作较复杂，受反应器转速，微载体数量，接种细胞数量许多因素的影响。刘勇等^[13]研究发现，髓核细胞中大部为类软骨细胞，所以作者尝试采用细胞贴附微载体在旋转式生物反应器中进行扩增，试图解决髓核种子细胞体外培养的问题。

旋转式生物反应器中的共轴氧合器提供充分氧合，确保细胞培养中的培养液养分以及氧浓度的均匀分布，其高效物质交换能力为高浓度细胞培养提供良好的培养环境。而且液体与固体微粒的同步移动使其受到的剪切力很小^[14]，有利于细胞保持其自然的形态及表型，既适用于悬浮细胞的培养，也可用于贴壁细胞的培养^[15]。贴壁细胞可采用微载体技术，由于微载体所具备的极大的比表面积，因此在很小的空间就能扩增大量的细胞，其浓度可达10¹⁰L^-1[16]。与传统的单层培养模式相比，微载体培养系统优势显著：具有较高表面比，兼有单层培养和悬浮培养的特点，且是均相培养；细胞所处环境均一且环境条件可测量监控；进而降低了污染发生的概率^[17]。

本组实验细胞中的标本均取自椎间盘突出症的手术患者，患者病史均较长，并对切除的间盘组织进行Thompson分级，结果示均为退变的椎间盘标本。实验对退变的髓核细胞进行了成功的微载体培养，通过观察细胞形态及超微结构，证实为髓核细胞，且发现微载体培养的退变髓核细胞较单层培养细胞活性增加明显。

研究证明，退变的髓核细胞丢失了软骨细胞表型并改变为成纤维细胞^[18]，是以合成和分泌软骨细胞基质能力下降或消失为标志。而微载体培养系统除增殖细胞外，还能推动原始组织细胞表型的维持。此前的研究显示，与传统的单层培养相比，微载体培养技术对软骨细胞的表型维持以及其细胞外基质的分泌等方面具有较大优势。Schrobback等^[19]通过对人关节软骨细胞进行体外凝胶-微载体培养，并研究其细胞增殖、细胞外基质合成、细胞的稳定性以及表型等方面，发现凝胶-微载体技术能够在大量扩增软骨细胞的同时维持其原有的细胞特性。Surrao等^[20]应用软骨细胞单层培养及Cytodex 3微载体三维培养，并比较其细胞增殖能力及软骨基质合成能力。结果显示，软骨细胞的单层培养在1周内丢失其原有表型，而微载体培养则能维持其表型达3周后。

本课题组发现微载体培养后的髓核细胞也能维持其软骨特性^[21]，尽管其机制尚不明确，但这些发现清楚地揭示了椎间盘组织工程学中微载体培养技术的潜力，这可能与易化细胞间联系的生物机械因素有关，并可再生出其原有的三维结构。微载体材料的组分和生物机械活化环境间的结合可能提供了刺激增生和基因型表达的分子机制^[22]。综上作者认为微载体旋转三维培养能够扩大培养面积，并能够保持退变髓核细胞的表型，是椎间盘组织工程中的理想培养方式。

3.2 微载体培养方式的特点 本实验室应用NUNC公司的Biosilon微载体，并应用低速搅拌旋转培养系统成功培养了退变的髓核细胞。针对髓核细胞的培养，Biosilon微载体尤其特点：①微载体为半透明，表面无孔，折光率近于玻璃，显微镜下为周边无暗影的全相，能够直接应用相差显微镜观察。②不摄取培养基中营养成分，特别是不吸附血清，能很好的收获特殊代谢产物。③甩微珠-微珠间的细胞转移，不用酶消传代，保证了细胞的活性[23]。但是也有不尽如人意之处，实验相应进行技术处理，使得退变髓核细胞成功培养，如Biosilon微载体不带电荷，细胞贴壁慢，进行有血清的培养基预培养微载体，且在24-48 h不搅拌，而半速搅拌，而后才是常规培养搅拌速度；存在流体力学剪切力，微载体是刚性结构，在搅拌情况下，微珠间碰撞，机械力损害细胞。在控制低速旋转的同时，也同样利用这种“恶劣”内环境，提高培养成活细胞的抗负荷的能力。细胞的活性会受到诸多因素的影响和限制，主要包括微载体的材料、单位体积微载体极限浓度、种子细胞对剪切力的敏感性、细胞达到高浓度后的营养供给、代谢产物的堆积等，严重影响髓核细胞高活性和高浓度的维持[24]。这将是下一步研究所要解决的问题。

3.3 展望 体外培养中微载体培养髓核细胞提供了软骨细胞及其前体细胞的生物学特性，微载体技术还为损伤或退化椎间盘组织的修复或再生提供了数量足够、表型特异的细胞。由该领域研究成果可知，微载体技术用于临床疾患的治疗，尤其是退行性疾病治疗为时不远^[25]。特异性生长因子或细胞外基质蛋白可促进其种子细胞进一步的增殖和分化，且微载体可作为生物反应因子传递系统和细胞增殖分化支架两重作用^[26]。

展望未来，髓核细胞微载体旋转培养系统大规模培养技术发展的方向是：①适合髓核细胞生长、吸附容易并能重复使用的新型材料微载体。②精确可控的营养供给、代谢产物排出、剪切力小、混合性能好的新型髓核细胞培养系统。③将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域，构建规模化大型生物反应器，提高细胞大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。

基金资助：国家自然科学基金项目(30672132)。
作者贡献：实验设计为通讯作者和第六位作者，手术间盘组织取出为第三、五作者，部分手术组织取出，大部体外基础实验，部分数据统计为第一作者，部分体外基础实验及部分统计学分析为第二、四作者。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：参与实验的患病个体对实验过程完全知情同意，自愿提供髓核组织。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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