原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1174-1179.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.007

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原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

杜启翠¹，肖文林²，孙桂兰²，马秀兴¹，姚如永³

1青岛大学医学院，山东省青岛市 266000
2青岛大学医学院附属医院口腔科，山东省青岛市 266000
3青岛大学医学院附属医院中心实验室，山东省青岛市 266000

收稿日期:2012-07-25 修回日期:2012-09-15 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 肖文林，博士，副主任医师，副教授，青岛大学医学院附属医院口腔科，山东省青岛市 266000 daybreaker@163.com
作者简介:杜启翠★，女，1985年生，山东省莒县人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事口腔修复学研究。 duqicui@126.com

Primary culture of human hypertrophic scar fibroblasts and its biological behavior

Du Qi-cui¹, Xiao Wen-lin², Sun Gui-lan², Ma Xiu-xing¹, Yao Ru-yon^g3

1 Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China
2 Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China
3 Central Laboratory, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Received:2012-07-25 Revised:2012-09-15 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Xiao Wen-lin, Doctor, Associate professor, Associate chief physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China daybreaker@163.com
About author:Du Qi-cui★, Studying for master’s degree, Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China duqicui@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的，但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。
目的：建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。
方法：采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养，使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃，体积分数5%CO2，饱和湿度下培养，分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。
结果与结论：组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功，20-40 d可传第1代，以后每7-10 d可传1代，细胞为长梭形，波形蛋白表达阳性；消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功，15-20 d细胞可融合成片，细胞为长梭形，波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。

关键词: 组织构建, 皮肤组织构建, 人增生性瘢痕, 成纤维细胞, 原代培养, 细胞培养, 贴壁法, 消化法, 波形蛋白, 生物学行为, 细胞分裂, 分裂指数, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Hypertrophic scar is inevitable in the process of wound healing, but the hypertrophic scar tissue can result in many adverse effects.
OBJECTIVE: To establish a reliable method to culture human hypertrophic scar fibroblasts in vitro.
METHODS: Human hypertrophic scar fibroblasts were cultured primarily in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum using tissue adherent method and digestion method. Fibroblasts were incubated at 37℃in a humidified atmosphere of 5% carbon dioxide. Cellular morphologies were observed, the growth curve was drawn, and vimentin expression wass detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After cultured with tissue adherent method, human hypertrophic scar fibroblasts were cultured successfully, first passaged within 20-40 days and then continued to passage every 7-10 days. The cells were long spindle-shaped, and vimentin was positive. (2) Human hypertrophic scar fibroblasts, cultured using digestion method, were cultured successfully and confluent at 15-20 days. The cells were long spindle-shaped, and vimentin was positive. These data have confirmed that both tissue adherent method and digestion method are successful in the primary culture of human hypertrophic scar fibroblasts.

Key words: tissue construction, skin tissue construction, human hypertrophic scar, fibroblasts, primary culture, cell culture, adherent method, digestion, vimentin, biological behavior, cell division, mitotic index, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

杜启翠，肖文林，孙桂兰，马秀兴，姚如永. 原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1174-1179.

Du Qi-cui, Xiao Wen-lin, Sun Gui-lan, Ma Xiu-xing, Yao Ru-yong. Primary culture of human hypertrophic scar fibroblasts and its biological behavior[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1174-1179.

图/表（结果） 11

2.1 增生性瘢痕成纤维细胞生长情况及生长曲线 见表1，图1。

26例增生性瘢痕组织中有17例长出了瘢痕成纤维细胞。组织贴壁法培养有9例长出了瘢痕成纤维细胞，从接种到长出细胞需要的时间在5-12 d，形成单细胞的时间在38-50 d；消化法培养有8例长出了瘢痕成纤维细胞，从接种到形成单细胞的时间在21-30 d。

2.2 增生性瘢痕成纤维细胞分裂指数的测定结果 见表2，图2。原代培养细胞的分裂指数与细胞的生长曲线是相对应的，细胞原代培养也要经历调整期，对数期，稳定期，衰亡期4个过程，细胞分裂指数正好显示原代培养细胞的生长过程。

2.3 细胞形态学观察及鉴定

光镜下观察：组织贴壁法细胞的生长过程：组织块贴壁5 d后可见组织块周围有少量的细胞爬出，见图3； 10 d后有少量细胞呈梭形或不规则的三角形，见图4；培养到20 d后，大量细胞围组织块呈放射性生长，细胞密度可达30%-50%，并可见个别细胞伸出两三个细胞突起，见图5；培养到28-40 d细胞密度可达80%-90%，见图6，此时可进行细胞的传代或冻存。

相差倒置显微镜下观察：可见细胞体多呈长梭形、扁平星形，部分呈三角形，胞质向外伸出两三个长短不同的突起，原代中的细胞有许多没有伸展的圆形细胞。细胞在生长旺盛时代谢物较多，在相差倒置显微镜下细胞排列成簇，细胞生长时多呈放射状，编织状或旋涡状排列。见图7。

免疫荧光检测波形蛋白显示，成纤维细胞内有棕黄颗粒或胞质着绿色，胞核不着色。见图8和图9。

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2011年9月至2012年2月在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。
材料：
病理标本来源：标本为创伤愈合后6-24个月的唇裂手术后的增生性瘢痕组织，由青岛大学医学院附属医院提供；26例中男12例，女14例；年龄分布在6-38岁；所有的患者在术前3个月内没有服用过任何激素药物、未做过特殊治疗、无乙肝病毒感染，取材部位无破溃。标本
采集均经患者同意和伦理委员会批准。
人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养及其生物学行为实验需用的主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments used in the experiment of primary culture of human hypertrophic scar fibroblasts and its biological behavior:

实验方法：
增生性瘢痕成纤维细胞原代培养：26例增生性瘢痕组织标本，分别采用组织贴壁法和消化法
进行瘢痕成纤维细胞原代培养。
组织贴壁法：在手术台上取得标本，将组织块放入含有1%双抗的PBS(pH=7.4，含Mg²⁺不含Ca²⁺)中，冰上放置，转移到培养室。眼科剪去除标本的皮下组织，用含有1%双抗的PBS冲洗。再用眼科剪将组织块剪成0.5-1.0 mm³的碎块，用镊子或吸管将碎块接种于干净的培养瓶或培养皿中(培养瓶预先用多聚赖氨酸处理)，组织块间隔在0.3-0.5 mm，置于培养箱中培养2-4 h，待组织贴壁后，小心加入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，使培养基刚好没过组织块，置于培养箱中培养，第2天进行观察。5 d后第1次换液，以后每5 d换液1次。待培养的细胞基本融合，密度达80%，吸除培养液和组织块，用含1%双抗的PBS冲洗3次后加入含0.25%加EDTA的胰蛋白酶消化1-3 min，显微镜下观察细胞回缩、细胞间隙增大时，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，吸管轻轻吹打使细胞呈悬液，按1∶2比例分瓶传代,第2-4代可用于实验[5]。
消化法：按上述方法获得瘢痕组织，将组织块放入含1%双抗的PBS中，冰上放置，转移到培养室。将冲洗干净的组织块加入0.25 g/L Dispase Ⅱ 4 ℃过夜，第2天用眼科剪将组织块剪成0.5-1.0 mm³的碎块，加入3倍体积的200 U/mL collagenaseⅠ，置于37 ℃，体积分数CO₂浓度为5%，饱和湿度的培养箱中培养2 h，用1 mL枪头轻轻吹打组织块使其成单细胞悬液，1 000 r/min (200×g)离心5 min，弃上清。将获得的细胞加入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基的培养瓶中。置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。7 d后第1次换液，以后每3 d换液1次。待培养的细胞基本融合成片，密度达80%，吸除培养液，用含1%双抗的PBS冲洗3次后加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化1-3 min，显微镜下观察细胞回缩、细胞间隙增大时，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1∶2比例分瓶传代，第2-4代可用于实验^[6]。
MTT测定细胞的增殖能力：取对数期的瘢痕成纤维细胞消化稀释，计数板计数，接种于96孔板，每孔贴壁细胞达到(5-10)×10⁶ L^-1。取6个孔为调零孔，加入培养液+MTT+DMSO。每组设5个重孔每隔一天将5 g/L MTT 20 μL在避光下加入待测孔，37 ℃温箱孵育4 h，将待测孔内液体吸除加入0.1%DMSO 150 μL，震荡10 min，参考波长选490 nm下测定吸光度(A)值，连续测试7 d，测定细胞的增殖能力。
分裂指数的测定：将细胞悬液接种到内含盖玻片的6孔培养板内。放CO₂培养箱中培养48 h，使细胞爬满盖玻片。每隔24 h取出一块盖玻片，按一般顺序操作用体积分数95%乙醇固定，Giemsa液染色、封固。光镜下取细胞数多、中、少3个区域各一区，共计1 000个细胞，计算出每1 000个细胞的分裂相平均值和所占百分比，将测得的百分数按顺序绘制成细胞分裂指数曲线图。
细胞形态学观察：相差倒置显微镜下观察细胞形态：原代细胞消化后培养48 h时后，相差倒置显微镜下定期观察细胞，记录照相。
细胞鉴定：收集第3代的瘢痕成纤维细胞以2×10⁸ L^-1细胞浓度接种于24孔板，置于培养箱中培养，待细胞爬片满玻片60%-80%时，吸除培养液，PBS冲洗3遍，每遍5 min，40 g/L多聚甲醛固定，室温下30 min，PBS冲洗3遍，每遍5 min，0.3%Triton-100通透10 min，PBS冲洗3遍，每遍5 min，加体积分数10%山羊血清固定， 37 ℃温箱20 min，吸除封闭液，勿洗，加兔抗人波形蛋白一抗，4 ℃冰箱过夜(14-16 h)；再用PBS冲洗3遍，每遍5 min，加羊抗兔带荧光的二抗，37 ℃温箱，避光60 min，PBS冲洗3遍，每遍5min，荧光显微镜下观察，488 nm蓝光下观察细胞内波形蛋白染色情况。
主要观察指标：①增生性瘢痕成纤维细胞生长情况及生长曲线。②增生性瘢痕成纤维细胞分裂指数的测定结果。③细胞形态学观察及鉴定。

讨论

1959年Conway等^[7]成功培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，开始了体外研究病理性瘢痕的新阶段。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕，增生性瘢痕可随时间推移而逐渐自行变软变平，且局限于原病变范围内；而瘢痕疙瘩生长行为独特，表现为超过原伤口界限，呈“蟹足样”浸润性生长，无自限性，且手术切除后复发率极高，有“良性真皮肿瘤”之称。增生性瘢痕虽然不是恶性肿瘤，但是其成纤维细胞表现出过度增殖，凋亡减少和非典型性分化。

实验用两种不同的原代细胞培养方法，即消化法和组织贴壁均成功培养出了唇裂部增生性瘢痕成纤维细胞，表明传统皮肤成纤维细胞的培养方法也适用于唇裂部瘢痕组织的成纤维细胞的培养。消化法培养瘢痕成纤维细胞比组织贴壁法培养出细胞所需要的时间短，其可能机制为：前者把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养及排除代谢产物，较快地长成单层，短时间内获取大量细胞。但是消化法的细胞培养步骤比较繁琐，污染的概率较组织贴壁法高。瘢痕组织相对于其他的组织来说较坚硬，消化法培养增生性瘢痕成纤维细胞相对来说消化的时间长一些，组织贴壁法培养瘢痕成纤维细胞细胞从组织块里爬出的时间也相对较长一些。

原代培养的细胞可能会掺杂其他类型的细胞，这就需要细胞的鉴定和识别。瘢痕成纤维细胞是正常的皮肤成纤维细胞因表达某一种机制转化形成，所以也是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的。波形蛋白就存在于间充质细胞中，是鉴定成纤维细胞的一个很好的指标。成纤维细胞的结构蛋白波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白，也不同于肌细胞的桥连蛋白，成为成纤维细胞鉴定的特异性标志^[8]。实验经过波形蛋白免疫荧光的鉴定，确定培养出的细胞为成纤维细胞。

MTT四唑蓝是一种能接受氢原子的黄色染料，可作用于活细胞线粒体的呼吸链，被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的深紫色结晶状产物甲臜，MTT法检测的是活细胞的数量及其增殖能力，死细胞不发生反应，可观察到细胞生长活力和增殖数量，A值高，表明活细胞数量高，细胞增殖能力强。生长曲线显示增生性瘢痕成纤维细胞在体外扩增速度较快，拥有较快的分化潜能，可以作为靶细胞进行体外研究。

分子和细胞机制均引起瘢痕组织形成，但其具体机制尚不十分清楚，在伤口愈合过程中只能选择一些不充分的治疗方法，所以增生性瘢痕引起的挛缩和功能障碍发生率较高^{[2, 9]}。瘢痕的形成仍然是外科手术面临的主要问题^[10]。研究皮肤纤维化最大的障碍是缺乏动物模型和可信任的人类病理样本^[11-12]。因为这样的标本代表最终瘢痕形成的过程,还可以排查瘢痕形成过程中最初的影响因素。既往研究表明，增生性瘢痕表现为过量形成胶原纤维束包括高密度的内皮细胞，成纤维细胞和肌成纤维细胞^[13]。其中，成纤维细胞又被认为是病理性瘢痕形成的关键效应细胞，其功能状态是影响病理性瘢痕发生、发展及转归的主要因素^[14]。在不留瘢痕或可再生的治疗中成纤维细胞是静止的，有限的增殖和最少的细胞外基质，以保持足够的组织力量。然而成纤维细胞活性增加则使细胞过度增殖，细胞外基质过度沉淀，并且抑制纤维化胶原蛋白的重塑，最终导致增生性瘢痕的形成。模拟体外培养细胞的环境和体内环境相似，细胞的行为和基本规律也与体内基本一致，所以快速而高效地培养出唇裂部增生性瘢痕成纤维细胞，为体外研究唇裂瘢痕提供良好的平台，对从细胞水平上阐明唇裂瘢痕的形成机制及增生性瘢痕的防治具有重要意义。

致谢：青岛医学院附属医院口腔颌面外科学提供组织来源，青岛医学院附属医院中心实验室为本实验提供实验室以及实验器材，特此致谢。
作者贡献：第二、三作者进行实验设计，实验实施为第一、四、五作者，实验评估为第二作者，第一作者成文，第二作者审校并对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：已与患者签署组织标本临床研究使用知情同意书，且经过青岛大学医学院附属医院医学伦理学委员会批准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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